Rilevamento di Copy Number Alterazioni Utilizzando Sequencing Single Cell

Sommario

sequenziamento cella singola è uno strumento sempre più popolare e accessibile per affrontare le modifiche genomiche ad alta risoluzione. Forniamo un protocollo che utilizza un'unica sequenza cella per identificare il numero di copia alterazioni in singole cellule.

Abstract

Riconoscimento di modifiche genomiche a risoluzione singola cella è importante per la caratterizzazione eterogeneità genetica ed evoluzione nei tessuti normali, i tumori, e le popolazioni microbiche. I metodi tradizionali per valutare l'eterogeneità genetica sono stati limitati dalla bassa risoluzione, bassa sensibilità, e / o bassa specificità. sequenziamento cella singola è emerso come un potente strumento per la rilevazione di eterogeneità genetica ad alta risoluzione, alta sensibilità e, opportunamente analizzata, alta specificità. Qui forniamo un protocollo per l'isolamento, tutta l'amplificazione del genoma, sequenziamento e l'analisi di singole cellule. Il nostro approccio consente l'identificazione affidabile di megabase scala varianti numero di copie in singole cellule. Tuttavia, gli aspetti di questo protocollo può essere applicato anche per studiare altri tipi di alterazioni genetiche in cellule singole.

Introduzione

Alterazioni nel numero di copie di DNA possono variare nel formato da diverse paia di basi (numero di copie varianti) (CNV) a interi cromosomi (aneuploidie). Alterazioni del numero di copie che interessano ampie regioni del genoma possono avere notevoli conseguenze fenotipiche alterando l'espressione fino a migliaia di geni ^{1, 2.} CNV che sono presenti in tutte le cellule di una popolazione può essere rilevato mediante sequenziamento rinfusa o metodi microarray basati ^{3, 4.} Tuttavia, le popolazioni possono anche essere geneticamente eterogenea, con CNVs esistenti in un sottogruppo della popolazione o anche singole cellule. Eterogeneità genetica è comune nel cancro, guidando l'evoluzione del tumore, e presenti anche in tessuti normali, con conseguenze sconosciute ^{5, 6, 7, 8, 9 , 10.}

Tradizionalmente, l'eterogeneità genetica è stata valutata sia da approcci citologici o sequenziamento di massa. Approcci citologici, come ibridazione in situ fluorescente (FISH), gli spread cromosomiche, e cariotipo spettrale (SKY), hanno il vantaggio di alterazioni che identificano presenti nelle singole cellule, ma hanno alti tassi di errore a causa di artefatti di ibridazione e la diffusione ^11. Questi approcci sono anche limitati nella loro numero di copie risoluzione di sola rivelando cambia a abbracciano diversi megabasi. Sequencing o microarray di DNA di massa, anche se più elevato in precisione e risoluzione, è meno sensibile. Per rilevare eterogeneità genetica da approcci basati sulla popolazione, le varianti devono essere presenti in una frazione sostanziale di cellule nella popolazione. La comparsa di metodi per amplificare il DNA genomico da singole cellule ha reso possibile sequenziare il genoma di singole cellule. seque cella singolancing presenta i vantaggi di alta risoluzione, alta sensibilità, e, quando si applicano i metodi di controllo della qualità adeguati, elevata precisione ^12.

Qui, si descrive un metodo per la rilevazione megabase scala alterazioni del numero di copie in singole cellule. Noi isolare le cellule singole da microaspirazione, amplificare il DNA genomico usando linker-adattatore PCR, preparare librerie per il sequenziamento di nuova generazione, e rilevare il numero di copie varianti sia da modello nascosto di Markov e segmentazione binario circolare.

