Presentiamo tre protocolli nuovi e più efficienti per la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte umane in cardiomiociti, cellule endoteliali e cellule muscolari lisce e un metodo di consegna che migliora l'attecchimento delle cellule trapiantate, combinando l'iniezione di cellule con la consegna citochine patch-mediata.
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Articolo metodologico
Pluripotenti cellule staminali derivate cellule cardiache per la riparazione del miocardio
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule staminali umane pluripotenti indotte (hiPSCs) devono essere completamente in tipi cellulari specifici prima della somministrazione, ma i protocolli convenzionali per differenziare hiPSCs in cardiomiociti (hiPSC-CMS), cellule endoteliali (hiPSC-ECS), e cellule muscolari lisce (SMC) sono spesso limitata dalla bassa resa, la purezza, e / o di scarsa stabilità fenotipica. Qui, presentiamo protocolli innovativi per generare hiPSC-CM, -ECs e -SMCs sostanzialmente più efficiente rispetto ai metodi convenzionali, come pure un metodo per combinare iniezione di cellule con una patch citochina contenente creato sul sito di somministrazione. La patch migliora sia la conservazione delle cellule iniettate, sigillando la traccia dell'ago per evitare che le cellule vengano spremuto fuori del miocardio, e la sopravvivenza cellulare, rilasciando fattore di crescita insulino-simile (IGF) per un periodo prolungato. In un modello suino di infarto del danno da ischemia-riperfusione, il tasso di attecchimento è stato più di due volte maggiore quando lacellule sono state somministrate con la patch citochina contenente confronto alle cellule senza patch, e il trattamento con entrambe le celle e la patch, ma non solo con le cellule, è stato associato a miglioramenti significativi nella funzione cardiaca e dimensioni dell'infarto.
Introduzione
cellule staminali pluripotenti umane indotta (hiPSCs) sono tra gli agenti più promettenti per la terapia cellulare rigenerativa perché possono essere differenziati in una gamma potenzialmente illimitato e quantità di cellule che non sono rifiutato dal sistema immunitario del paziente. Tuttavia, la loro capacità di auto-replicazione e differenziazione può anche portare alla formazione di tumori e, di conseguenza, hiPSCs bisogno di essere completamente differenziate in tipi cellulari specifici, come i cardiomiociti (CMS), cellule endoteliali (ECS), e le cellule muscolari lisce (SMC ), prima della somministrazione. Uno dei metodi più semplici e più comuni di somministra....
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Protocollo
Tutte le procedure sperimentali sono eseguite in conformità con le linee guida animali della University of Alabama a Birmingham.
1. Differenziazione hiPSCs in hiPSC-CMS
- Cappotto dei pozzetti di una piastra da 6 pozzetti con pre-raffreddata fattore di crescita ridotto miscela proteica gelatinosa a 4 ° C per tutta la notte. Aspirare miscela proteica gelatinosa prima dell'uso. Seed i hiPSCs sulle piastre pre-verniciato, e la cultura nelle cellule (1 x 10 5 cellule per pozzetto) al 5% di CO 2 e 37 ° C in mTeSR1 supplemento mezzo con inibitore ROCK 10 micron.
- Aggiornare la media giornaliera fino a....
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Risultati
Caratterizzazione di differenziata hiPSC-CM, -ECs, e -SMCs
La capacità differenziale hiPSCs stati valutati 2, 3, 4. Flusso analizza citometria di T (cTnT) espressione troponina cardiaca suggeriscono che la purezza della popolazione finale hiPSC-CM può superare il 90% (Figura 1A, 1B, pannello B1). Quasi t.......
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Discussione
Migliorata la resa / purezza di hiPSC-CMS
protocolli convenzionali per differenziare le cellule staminali umane in CM sono spesso limitati da una bassa resa e la purezza; per esempio, solo 35-66% di hESC-CM ottenuto tramite Percoll separazione e la formazione del corpo cardiaco espresso lento catena pesante della miosina o cTnT 6. La purezza delle popolazioni hiPSC-CM differenziate può essere sostanzialmente aumentata selezionando per l'espressione di un gene reporte.......
