Metodo per visualizzare e analizzare membrana proteine ​​interagenti con microscopia elettronica a trasmissione

Summary

Molte proteine svolgono la loro funzione quando sono attaccate alle superfici della membrana. Il legame di proteine estrinseche sulle membrane dei nanodischi può essere indirettamente ripreso mediante microscopia elettronica a trasmissione. Mostriamo che il caratteristico impilamento (rouleau) dei nanodischi indotto dal fosfotungstato di sodio con colorazione negativa è impedito dal legame della proteina estrinseca.

Abstract

Le proteine monotopiche esercitano la loro funzione quando sono attaccate alla superficie di una membrana, e tali interazioni dipendono dalla specifica composizione lipidica e dalla disponibilità di un'area sufficiente per svolgere la funzione. I nanodischi sono utilizzati per fornire una superficie di membrana di dimensioni e contenuto lipidico controllati. In assenza di proteine estrinseche legate, i nanodischi colorati con fosfotungstato di sodio appaiono come pile di monete se osservati lateralmente mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Questo protocollo è quindi progettato per promuovere intenzionalmente lo stacking; Di conseguenza, la prevenzione dell'impilamento può essere interpretata come il legame della proteina legante la membrana al nanodisco. In una fase successiva, le immagini TEM dei complessi proteina-nanodisco possono essere elaborate con metodi standard a singola particella per produrre strutture a bassa risoluzione come base per il lavoro di crioEM a risoluzione più elevata. Inoltre, i nanodischi forniscono campioni adatti sia per l'elettroforesi TEM che per l'elettroforesi su gel non denaturante. Per illustrare il metodo, viene presentato il legame indotto dal Ca²⁺ della 5-lipossigenasi sui nanodischi.

Introduction

Nella ricerca medica, molta attenzione è focalizzata sulle proteine ​​di membrana, sia intrinseci o estrinseci, coinvolti in una varietà di interazioni lipidi. Utilizzo di proteine lipidi interagenti comprende sia selezionando un sostituto dei lipidi, quali detergenti, amphipols ¹ o piccole proteine ^2, o trovare un sostituto membrana che mantiene la proteina solubile ed attiva. Sostituti membrana lipoico includono liposomi e nanodiscs (ND) ^{3, 4.}

Nanodiscs sono piattaforme membrana vicino native sviluppate progettando la parte proteic....

Protocol

1. Preparazione di Nanodiscs

1. Espressione e purificazione della proteina di membrana ponteggio ^{8, 35}
   1. Esprimere il MSP1E3D1 His-tag nel E. coli BL21 (DE3) ceppo T1R pRARE2 in fiaschi. Preparare una coltura starter durante la notte da 50 ml con terreno LB integrato con 50 mg / ml kanamicina a 37 ° C. Diluire la coltura starter durante la notte in 2 litri di brodo di medio formidabile integrato con 50 mg / ml kanamicina.
   2. Crescere le cellule a 37 ° C fino a quando la densità ottica a 600 nm (OD ₆₀₀₎ raggiunge circa 3. indurre l'espressione di proteine con 0,5 m....

Results

Il metodo proponiamo dipende dalla preparazione di nanodiscs per fornire la superficie della membrana per il legame monotopic membrana proteine. Poiché non esiste una proteina transmembrana integrato nel doppio strato lipidico nanodisc, i nanodiscs sono qui indicati come "nanodiscs vuoti" (Figura 2A). Questi hanno un peso molecolare calcolato di 256 kDa per una composizione di due proteine MSP1E3D1 ponteggi e circa 260 molecole di POPC ^8. Usando q.......

Discussion

Il metodo può essere suddiviso in tre parti: la ricostituzione di nanodiscs vuoti, la preparazione di complessi proteina-nanodisc, e la colorazione negativa per il TEM di questi complessi. Ogni parte sarà affrontata separatamente per quanto riguarda i limiti della tecnica, passaggi critici, e le modifiche utili.

Ricostituzione di nanodiscs vuote. passaggi critici e limitazioni nella produzione e l'uso di nanodiscs.

Per la preparazione dei nanodiscs vuoti, è esse.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopio elettronico a trasmissione: JEOL2100F	CCD JEOL
	Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Germania
Scaricatore di bagliore	Griglia TEM Baltec
: 400 mesh	TAAB	GM016/C
Cromatografia ad esclusione dimensionale: Agilent SEC-5	Agilent Technologies	5190-2526
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare Life Sciences	17-5172-01
Plasmide: MSP1E3D1	Addgene	20066
Batteri: BL21DE3	NEB	C2527H
Batteri: BL21 (DE3) T1R pRARE2	Protein Science Facility, KI, Solna
Matrice di purificazione: ATP agarosio	Sigma Aldrich	A2767
Matrice di purificazione: HisTrap HP-5 mL	GE Healthcare Life Sciences	17-5247-01
Lipidi: POPC	Avanti lipidi polari	850457C	25 mg/mL in cloroformio
Perle idrofobiche: Bio-Beads, resina SM-2	Bio-Rad	1523920
Filtro per siringa da 13 mm: 0,2 μ m	Pall scienze della vita	PN 4554T
Colorante: Sodio fosfotonato idrato tribasico	Sigma Aldrich	31648
2-mercaptoetanolo	Sigma Aldrich	M3148-250ML
Sodio dodecil solfato (SDS)	Bio-Rad	161-0301
Cocktail di inibitori della proteasi	Sigma Aldrich	4693132001
TCEP	Detergente Sigma Aldrich	646547
: Acido di sodio idrato	Sigma Aldrich	C6445-10G
Sodium Cholate			500 mM Sodium Cholate. Risospendere in acqua miliQ e conservare a -20 °C.
Stock			50 mM POPC, 100 mM di colato di sodio, 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl. Conservare a 4 gradi C per una settimana; o Negozio -80 ° C per un mese, dopo aver spurgato la soluzione con azoto.
Tampone			20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5 mM EDTA. Conservare a 4 °C.
Tampone anodico per elettroforesi non denaturante	Thermo Fisher Scientific	BN2001	50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6,8
Tampone catodico per elettroforesi non denaturante	Thermo Fisher Scientific	BN2002	50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6,8, 0,002% Coomassie G-250
Elettroforesi non denaturante 4x Tampone per il caricamento del campione	Thermo Fisher Scientific	BN2003	50 mM di Bis-Tris, pH 7,2, 6 N HCl, 50 mM di NaCl, 10% (p/v) di glicerolo, 0,001% di Ponceau S
Tampone di corsa per elettroforesi denaturante Ricetta			interna: 25 mM di Tris-HCl, pH 6,8, 200 mM di glicina, 0,1% (p/v) SDS
Elettroforesi denaturante 5x Caricamento del campione Tampone			Ricetta interna: 0,05% (p/v) di bromofenoloblu, 0,2 M di Tris-HCl, pH 6,8, 20% (v/v) di glicerolo, 10% (p/v) SDS, 10 mM 2-mercaptoetanolo
Brodo			Triptone - 12,0 g, estratto di lievito - 24,0 g, 100 mL 0,17 M KH2PO4 e 0,72 M K2HPO4, Glicerolo - 4 mL. Triptone, estratto di lievito e glicerolo sono stati preparati a 900 mL e sterilizzati in autoclave separatamente. KH2PO4 e K2HPO4 sono stati preparati e sterilizzati in autoclave separatamente. Entrambi sono stati miscelati prima di utilizzare il mezzo.