Protocollo

1. isolare le cellule singole

1. Preparare il microaspirator
   1. Rimuovere la fine di plastica trasparente dal gruppo del tubo di aspirazione e inserire l'estremità più stretta in una estremità di un 1 piede lungo tubo in PVC con "diametro interno 3/16.
   2. Inserire l'uscita di un filtro a siringa da 0,2 micron nell'altra estremità del 1 piede lungo tubo in PVC con "diametro interno 3/6.
   3. Inserire l'ingresso del filtro a siringa da 0,2 micron in una estremità di un 6 pollici di lunghezza tubo in PVC con "diametro interno 5/16.
   4. Opzionale: Tagliare il tubo da 6 pollici a lungo PVC con "diametro interno 5/16 a metà e inserire un sifone in linea tra le due metà.
   5. Rompere una pipetta da 5 ml in plastica sierologica al 1 ml laurea e inserire l'estremità rotta nell'estremità aperta del tubo in PVC con "diametro interno 5/16.
   6. Inserire l'uscita della pipetta sierologica 5 mL di plastica nella estremità flessibile di un gruppo del tubo aspiratore (dove l'estremità di plastica trasparenteera stato rimosso).
   7. Per la conservazione, coprire il boccaglio rosso del gruppo del tubo di aspirazione con un tubo di plastica sterile.
   8. Disegnare un capillare di vetro ad un diametro interno di 10-30 micron portando la metà del tubo in prossimità di un becco Bunsen e applicando tensione su entrambe le estremità del tubo. Rompere il tubo trafilato in mezzo per creare due potenziali aghi aspiratore. Ripetere questa operazione con diversi tubi in quanto solo alcuni tubi finirà con un diametro interno che è appropriato per la raccolta di singole cellule.
   9. Per lo stoccaggio, posizionare due strisce di plastilina in una capsula di Petri 15 centimetri e fissare gli aghi di aspirazione attraverso le strisce.
2. raccogliere le cellule
   1. Preparare una sospensione singola cella come appropriato per il tipo di cella e sperimentare. Ad esempio, per preparare cellule aderenti, come le linee umani fibroblasti cellule, le cellule di raccolta di cellule tripsinizzazione e trasferirli in un tubo conico contenente adeguato supporto.
   2. Prima, durante, oopo preparazione della sospensione singola cella (a seconda di quanto tempo ci vuole per preparare la sospensione singola cella), impostare il cappuccio per tutta l'amplificazione del genoma.
      1. Spruzzare lungo la superficie del cofano, scatole di punta della pipetta e puntali per pipette con il 10% di candeggina e asciugare con un tovagliolo di carta. Ripetere questa operazione con il 70% di etanolo.
      2. Aggiungere 8 ml di acqua dal kit di amplificazione del genoma intero (WGA) a singoli pozzetti di una piastra di pozzetti 96 PCR, un pozzetto per ogni cella da sequenziare. Coprire il 96 pozzetti PCR con un coperchio da una piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti e posto su ghiaccio.
   3. Aggiungere a 1000 cellule per 10 mL media o tampone fosfato (PBS) in una piastra Petri 15 cm e posizionare il piatto sul ghiaccio per impedire alle cellule di aderire al piatto.
   4. Portare le cellule nella piastra di Petri e pozzetti 96 piastra PCR con coperchio su ghiaccio per un microscopio ottico con obiettivo 10X.
   5. Aumentare l'apertura dell'ago dell'aspiratore picchiettando delicatamente la fine disegnata su the aspiratore ago su una superficie dura in modo tale che la punta si interrompe. Inserire l'estremità larga dell'ago di aspirazione in chiaro fine del microaspirator.
   6. Porre la capsula di Petri contenente cellule sul palco microscopio. Posizionare il boccaglio rossa dell'aspiratore in bocca. Con una mano per spostare l'ago aspiratore e l'altra mano per spostare la piastra di Petri contenente cellule. Identificare singole cellule da sequenziato.
   7. Usare la bocca di aspirazione, disegnare una singola cella nel ago aspiratore con ~ 1-2 ml di supporto o PBS. Trasferire la cella in 8 ml di acqua all'interno di un singolo pozzetto della piastra a 96 pozzetti PCR. Evitare l'introduzione di bolle durante il trasferimento alla cella.
   8. Ripetere il punto 1.2.7 fino a quando è stato isolato il numero desiderato di cellule. Mantenere la piastra PCR su ghiaccio e coperto con coperchio tra cellule raccolta. Segnare i pozzi che hanno ricevuto le cellule.
      1. Mentre la raccolta singole cellule, scongelare il 10X singolo lisi cellulare e buffer di frammentazione da tutta gKit di amplificazione enome. Dopo aver raccolto il numero desiderato di celle, procedere immediatamente a tutto amplificazione del genoma.

