Viene presentato un protocollo per la sintesi di 1,2-azaborine e la preparazione dei loro complessi proteici con mutanti del lisozima T4.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Sintesi di 1,2-Azaborines e la preparazione dei loro complessi proteici con T4 lisozima Mutants
In questo articolo
Sommario
Abstract
Descriviamo una sintesi generale di 1,2-azaborine utilizzando tecniche standard air-free e preparazione di complessi proteici con mutanti del lisozima T4 mediante diffusione del vapore. I composti sensibili all'ossigeno e all'umidità vengono preparati e isolati in atmosfera inerte (N2) utilizzando un collettore di gas sotto vuoto o una scatola a guanti. Come esempio di sintesi dell'azaborina, dimostriamo la sintesi e la purificazione del volatile N-H-B-etil-1,2-azaborina mediante una sequenza in cinque fasi che coinvolge la distillazione e la cromatografia su colonna per l'isolamento dei prodotti. I mutanti del lisozima T4 L99A e L99A/M102Q sono espressi con il ceppo RR1 di Escherichia coli. I protocolli standard per la lisi chimica delle cellule, seguita dalla purificazione mediante colonna a scambio ionico carbossimetilico, consentono di ottenere proteine di purezza sufficientemente elevata per la cristallizzazione. La cristallizzazione delle proteine viene eseguita in varie concentrazioni di precipitante a diversi intervalli di pH utilizzando il metodo di diffusione del vapore a goccia sospesa. La preparazione complessa con le piccole molecole viene effettuata con il metodo della diffusione del vapore in atmosfera inerte. L'analisi della diffrazione a raggi X del complesso cristallino fornisce prove strutturali inequivocabili delle interazioni di legame tra il sito di legame della proteina e le 1,2-azaborine.
Introduzione
Boro-contenenti azoto eterocicli (vale a dire 1,2-azaborines) hanno recentemente attirato notevole attenzione come isosteri di areni. Questo isosteria può portare alla diversificazione dei motivi strutturali esistenti per ampliare lo spazio chimica 2, 3, 4. Azaborines hanno potenziale utilità per l'applicazione nella ricerca biomedica 5, 6, 7, 8, in particolare nel campo della chimica medicinale che i chimici svolgono sintesi ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
NOTA: Tutte le manipolazioni ossigeno e sensibili all'umidità sono state effettuate in atmosfera inerte (N 2) utilizzando sia tecniche senza aria standard o un vano portaoggetti. THF (tetraidrofurano), Et 2 O (etere etilico), CH 2 Cl 2 (diclorometano), toluene, pentano e sono stati purificati facendo passare attraverso una colonna di allumina neutra sotto argon. Acetonitrile venne essiccata su CaH 2 (idruro di calcio) e distillato sotto atmosfera di azoto prima dell'uso. Pd / C (palladio su carbone) è stata riscaldata sotto vuoto spinto a 100 ° C per 12 h prima dell'uso. gel di silice (230-400 mesh) è....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
La via sintetica schema per 1,2-azaborines è mostrato in Figura 1. Questo protocollo si applica alla sintesi di cinque diverse molecole boro contenenti azoto. Figura 2 rappresenta 11 B NMR spettri misurati nel corso del passo 1.3 per monitorare la formazione del prodotto desiderato (3). Purificazione di proteine è stata effettuata utilizzando il sistema di cromatografia a bassa pressione ed un cromatogramma rappresentativo è m.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Nella prima parte di questo protocollo, abbiamo descritto una sintesi modificata del 1,2-azaborines basate su metodi precedentemente riportati 12, 13. Triallylborane 22 è stato utilizzato come sostituto per le rotte che utilizzano allyltriphenyl stagno o di potassio allyltrifluoroborate per preparare N -allyl- N -TBS- B -allyl cloruro addotto (1). Questo metodo consente un approccio più atomi-ec.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Tutti gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti in questo manoscritto.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata supportata dal National Institutes of Health NIGMS (R01-GM094541) e dal Boston College.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tetraidrofurano (THF), senza inibitori, per HPLC, ≥ 99,9% | Sigma Aldrich | 34865 | |
| Etere dietilico (Et2O), per HPLC, ≥ 99,9%, senza inibitori | Sigma Aldrich | 309966 | |
| cloruro di metilene (CH2Cl2), (ACS stabilizzato/certificato) | Fisher | D37-20 | |
| Toluene | Fisher | T290-4 | |
| Pentano, HPLC | Fisher | P399-4 | |
| Acetonitrile | Fisher | A21-4 | |
| Idruro di calcio (CaH2), grado reagente, 95% | Sigma Aldrich | 208027 | Palladio piroforico |
| su carbone attivo (Pd/C), 10% in peso Pd | Strem | 46-1900 | |
| 1,0 M Soluzione di tricloruro di boro in esano | Sigma Aldrich | 211249 | altamente tossico/piroforico |
| , ≥ 99,5% | Catalizzatore di generazione Sigma Aldrich | 471283 | |
| Grubbs 1st | materia | C823 | |
| Acetamide | Sigma Aldrich | A0500 | |
| n-butanolo, anidro, 99,8% | Sigma Aldrich | 281549 | |
| soluzione di etillitio, 0,5 M in benzene/cicloesano | Sigma Aldrich | 561452 | altamente tossica/piroforica |
| , 2,0 M in Et2O | Sigma Aldrich | 455180 | |
| 2-metilbutano, anidro, ≥ 99% | Sigma Aldrich | 277258 | |
| Escherichia coli, (Migula) Castellani e Chalmers (ATCC® 31343™) | ATCC | 31343 | |
| Lisozima T4 WT* (L99A) | Addgene | 18476 | |
| T4 lisozima mutante (S38D, L99A, M102Q, N144D) | Addgene | 18477 | |
| Ampicillina sale sodico | Sigma Aldrich | A0166 | |
| isopropil-beta;-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) | Invitrogen | AM9464 | |
| Fosfato di sodio monobasico anidro | Fisher | BP329 | |
| Fosfato di sodio bibasico anidro | Fisher | BP332 | |
| Cloruro di sodio | Fisher | S642212 | |
| Acido etilendiamminotetraacetico | Fisher | BP118 | |
| Cloruro di magnesio | Sigma Aldrich | M4880 | Corrosivo |
| Thermo scientifico pierce DNaseI | Fisher | PI-90083 | |
| GE Healthcare Terreni di scambio cationico a flusso rapido di sefarosio | Fisher | 45-002-931 | |
| Tris-base | Fisher | BP152-500 | |
| Aziduro di sodio | TCI | S0489 | |
| 2-Mercaptoetanolo | Fisher ICN806443 | ||
| Sartorius Concentratori centrifughi Vivaspin 20 | Fisher | 14-558-501 | |
| Fosfato di potassio monobasico | Sigma | Aldrich P5379 | |
| 2-idrossietildisolfuro | Sigma Aldrich | 380474 | |
| N-paratone | Hampton Research | HR2-643 | |
| 4 tubi a membrana per dialisi RC da 12.000 a 14.000 Dalton MWCO | Fisher | 08-667E | |
| Tubo | Hampton Research | a forma di anello | |
| CryoTong | Thermo Fisher | pinza criogenica | |
| Folaga | immagini della densità elettronica sono generate dal software |
Riferimenti
- Ducruix, A., Giége, R. Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, A Practical Approach. , IRL Press. Oxford, UK, New York. (1992).
- Bosdet, M. J. D., Piers, W. E. B-N as a C-C substitute in aromatic systems. Can. J. Chem. 87 (1), 8-29 (2009).
- Campbell, P. G., Marwitz, A. J., Liu, S. -Y.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
