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Articolo metodologico

Sintesi di 1,2-Azaborines e la preparazione dei loro complessi proteici con T4 lisozima Mutants

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⸱

DOI:

10.3791/55154

⸱

25 marzo 2017

 , 
1Department of Chemistry, Boston College

In questo articolo

Sommario

Viene presentato un protocollo per la sintesi di 1,2-azaborine e la preparazione dei loro complessi proteici con mutanti del lisozima T4.

Abstract

Descriviamo una sintesi generale di 1,2-azaborine utilizzando tecniche standard air-free e preparazione di complessi proteici con mutanti del lisozima T4 mediante diffusione del vapore. I composti sensibili all'ossigeno e all'umidità vengono preparati e isolati in atmosfera inerte (N2) utilizzando un collettore di gas sotto vuoto o una scatola a guanti. Come esempio di sintesi dell'azaborina, dimostriamo la sintesi e la purificazione del volatile N-H-B-etil-1,2-azaborina mediante una sequenza in cinque fasi che coinvolge la distillazione e la cromatografia su colonna per l'isolamento dei prodotti. I mutanti del lisozima T4 L99A e L99A/M102Q sono espressi con il ceppo RR1 di Escherichia coli. I protocolli standard per la lisi chimica delle cellule, seguita dalla purificazione mediante colonna a scambio ionico carbossimetilico, consentono di ottenere proteine di purezza sufficientemente elevata per la cristallizzazione. La cristallizzazione delle proteine viene eseguita in varie concentrazioni di precipitante a diversi intervalli di pH utilizzando il metodo di diffusione del vapore a goccia sospesa. La preparazione complessa con le piccole molecole viene effettuata con il metodo della diffusione del vapore in atmosfera inerte. L'analisi della diffrazione a raggi X del complesso cristallino fornisce prove strutturali inequivocabili delle interazioni di legame tra il sito di legame della proteina e le 1,2-azaborine.

Introduzione

Boro-contenenti azoto eterocicli (vale a dire 1,2-azaborines) hanno recentemente attirato notevole attenzione come isosteri di areni. Questo isosteria può portare alla diversificazione dei motivi strutturali esistenti per ampliare lo spazio chimica 2, 3, 4. Azaborines hanno potenziale utilità per l'applicazione nella ricerca biomedica 5, 6, 7, 8, in particolare nel campo della chimica medicinale che i chimici svolgono sintesi di librerie di molecole strutturalmente e funzionalmente pertinenti. Significativamente, tuttavia, mentre ci sono numerose vie sintetiche ben sviluppati a molecole contenenti arene disponibili, sono stati riportati solo un numero limitato di metodi per la sintesi di azaborines 9, 10, 11, 12, 13. Ciò è dovuto principalmente ad un numero limitato di opzioni per la sorgente di boro e l'aria e la natura all'umidità sensibile della molecola nella fase iniziale della sequenza sintetica.

Nella prima parte di questo articolo, descriveremo una sintesi multi-scala grammo di N -TBS- B Cl-1,2-azaborine (3) utilizzando tecniche senza aria standard. Questo composto serve come intermedio versatile che può essere ulteriormente funzionalizzati al strutturalmente più complesse molecole 14, 15. Partendo da 3, verranno descritte la sintesi e la purificazione di N -H- B etil-1,2-azaborine (5) per l'uso in studi di legame proteico. Data la volatilità del 5, il suo isolamento efficace richiede un controllo preciso della temperatura di reazione, tempo e distillation condizioni.