2. Whole Genome Amplification

1. Per prevenire la contaminazione durante tutto l'amplificazione del genoma, aggiungere tutti i reagenti all'interno di una cappa di coltura di tessuti, utilizzare puntali per pipette con filtri, e cambiare il puntale tra i pozzi.
2. Preparare una soluzione di lisi e la frammentazione tampone di lavoro dal kit intero genoma di amplificazione (WGA). Per ogni set di fino a 32 celle, unire 32 ml di 10x singola lisi cellulare e buffer di frammentazione e 2 ml di proteinasi K soluzione in una provetta. Agitare la provetta per mescolare le soluzioni.
3. Aggiungere 1 ml di lisi e soluzione tampone frammentazione di lavoro per ciascun bene e pipettare su e giù per mescolare.
4. Coprire la piastra e sigillare tutti i pozzetti con un film plastico. centrifugare brevemente la piastra in un mini piatto filatrice.
5. ciclo termico come follOWS: 50 ° C, 1 h e 99 ° C, 4 min.
6. Raffreddare la piastra su ghiaccio e centrifugare brevemente la piastra in un mini piatto filatrice.
7. Preparare una soluzione tampone di preparazione biblioteca di lavoro da tutto il kit di amplificazione del genoma. Per ogni cella, unire 2 ml di 1x tampone preparazione singola libreria di celle e 1 ml di soluzione di stabilizzazione biblioteca in una provetta. Preparare la soluzione di lavoro per diverse celle nella stessa provetta.
8. Rimuovere la pellicola di plastica e aggiungere 3 ml di soluzione di tampone di preparazione libreria per ogni pozzetto. Pipettare il contenuto del bene su e giù per mescolare. Sostituire la pellicola di plastica.
   NOTA: La pellicola di plastica può essere riutilizzata durante l'intero processo genoma di amplificazione fino pozzetti iniziano a fori nella pellicola. Quando si verifica ciò, passare a un nuovo film di plastica.
9. Brevemente centrifugare la piastra in una mini piatto ogiva e incubare a 95 ° C per 2 min.
10. Raffreddare la piastra su ghiaccio e brevementecentrifugare la piastra in un mini piatto filatrice.
11. Rimuovere la pellicola di plastica, aggiungere 1 ml enzima preparazione libreria per ogni bene, e pipetta il contenuto del bene su e giù per mescolare. Mantenere l'enzima preparazione biblioteca sul ghiaccio o in un blocco freddo in tutta questa fase. Sostituire la pellicola di plastica.
12. Brevemente centrifugare la piastra in mini filatore piastra e ciclo termico come segue: 16 ° C, 20 min, 24 ° C, 20 min, 37 ° C, 20 min, 75 ° C, 5 min, e mantenere a 4 ° C.
13. Raffreddare la piastra su ghiaccio e centrifugare brevemente la piastra in un mini piatto filatrice.
14. Preparare una miscela di amplificazione di lavoro da tutto il kit di amplificazione del genoma. Per ogni cella, unire 48,5 acqua ml, 7.5 ml 10x amplificazione master mix, e 5 ml WGA DNA polimerasi in una provetta. Preparare la miscela di lavoro per diverse celle nella stessa provetta. Mantenere il mix di lavoro sul ghiaccio.
15. Rimuovere la pellicola di plastica, aggiungere 61 ml di lavoro mix di amplificazionead ogni bene, e il contenuto della pipetta di bene su e giù per mescolare. Tenere il mix di amplificazione a lavorare su ghiaccio o in un blocco freddo in tutta questa fase. Sostituire la pellicola di plastica.
16. Brevemente centrifugare la piastra in una mini piatto girevole e il ciclo termico seguente: 95 ° C, 3 min, 25 cicli di 94 ° C, 30 sec e 65 ° C, 5 min, e mantenere a 4 ° C.
17. Trasferimento 60 ml di ogni campione in una provetta separata e conservare a - 20 ° C per l'uso al punto 3.
18. Aggiungere dye DNA loading al restante volume di ogni campione (3 ml di 6x DNA loading dye a 15 microlitri di campione) e funzionamento 5 microlitri da ogni reazione su un gel di agarosio 1%.
    NOTA: Le cellule che amplificati con successo apparirà come uno striscio da 250 a 1000 bp. I campioni che non presentano una sbavatura o mostrano solo una macchia debole è improbabile per produrre dati di sequenziamento utili.

