Questo protocollo descrive ricostruzioni su larga scala di popolazioni neuronali selettivi, etichettati dopo l'infezione retrograda con esprimendo un virus della rabbia modificato marcatori fluorescenti, e le analisi di cluster indipendente, imparziale che consentono la caratterizzazione completa delle metriche morfologiche tra sottoclassi neuronali distinti.
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Articolo metodologico
Ricostruzioni su larga scala e indipendente, imparziale Clustering Sulla base morfologici metrica per classificare i neuroni in selettivi Popolazioni
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo protocollo delinea le ricostruzioni su larga scala di neuroni in combinazione con l'uso di cluster indipendente e imparziale analisi per creare un'indagine completa delle caratteristiche morfologiche osservate in una popolazione neuronale selettiva. La combinazione di queste tecniche costituisce un nuovo approccio per la raccolta e l'analisi dei dati neuroanatomici. Insieme, queste tecniche consentono di larga scala, e quindi più completo, il campionamento delle popolazioni neuronali selettivi e stabilire metodi quantitativi per la descrizione imparziali classi neuronali morfologicamente unici all'interno di una popolazione.
Il protocollo descrive l'uso di virus della rabbia modificato per etichettare selettivamente i neuroni. G-cancellato atti virus della rabbia come tracciante retrogrado seguenti iniezione stereotassica in una struttura di destinazione cerebrale di interesse e serve come veicolo per l'erogazione e l'espressione di EGFP in neuroni. Un gran numero di neuroni sono infettate con questotecnica e di esprimere la GFP per tutta la loro dendriti, la produzione di "Golgi-like" riempimenti completi dei singoli neuroni. Di conseguenza, il metodo di analisi retrograda virus-mediata migliora le tecniche di tracciamento retrogrado tradizionali a base di coloranti con la produzione di riempimenti intracellulari completi.
I singoli neuroni ben isolate che abbracciano tutte le regioni della zona del cervello in fase di studio sono selezionati per la ricostruzione al fine di ottenere un campione rappresentativo di neuroni. Il protocollo delinea le procedure per ricostruire corpi cellulari e completare i modelli arborizzazione dendritiche di neuroni marcati che abbracciano molteplici sezioni di tessuto. dati morfologici, comprese le posizioni di ogni neurone all'interno della struttura del cervello, vengono estratti per ulteriori analisi. funzioni di programmazione standard sono stati utilizzati per eseguire gruppo indipendente analisi e valutazioni cluster basato su metriche morfologiche. Per verificare l'utilità di queste analisi, valutazione statistica di un perfo cluster analysisconfermate su 160 neuroni ricostruite nel nucleo reticolare del talamo del talamo (TRN) del macaco è stato fatto. Sia la cluster analysis originale e le valutazioni statistiche svolte qui indicano che i neuroni TRN sono separati in tre sottopopolazioni, ognuno con caratteristiche morfologiche uniche.
Introduzione
Neuroanatomy è uno dei fondamenti delle neuroscienze 1 e recente interesse "connectomics" ha rinnovato entusiasmo per la comprensione della diversità morfologica delle popolazioni neuronali e le connessioni tra i neuroni specifici 2. Metodi per l'etichettatura e neuroni ricostruendo hanno notevolmente migliorato con le recenti innovazioni, tra cui genetica e virus-mediata circuito di tracciamento approcci 3, 4, consentendo studi morfologici più complete delle popolazioni neuronali 5. Oltre a miglioramenti nella etichettatura singoli n....
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Protocollo
Nota: Il tessuto esaminato in questo studio è stato preparato come parte di uno studio separato 5. Pertanto, tutti i metodi sperimentali che prevedono l'uso di animali sono stati descritti in dettaglio nella sezione Metodi sperimentali di Briggs et al. (2016). Tutte le procedure che coinvolgono gli animali condotti come parte dello studio preliminare sono stati approvati dai comitati cura degli animali e uso istituzionale. sono descritti brevemente di seguito nelle sezioni 1 La procedura per l'iniezione del virus nel dLGN e l'elaborazione istologica del tessuto cerebrale - 2.
1. Stereotassica Ini....
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Risultati
Abbiamo dimostrato in precedenza che le ricostruzioni su larga scala di neuroni all'interno di una popolazione selettivo sta seguendo iniezione fattibile del virus della rabbia modificato nel dLGN 5. Recentemente, lo stesso tessuto è stato utilizzato per ricostruire 160 neuroni nel settore visivo del TRN (Bragg et al, in revisione;. Figure 2A-B) seguendo le fasi metodologiche dettagliate qui sopra descritti. Nello studio TRN, tre gruppi u.......
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Discussione
studi neuroanatomici sono rimasti un pilastro di neuroscienze e recente interesse connectomics e le relazioni struttura-funzione ha rinnovato entusiasmo per la caratterizzazione morfologica dettagliata delle popolazioni di neuroni selettivi. Tradizionalmente, gli studi neuroanatomici hanno fatto affidamento su classificazioni qualitative di neuroni in classi morfologicamente distinte di neuroni definiti da neuroanatomisti esperti. Con i progressi nelle tecniche per la ricostruzione neuroni e l'estrazione dei dati mo.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare il Dott. Ed Callaway e Marty Usrey per averci permesso di utilizzare il tessuto preparato come parte di uno studio preliminare e Libby Fairless e Shiyuan Liu per un aiuto con ricostruzioni neuronali. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH (NEI: EY018683) e la Fondazione Whitehall.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| SADΔ G-EGFP | E.M. Callaway Laboratory, Salk Institute | Preparato dal Dr. F. Osakada. Virus della rabbia G-deleted disponibile tramite il Salk Institute Nucleo virale | |
| Elettrodo di registrazione: platino/iridio o tungsteno | FHC | UEPSGGSE1N2M | Visita il sito web (www.fh-co.com) per le specifiche dell'ordine alternativo |
| Nanoject II | Drummod Scientific | 3-000-204, 110V | Alternative: picospritzer, siringa Hamilton |
| Microtomo di congelamento | Thermo Scientific | ||
| DAB | Sigma Aldrich | D5905-50TAB | 3,3'-Diaminobenzidina tetracloridrato, compressa, substrato da 10 mg per compressa. Attenzione: cancerogeno - deve essere sbiancato prima di scartare |
| Cytochrome C | Sigma Aldrich | C2037-100MG | |
| Catalase | Sigma-Aldich | C9322-5G | |
| Rabbit anti-GFP | Life Technologies/Thermo Fisher | #A-11122 | Anticorpi primari |
| Laboratori vettoriali | anti-coniglio di capra biotinilata | #BA-1000 | Sistema |
| Neurolucida anticorpale | Software MicroBrightField | per il tracciamento e l'analisi dei neuroni. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida | |
| Neurolucida Explorer | Software di esportazione dati | MicroBrightField | |
| Telecamera Microfire | Optronics | 2-Megapixel fotocamera per microscopio a colori reali. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf | |
| Nikon E800 Microscopio | Nikon Instruments Inc. | Microscopio per ricerca biologica. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html | |
| Matlab | The MathWorks Inc. | Software di matematica computazionale basato su matrici. http://www.mathworks.com | |
| Microsoft Office Excel | Programma per fogli di calcolo | Microsoft |
Riferimenti
- Cajal, S. R. y Histologie du systeme nerveaux de l'homme et des vertebres. , Maloine. (1911).
- Seung, H. S. Toward functional connectomics. Nature. 471, 170-172 (2011).
- Callaway, E. M. Transneuronal circuit tracing with neurotropi....
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Ristampe e permessi