Nella seconda parte, protocolli per l'espressione della proteina e l'isolamento di mutanti T4 lisozima (L99A L99A e / M102Q) 17, 18, 19, saranno presentati 20, seguita da cristallizzazione delle proteine e la preparazione di complessi di cristallo proteina-ligando. Mutanti T4 lisozima L99A L99A e / M102Q sono stati scelti come sistemi modello biologico per esaminare la capacità di idrogeno incollaggio di NH contenente molecole azaborine 17. Utilizzando un protocollo standard di biologia molecolare, la proteina è espressa in ceppo Escherichia coli RR1 e indotta con isopropil-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). Purificazione di proteine ​​viene effettuata utilizzando scambio ionico cromatografia su colonna. Protein cristallizzazione viene effettuata con soluzione altamente concentrata purificata proteine ​​(> 95% di purezza mediante elettroforesi su gel) usando l'attaccaturacadere metodo diffusione del vapore. A causa della sensibilità dei ligandi di questo studio all'ossigeno, i complessi proteina-ligando sono preparati sotto condizioni di assenza di aria.

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Protocollo

NOTA: Tutte le manipolazioni ossigeno e sensibili all'umidità sono state effettuate in atmosfera inerte (N 2) utilizzando sia tecniche senza aria standard o un vano portaoggetti. THF (tetraidrofurano), Et 2 O (etere etilico), CH 2 Cl 2 (diclorometano), toluene, pentano e sono stati purificati facendo passare attraverso una colonna di allumina neutra sotto argon. Acetonitrile venne essiccata su CaH 2 (idruro di calcio) e distillato sotto atmosfera di azoto prima dell'uso. Pd / C (palladio su carbone) è stata riscaldata sotto vuoto spinto a 100 ° C per 12 h prima dell'uso. gel di silice (230-400 mesh) è stato essiccato per 12 ore a 180 ° C sotto vuoto spinto. cromatografia flash è stata eseguita con questo gel di silice in atmosfera inerte. Tutti gli altri prodotti chimici e solventi sono stati acquistati e utilizzati come ricevuto.

NOTA: Attenzione, si prega di consultare tutte le schede di sicurezza dei materiali rilevanti (MSDS) prima dell'uso. Molte delle sostanze chimiche utilizzate nella sintesi dire acutamente tossici e cancerogeni.

1. Preparazione di 1,2-Azaborines

NOTA: i dati di caratterizzazione di tutti i composti in questo studio sono stati precedentemente riportato 12, 13, 16.

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Figura 1: schema di sintesi di 1,2-azaborines. Protocolli dettagliati per la sintesi di ciascun composto (1-5) sono descritti nella sezione del protocollo. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