3. Sequencing

1. Purificare i campioni con perline paramagnetici.
   1. Thacampioni di DNA W sul ghiaccio. perline Vortex paramagnetici fino a quando la soluzione è omogenea e incubare le perline a temperatura ambiente per almeno 30 min.
   2. Trasferire 20 ml di ogni campione di DNA in una provetta pulita. Il resto del campione può essere conservato a -20 ° C.
   3. Aggiungere 30 ml (1.5x) di perline paramagnetici ad ogni campione di DNA e vortex per miscelare. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 min. Lasciare la soluzione stock di perline a temperatura ambiente per l'uso nel passo 3.4.
   4. Posizionare i tubi su una striscia magnetica tubo per 2 minuti, o fino a quando le perle formano un pellet e il surnatante è chiaro.
   5. Usando una pipetta P200, rimuovere la maggior quantità di surnatante possibile senza disturbare le perline.
   6. Aggiungere 180 ml di 80% di etanolo alla miscela DNA-tallone. Ruotare i tubi diverse volte rispetto al magnete di "lavaggio" le perle attraverso la soluzione di etanolo.
   7. Usando una pipetta P200, rimuovere la maggior quantità di lavaggio etanolo come posBLE senza disturbare le perline.
   8. Ripetere 3.1.6 e 3.1.7.
   9. Far asciugare le perle per circa 10 minuti o fino a quando non è più l'etanolo è visibile. Procedere alla fase successiva, quando le perline appaiono rotti o cadere dalla parete del tubo.
   10. Rimuovere i campioni dalla striscia magnetica. Aggiungere 40 ml di 10 mM Tris pH 8,0 per eluire il DNA dalle perline e vortice dei campioni per risospendere le sfere. Incubare per 2 minuti a temperatura ambiente.
   11. centrifugare brevemente i campioni per raccogliere il liquido sul fondo del tubo e posizionare i tubi su una striscia magnetica tubo per almeno due minuti. Trasferire il eluente in provette da microcentrifuga puliti senza disturbare le perline.
2. normalizzazione del campione
   1. Quantificare la concentrazione di ogni campione utilizzando uno spettrofotometro. Le concentrazioni dovrebbero variare da 10 a 30 ng / mL.
   2. Diluire ciascun campione a 0,2 ng / ml usando 10 mM Tris pH 8,0. Le seguenti operazioni richiedono un minimo input di 5 ml di questa diluizione.
3. preparazione Biblioteca
   1. Preparare le librerie di sequenziamento seguendo le istruzioni del kit di preparazione libreria ^13.
4. pulizia finale
   1. Pulire i campioni in base al passo 3.1. Per lunghezze di lettura di 50 bp, 75 bp, o 150 punti base, utilizzare un rapporto di tallone di assaggiare volume di 1,5x, 1x, o 0.6x, rispettivamente. Eluire con 15 ml di 10 mM Tris pH 8.0.
   2. Eseguire i campioni su un analizzatore frammento controlla la distribuzione delle dimensioni della libreria ^14. La distribuzione dimensionale dovrebbe essere uniformemente diffondersi da 150 al 900 bp.
5. Quantificare i campioni utilizzando qPCR
   1. Utilizzando un kit di quantificazione biblioteca, impostare una reazione qPCR secondo le istruzioni del kit ^15. Lascia un vuoto di colonna per aggiungere norme positive (norme DNA del kit) e gli standard negativi (acqua o altra soluzione vuota).
   2. ciclo termico come Folbassi: 95 ° C, 5 min (velocità di rampa di 4,8 ° C / sec) e 35 cicli di 95 ° C, 30 sec (velocità di rampa di 4,8 ° C / sec) e 60 ° C, 45 sec (velocità di rampa di 2,5 ° C / sec).
6. pooling
   1. Determinare come sono necessarie molte corsie sulla cella a flusso e dividere i campioni in gruppi, con un gruppo per corsia.
   2. Per ciascun gruppo di campioni, scegliere il campione con la più bassa concentrazione sulla base dei dati qPCR dal punto 3.5.2 e normalizzare tutti i campioni in quel gruppo a detta concentrazione utilizzando 10 mM Tris pH 8,0.
   3. Pool i campioni in ciascun gruppo insieme.
7. sequencing
   1. Piscine di carico sulla macchina di sequenziamento di prossima generazione seguenti procedure standard ^16.

Analisi 4. I dati

NOTA: Un ambiente basato su Unix è necessario per eseguire i programmi e gli script in questa sezione. Installare il software di cui al protocollo dopo la loro in guide instal-. Tutti gli script possono essere trovati a https://sourceforge.net/projects/singlecellseqcnv/.