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Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni del Servizio Sanitario Pubblico degli Stati Uniti NIH RO1s HL67828, HL95077, HL114120 e UO1 HL100407-project 4 (a JZ), da una sovvenzione per lo sviluppo degli scienziati dell'American Heart Association (16SDG30410018) e da un Research Voucher Award dell'Università dell'Alabama presso il Birmingham Center for Clinical and Translational Science (a WZ).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Protocol Sezione 1 | |||
| mTeSR1 medie | Tecnologie delle cellule staminali | 5850 | |
| Matrigel | Corning a ridotto fattore di | lifescience 356231 | |
| Y-27632 | Tecnologie delle cellule staminali | 72304 | |
| Integratore B27, senza siero | Fisher Scientific | 17504044 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Activina A | R& D | 338-AC-010 | |
| BMP-4 | R& D | 314-BP-010 | |
| bFGF | R& D | 232-FA-025 | |
| Collagenasi IV | Fisher Scientific NC0217889 | ||
| Hanks Soluzione salina bilanciata (destrosio, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anidro) | Fisher Scientific | 14175079 | |
| Siero fetale bovino | Fisher Scientific | 10438018 | |
| piastra a 6 pozzetti | Corning Lifescience | 356721 | |
| piastra da 10 cm | Corning Lifescience | 354732 | |
| Incubatore cellulare | Panasonic | MCO-18AC | |
| strong>Protocol Sezione 2 | |||
| Versene | Fisher Scientific | 15040066 | |
| Fibrinogeno | Sigma-Aldrich | F8630-5G | |
| Trombina | Sigma-Aldrich | T7009-1KU | |
| EMB2 medio | Lonza | CC-3156 | |
| VEGF | ProSpec-Tany | CYT-241 | |
| EPO | Life Technologies | PHC9431 | |
| TGF-β | Peprotech | 100-21C | |
| EGM2-MV medio | Lonza | CC-4147 | |
| SB-431542 | Selleckchem | S1067 | |
| CD31 | BD Bioscience | BDB555445 | |
| CD144 | BD Bioscience | 560411 | |
| Centrifuga da 15 ml | Fisher Scientific | 12565269 | |
| Eppendorff Centrifuga | Eppendorf | 5702R | |
| Protocol Sezione 3 | |||
| CHIR99021 | Tecnologie delle cellule staminali | 720542 | |
| PDGF-β | Prospec | CYT-501-10ug | |
| Protocollo Sezione 4 | |||
| Olio d'oliva | Sigma-Aldrich | O1514 | |
| Gelatina | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Etanolo | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Glutaraldeide | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glicina | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| IGF | R& D | 291-G1-01M | |
| Albumina sierica bovina | Fisher Scientific | 15561020 | |
| Piastra riscaldante | Fisher Scientific | SP88850200 | |
| Bagnomaria | Fisher Scientific | 15-462-10Q | |
| Protocol Sezione 5 | |||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| ε-acido aminocaproico | Sigma-Aldrich | A0420000 | |
| MEM medium | Fisher Scientific | 12561-056 | |
| Siringa | Fisher Scientific | 1482748 | |
| Ventilatore per anestesia | Datex-Ohmeda | 47810 | |
| Ventilatore per anestesia | Ohio Medical | V5A | |
| Defibrillatore | Physiol Control | LIFEPAK 15 | |
| 1.5 T MRI | General | Electric Signa Horizon LX | |
| 7 T MRI | Siemens | 10018532 | |
| Gadolinio Mezzo di contrasto (Magnevist) | Berlex | 50419-188-02 | |
| 2-0 sutura di seta | Ethilon | 685H | |
| 3-0 sutura di seta | Ethilon | 622H | |
| sutura monofilamento 3-0 | Ethilon | 627H |
Riferimenti
- Qiao, H., et al. Death and proliferation time course of stem cells transplanted in the myocardium. Mol Imaging Biol. 11 (6), 408-414 (2009).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a por....
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Ristampe e permessi
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