  1. Preparazione di N -allyl- N -TBS- B cloruro -allyl addotto (1)
    1. In un vano portaoggetti, misurare 6,70 g (50,0 mmol) triallylboraNE 22 in un 24/40 1 L pallone a fondo del forno-essiccato dotato di un ancoretta e aggiungere 250 mL di diclorometano. Sigillare il pallone con un setto di gomma. Fuori dalla scatola, si raffredda la soluzione a -78 ° C sotto atmosfera di azoto in un collettore di gas sotto vuoto.
    2. Aggiungere 100 ml di soluzione 1,00 M di boro tricloruro (100 mmol) in esano alla soluzione triallylborane a -78 ° C mediante cannula. Lasciare agitare la miscela di reazione a questa temperatura per 4 ore.
      NOTA: Attenzione, tricloruro di boro è altamente reattivo con acqua.
    3. In un pallone da 100 mL separata, misurare 25,7 g N - (t -butyldimethylsilyl) - N -allylamine (150 mmol) e aggiungere 20,0 mL di diclorometano. Nel pallone di reazione 1 L, aggiungere questa soluzione con cannula mantenendo la temperatura di reazione a -78 ° C.
    4. Aggiungere 21.0 mL di trietilammina (150 mmol) per la reazione. Mantenere sotto agitazione in un flusso positivo di azoto e permettono di poco a poco caldo per room durante la notte la temperatura.
    5. Dopo 18 h di agitazione, rimuovere circa la metà del solvente attraverso un collettore di gas sotto vuoto usando alto vuoto (300-500 mTorr) con una trappola azoto liquido.
    6. Prendere il pallone di reazione in un vano portaoggetti e filtrare via il sale bianco formato nella miscela di reazione attraverso una fritta di media porosità essiccato in forno dotato di un adattatore 24/40 vuoto e mL pallone da 24/40 500 con un stir bar. Utilizzare diclorometano per trasferire tutti i materiali rimanenti.
    7. Rimuovere tutti i rimanenti volatili dal filtrato fuori area usando un collettore gas sottovuoto con alto vuoto.
    8. In un vano portaoggetti, trasferire la miscela di reazione concentrata in un forno-essiccato 14/20 100 mL pallone a fondo tondo con un ancoretta per prepararsi per la distillazione. Cap il pallone con un setto.
    9. Sotto un flusso di azoto, aprire rapidamente il setto e aggiungere 200 mg di idruro di calcio come essiccante.
    10. Impostare apparecchio di distillazione montando un forno-essiccato 14/20 testa di distillazione attaccato con un termometro, un lato con un pallone di memorizzazione riceve 14/20 50 mL aria libera e l'altro lato con il pallone da 100 mL contenente prodotto grezzo. Dotare la testa di distillazione con acqua refrigerata. (Utilizzare grasso per tutte le articolazioni della distillazione.)
      NOTA: Il prodotto inizia a distillare quando la temperatura del vapore raggiunge i 60 ° C a 300 mTorr.
    11. Continuare raccolta del prodotto innalzando la temperatura del bagno ad olio fino a quando il termometro testa di distillazione legge 75 ° C.
      NOTA: Il prodotto è un liquido trasparente incolore.
    12. Arrestare distillazione eliminando la fonte di calore e raffreddare l'apparecchio a temperatura ambiente prima di stoccaggio. Al raffreddamento, repressurize l'apparato con azoto e strettamente chiudere la valvola di presa sul pallone stoccaggio in aria libera. Conservare il prodotto isolato in un vano portaoggetti congelatore.
      NOTA: La resa può variare dal 65% al ​​84%.
  2. Preparazione di N -TBS- B Cl prodotto ad anello chiuso (2)
    1. In un vano portaoggetti, misurare 56,0 g N -allyl- N -TBS- B -allyl cloruro addotto (1) (217 mmol) in un 24/40 1 L pallone a fondo del forno-essiccato con ancoretta e aggiungere 500 mL di toluene.
    2. Misurare 1,79 g Grubbs 1 catalizzatore generazione st (2.17 mmol).
    3. Aggiungere il catalizzatore porzione saggio alla soluzione agitata di 1 a temperatura ambiente in un vano portaoggetti. Eliminare scatola durante l'aggiunta di rimuovere etilene formata dalla reazione.
      NOTA: La reazione è tipicamente completata entro 30 minuti dalla cessazione di sviluppo di gas. Come un altro indicatore di completamento, il colore reazione sarà completamente cambiato dalla sua iniziale viola al marrone. A questo punto, il prodotto può essere isolato mediante distillazione sotto vuoto; vedi riferimento 12 per i dettagli. In questo protocollo, un one-pot, procedura in due fasi per la sintesi diretta di 3 viene descritta.