1. Tagliare la legge a 40-nt utilizzando fastx_trimmer da FASTX-Toolkit versione 0.0.13 ^17.
   fastx_trimmer -Q33 -i example.fastq -l 40 -o example.trim.fastq
2. Allineare la legge al genoma appropriata di riferimento (MM9 per il mouse, hg19 per l'uomo) con BWA versione 0.6.1 con le opzioni di default ^18.
   bwa aln mm9.fa example.trim.fastq> example.sai
   bwa Samse mm9.fa example.sai example.trim.fastq> example.sam
3. Rimuovere allineamenti di CHRM e cromosomi casuali, quindi ordinare e indicizzare il file BAM risultante utilizzando SAMTools versione 0.1.19 ^19.
   grep -v -w CHRM example.sam | grep -v casuale> example.filtered.sam
   samtools vista example.filtered.sam -uSh | samtools sorta - example.filtered
   samtools indice example.filtered.bam
4. Eseguire HMMcopy per rilevare CNV= "Xref"> 20
   1. Utilizzare gcCounter in HMMcopy per generare un file di riferimento percentuale di GC per il genoma. Utilizzare l'opzione "w 500000" per specificare la dimensione della finestra. Utilizzare la stessa versione del file di riferimento FASTA utilizzato nel passaggio 4.2, ma fare in modo CHRM e cromosomi casuali vengono rimossi dal file FASTA.
      gcCounter -w 500000 mm9.fa> mm9_gc.wig
   2. Utilizzare generateMap.pl in HMMcopy per generare un file di manovra per mappability. Utilizzare l'opzione "w 40" per specificare leggere lunghezza. Utilizzare lo stesso file di riferimento fasta utilizzato nel passaggio 4.4.1.
      generateMap.pl -b mm9.fa
      generateMap.pl -w 40 -i mm9.fa mm9.fa -o mm9.bigwig
   3. Utilizzare mapCounter in HMMcopy per generare un file di riferimento mappability per il genoma. Utilizzare l'opzione "w 500000" per specificare la dimensione della finestra.
      mapCounter -w 500000 mm9.bigwig> mm9_map.wig
   4. Utilizzare readCounter in HMMcopy per generare un file di manovra per ogni file BAM.
      readCounter -w 500000 example.filtered.bam> input.wig
   5. Modificare i percorsi dei file di riferimento negli script R (run_hmmcopy.mm9.r o run_hmmcopy.hg19.r), usare i file generati sopra a 4.4.1 (ad esempio, mm9_gc.wig) e 4.4.3 (per esempio, mm9_map. parrucca) per le variabili gfile e MFILE, che si riferiscono al file di riferimento percentuale di GC e riferimento mappability, rispettivamente. Quindi eseguire lo script R fornito "run_hmmcopy.mm9.r" o "run_hmmcopy.hg19.r".
      R CMD LOTTO run_hmmcopy.mm9.r
      o
      R CMD LOTTO run_hmmcopy.hg19.r
   6. Per l'elaborazione in batch di un insieme di file BAM, inserire i file BAM in una singola cartella ed eseguire lo script fornito "HMMpipe.pl" nel pacchetto di chiamare i segmenti e calcolare i punteggi di variabilità (VS). Seguire il formato:
      perl HMMpipe.pl Folder_to_BAMfiles MM9
5. Eseguire DNAcopy per rilevare CNV ^21.
   1. Utilizzare SAMtools versione 0.1.19 per estrarre mappata univocamente legge da ciascun file BAM.
      Vista samtools -h -F 0x0004 example.filtered.bam | egrep -i "^ @ | XT: A: U" | samtools vista -shu -> example.mapped.bam
   2. Utilizzare MarkDuplicates in Picard versione 1.94 per contrassegnare i duplicati PCR nel BAM file di ^22.
      java -jar MarkDuplicates.jar INPUT = example.mapped.bam USCITA = example.nondup.bam METRICS_FILE = example.dup REMOVE_DUPLICATES = true
   3. Utilizzare coveragebed in bedtools versione 2.17.0 per contare mappato legge in ciascuna delle finestre dinamica 500kb mappabili predefiniti nel file da letto disponibile "mm9.500k.dynamic.win.bed" o "hg19.500k.dynamic.win.bed" ²³ .
      coverageBed -abam example.nondup.bam -b mm9.500k.dynamic.win.bed -counts | sorta -k1,1 -k2,2n> example.nondup.counts
   4. Utilizzare lo script Perl fornito "normalizeGC.pl" per normalizzare i conteggi di lettura in base alla condizione file di riferimento contenuto GC "mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt" o "hg19.500k.dynamic.win.fa. gc.txt ".
      perl normalizeGC.pl mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt example.nondup.counts> example.bam.norm.counts
   5. Utilizzare la R script "dnacopy.r" fornito a chiamare i segmenti.
      R CMD LOTTO dnacopy.r
6. identificare CNV
   1. Escludere le cellule per i quali il VS calcolato 4.4.6 supera 0,26.
   2. Filtrare i segmenti chiamati da HMMcopy in 4.4.6 per includere solo quelli per i quali il rapporto mediana log ₂ è maggiore di 0,4 (guadagno putativo) o meno di -0.35 (perdita putativo).
   3. Filtrare i segmenti chiamati da DNAcopy in 4.5.5 per includere solo quelli per i quali il segmento media è maggiore di 1,32 o inferiore a 0,6.
   4. Sovrapporre i segmenti da 4.6.2 e 4.6.3, chiamando CNV solo nelle regioni in cui sia HMMcopy e DNAcopy identificano un guadagno o una perdita putativo putativo.

Risultati

L'aspiratore montato dovrebbe essere simile a quello della Figura 1A. L'ago deve essere disegnato in modo che sia sufficientemente ampia per accogliere una singola cella, ma non così ampia che un grande volume è redatta con singola cella. Aspirando singole cellule è più facile quando ci sono da uno a cinque celle in un campo 10 volte (Figura 1B).

Se intera amplificazione del genoma è riuscita, il campione apparirà come una macchia su un gel di agarosio (figura 2, corsie 1, 2, 4, 5, 6 e 7). Uno striscio debole o assente indica una reazione di amplificazione fallito e il campione non deve essere sequenziato (Figura 2, corsie 3 e 8).

Dopo la preparazione biblioteca, la distribuzione delle dimensioni frammento di campioni deve essere valutata mediante elettroforesi capillare su un analizzatore frammento.Successo librerie preparati avranno piuttosto distribuzione uniforme di dimensioni frammento di 150 bp al 900 (Figura 3, A, B). Preparazione biblioteca riuscita si tradurrà in una distribuzione di dimensione del frammento distorta e tali librerie non dovrebbe essere sequenziato (Figura 3C).

L'elaborazione di dati di sequenziamento attraverso il modello di Markov nascosto (HMMcopy) e la segmentazione binario circolare (DNAcopy) analizzerà il genoma di ogni cella in segmenti di numero di copie stimato. Questi segmenti possono essere filtrati per identificare quelli con un numero di copie stimato coerente con guadagno o perdita in una singola cella (Tabella 1). Questi segmenti filtrati da HMMcopy e DNAcopy dovrebbero quindi essere sovrapposte per individuare alta fiducia CNV.

Figura 1. isolamento delle cellule singolo. ( A) assemblata microaspirator. (B) Un campo 10 volte mostra dissociato cellule (frecce) e l'ago microaspirator (in basso a destra). Aspirando singole cellule è più facile quando ci sono da uno a cinque celle in un campo 10X. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. amplificazione del genoma intero. Agarosio elettroforesi su gel di 5 ml di prodotti dell'intero genoma di amplificazione. I campioni che amplificano con successo apparirà strisci come brillanti da 100 bp a 1 kb (corsie 1, 2, 4, 5, 6 e 7) e può essere sequenziato. I campioni che non amplificano con successo produrrà sbavature deboli o nessuna sbavatura (corsie 3 e 8) e non dovrebbe essere sequenziato.large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Preparazione biblioteca. I risultati rappresentativi da un analizzatore di frammento. I grafici mostrano dimensione del frammento (in bp) sull'asse X e unità di fluorescenza relativa (RFU) sull'asse Y. A destra di ogni grafico è una corsia di gel simulato. (A) i risultati di un campione ideale, con una distribuzione uniforme tra 150 e 900 bp e senza picchi taglienti o pregiudizi verso un lato. Questo campione è accettabile per il sequenziamento. (B) I risultati di un campione bene, con una distribuzione delle dimensioni oblique verso dimensioni frammento più bassi. Mentre questo non è ottimale, il campione può essere ancora sequenziato. (C) i risultati da un campione fallito, con prevalenza di piccole dimensioni frammento. Questo è probabilmente causato da una prolungata incubazione durante la fase di tagmentationdi preparazione library. Questo campione non deve essere sequenziato. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

HMMcopy
Campione	Segmento	Chr	Inizio	Fine	Stato	Mediano
D15-4998	23	chr8	144.500.001	146.500.000	6	0.5008794
D15-4998	29	chr10	67.000.001	134.500.000	6	0.4031945
D15-4998	52	chr19	1	20.000.000	6	0.4616884
D15-4998	57	Chry	1	59.500.000	2	-1,506532
DNAcopy
Campione	Chrom	Inizio bin	fine bin	Inizio	Fine	Seg media	med Seg
D15-4998	chr10	88	197	62.612.945	129.971.511	1,4688	0.157
D15-4998	chr19	0	31	0	28.416.392	1,4141	0,1674
D15-4998	chrX	77	126	95.343.369	1,3548	0,1874
D15-4998	Chry	0	14	0	23.805.358	-2,7004	0,3591

51.659.160

Tabella 1. L'analisi dei dati. segmenti filtrati generati da HMMcopy e DNAcopy da una singola cellula. La sovrapposizione di questi due risultati rivela un guadagno sul cromosoma 10 da 67 a 130 Mb, nonché un guadagno sul cromosoma 19 da 0 a 20 Mb. Abbiamo trovato che i guadagni sulla porzione prossimale del cromosoma 19 sono un artefatto di sequenziamento singola cella ^12.

Discussione

Tradizionalmente, individuando CNVs e aneuploidie a livello delle singole cellule necessarie metodi citologici come il pesce e SKY. Ora, singola sequenza cella è emerso come un approccio alternativo per tali domande. sequenziamento singola cella ha dei vantaggi rispetto FISH e il cielo come è sia genome-wide e alta risoluzione. Inoltre, quando si applicano metodi di controllo della qualità appropriati, il sequenziamento singola cellula in grado di fornire una valutazione più affidabile di CNVs e aneuploidia in quanto non è suscettibile di ibridazione e la diffusione manufatti inerenti alla FISH e SKY. Tuttavia, molte delle recenti applicazioni di sequenziamento singola cellula non sono state dimostrate dalla valutazione approfondita della sensibilità e specificità dei metodi e delle analisi. In effetti, alcuni degli approcci analitici utilizzati da altri studi sono associati con alte frequenze (> 50%) di falsi positivi CNV chiama ^12. L'approccio che descriviamo è stato rigorosamente testato utilizzando cellule di knproprio fardello CNV, al fine di determinare i tassi di scoperta veri e falsi e ottimizzare la sensibilità e la specificità del CNV rilevazione ^12. Utilizzando il controllo di qualità e approcci analitici descritti in questo protocollo, circa il 20% dei guadagni di 5 Mb, il 75% delle perdite 5 Mb, e tutto CNV superiore a 10 Mb può essere rilevato. Sebbene determinazione del false discovery rate di singola sequenza cella è difficile, abbiamo stimato per essere inferiore al 25%. Questo protocollo può essere applicata alle cellule da una varietà di fonti, gli script possono essere modificati per regolare la risoluzione della rilevazione CNV, e il protocollo può essere adattato per identificare altri tipi di alterazioni genomiche.

Ci sono una varietà di mezzi di dissociare tessuti freschi in singole cellule, e molte pubblicazioni descrivono le procedure ottimizzati per specifici tessuti, come la pelle e il cervello ^{24 25.} Preferiamo isolare singole cellule da microaspirazione quanto permette fo r valutazione visiva di ogni cella da sequenziare. Tuttavia, è anche possibile isolare singole cellule mediante fluorescenza-attivato cell sorting (FACS) ²⁶ e dispositivi microfluidici ^27. Se l'isolamento singola cella e tutta amplificazione del genoma viene eseguita manualmente, è ragionevole isolare e amplificare fino a quaranta celle in una sola seduta. Al fine di ottenere i dati di sequenziamento singola cellula di alta qualità, è fondamentale che l'amplificazione dei genomi singola cellula è uniforme e completo. Troviamo che la qualità di singole cellule isolate, nonché l'efficienza della lisi ed amplificazione ha un impatto significativo sulla qualità dei dati di sequenziamento. Come tale, le cellule dovrebbero essere raccolti dal loro ambiente nativo appena prima di isolamento e di tutta l'amplificazione del genoma dovrebbe iniziare subito dopo che le cellule sono isolate. Inoltre, la fase di lisi e frammentazione dovrebbe essere seguita esattamente come descritto nella procedura 2,3-2,6.

"> Gli algoritmi possono essere regolati per cambiare la risoluzione di rilevazione CNV, con opposti effetti sulla sensibilità e specificità ^12. E 'inoltre possibile regolare le soglie per rilevare intero cromosoma aneuploidia nella cornice di tetraploidy ^11. Tuttavia, troviamo che il nostro approccio è limitato a rilevare CNV maggiore di 5 Mb, come rumore introdotto durante tutta la amplificazione del genoma complica l'individuazione di varianti minori ^12. miglioramenti futuri in tutto il genoma di amplificazione approcci dovrebbero in ultima analisi, migliorare la risoluzione di rilevamento CNV utilizzando un'unica sequenza cella.

Sequenziamento singola cella consente per le indagini non solo le alterazioni del numero di copie, ma anche le variazioni singolo nucleotide ^{28, 29} e ³⁰ variazione strutturale. Il nostro protocollo per l'isolamento delle cellule singolo può essere applicato a rispondere a queste altre quesug-. Tuttavia, la scelta di tutto il metodo genoma di amplificazione dipende dall'applicazione specifica. Il metodo descritto in questo protocollo, che si basa sulla reazione a catena della polimerasi, è più adatto per la rilevazione di alterazioni del numero di copie perché è associato con livelli più bassi di amplificazione pregiudizi ^32. Per indagare altri tipi di alterazioni genomiche, come singoli polimorfismi nucleotidici, altri metodi di amplificazione del genoma intero sono ritenuti essere più adatto ^{31, 32.}

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tubi assemblati per aspiratore per pipette microcapillari calibrate Tubo	in PVC Sigma	A5177
(ID 3/16", OD 5/16", ~1 piede)	Tubo in PVC VWR	89068-500
(ID 5/16", OD 7/16", ~6 pollici)	Filtro per	89068-508
Acrodisc con membrana HT Tuffryn (diametro 25 mm, dimensione dei pori 0,2 & micro; m)	VWR	28144-040
Pipetta sierologica (5 mL)	BioExpress	P-2837-5	Qualsiasi pipetta in plastica da 5 mL dovrebbe essere sufficiente
Trappola d'acqua in linea per l'uso dell'ossigeno	Amazon.com	700220210813
Provette per punto di fusione capillare (ID 0,8-1,1 mm, lunghezza 100 mm)	VWR	34502-99
Argilla da modellare	VWR	470156-850
Piastra di Petri (diametro 150 mm)	VWR	25384-326	La superficie deve essere non aderente per facilitare l'aspirazione di singole cellule
Hard-Shell  PCR semi-gonna a 96 pozzetti a tutta altezza  Piastre	Bio-Rad	HSS9601	Qualsiasi piastra PCR a 96 pozzetti dovrebbe essere sufficiente
Piastra per coltura tissutale a 96 pozzetti	VWR	62406-081	Qualsiasi piastra per coltura tissutale a 96 pozzetti dovrebbe essere sufficiente
GenomePlex Kit di amplificazione dell'intero genoma a cellula singola	Sigma	WGA4
Microseal Film 'A'	Bio-Rad	MSA5001
Mini spinner	Thomas Scientific	1225Z37
Termociclatore	Bio-Rad	1861096	Qualsiasi termociclatore dovrebbe essere sufficiente, purché possa ospitare una piastra PCR a 96 pozzetti
Agencourt Ampure Beads	Beckman Coulter	A63880
Dynamag-2 Magnet	Thermo Fisher Scientific	12321D	Qualsiasi striscia di tubo magnetico simile dovrebbe essere sufficiente
Nextera XT DNA Library Preparation Kit	Illumina	FC-131-1096
Nextera XT Index Kit	Illumina	FC-121-1012
Kit completo (ottimizzato per Roche LightCycler 480)	Kapa Biosystems	KK4845	Questo kit è ottimizzato per la macchina per PCR in tempo reale Roche LightCycler 480. Se si utilizza una macchina diversa, sostituirla con un kit ottimizzato per la propria macchina.