  3. Preparazione di N -TBS- B Cl-1,2-azaborine (3)
    1. Alla soluzione di reazione del prodotto chiuso ad anello (2) in toluene, aggiungere 14,0 g di palladio su carbone (10% in peso di Pd, 13.2 mmol).
    2. Togliere il pallone dalla scatola e montare con un condensatore a 24/40 reflusso forno a secco che è stato spurgato con azoto e dotato di acqua refrigerata.
    3. Riscaldare la reazione usando un bagno di olio ad un reflusso vigorosa a 135 ° C sotto agitazione.
    4. Dopo aver mantenuto a riflusso per 16 ore, si raffredda la reazione rimuovendo la beuta dal bagno d'olio. Dopo raffreddamento a temperatura ambiente, prelevare un mL un'aliquota 0,5 dalla miscela di reazione utilizzando una siringa dotata di un ago Luer serratura a forno. Trasferire la mL aliquota 0,5 a un tubo NMR tappo a vite per analizzare attraverso 11 B NMR 12.
      NOTA: Il picco prodotto desiderato appare a ca. 35,5 ppm 12, mentre il mater partirepicco ial appare a circa. 42,9 ppm 12. Di solito a questo punto 11 B NMR indica che la reazione è incompleta, con un minore materiale di partenza picco rimanente.
    5. Se la reazione è incompleta, portare il pallone di reazione in un vano portaoggetti e aggiungere un ulteriore 3,00 g di palladio su carbone (10% in peso di Pd, 2.82 mmol).
    6. Resubject la reazione a riflusso delle condizioni riportate nel 1.3.2 e 1.3.3.
    7. Dopo altre 24 ore a riflusso, analizzare un'altra aliquota della reazione 11 B NMR. A questo punto, la reazione dovrebbe essere completa.
    8. Trasferire il pallone di reazione al vano portaoggetti e passare la miscela di reazione attraverso una colonna cromatografia flash usa e getta pieno di salviette di carta. Raccogliere il filtrato lavando con 50,0 mL di toluene.
    9. Rimuovere tutti i volatili dal filtrato fuori dagli schemi su un collettore di gas a vuoto dotato di alto vuoto.
      NOTA: La rimozione dei volatili può prendere 40 min to 90 min a seconda della pressione del vuoto. Quando il vacuometro legge pressione massima, indica che la rimozione del solvente è completa. Durante la rimozione del solvente, assicurarsi che il bagno acqua sotto la muffola rimane a temperatura ambiente per la dissipazione del calore.
    10. In un vano portaoggetti, trasferire la miscela di reazione concentrata in un forno-essiccato 24/40 250 mL pallone a fondo tondo con un ancoretta. Cap il pallone con un setto.
    11. rimuovere rapidamente il setto e aggiungere 200 mg di idruro di calcio come un agente di essiccazione.
    12. Impostare apparecchio di distillazione montando un 24/40 testa di distillazione essiccato in forno attaccato con un termometro, un lato con una ricezione 24/40 100 matraccio stoccaggio mL aria libera e l'altro lato con il pallone da 100 mL contenente prodotto grezzo. Dotare la testa di distillazione con acqua refrigerata. Utilizzare grasso per tutte le articolazioni della distillazione.
      NOTA: Il prodotto inizia a distillare quando la temperatura del vapore raggiunga i 65 a 70 ° C a 1.000 mTorr con un oliotemperatura del bagno tra i 90-100 ° C. Il prodotto è un liquido trasparente incolore.
    13. Arrestare distillazione eliminando la fonte di calore e raffreddare l'apparecchio a temperatura ambiente prima di stoccaggio. Al raffreddamento, repressurize l'apparato con azoto e strettamente chiudere la valvola di presa sul pallone stoccaggio in aria libera. Conservare il prodotto isolato in un vano portaoggetti freezer a -30 ° C.
      NOTA: La resa del one-pot, procedimento a due fasi è 52%.

figure-protocol-2
Figura 2: 11 B spettri NMR per la formazione di monitoraggio N -TBS- B Cl-1,2-azaborine (3). A) N -Allyl- N -TBS-B-allile cloruro addotto (1), materiale per l'anello di chiusura metathesis partenza. B) Ossidazione dopo 16 ore. (Prodotto ad anello chiuso che non ha reagito N -TBS- B -Cl (2) ed il prodotto isomerizzato B -vinyl chiuso ad anello (2 ') insieme con N-TBS-B-Cl-1,2-azaborine sono mostrati (3)). C) Ossidazione dopo altre 24 h. D) prodotto isolato (3) dopo purificazione mediante distillazione sotto vuoto. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

  1. Preparazione di N -H- B -OBu-1,2-azaborine (4)
    1. In un vano portaoggetti, misurare 4,00 g N- TBS -B- Cl-1,2-azaborine (3) (17,6 mmol) in 100 mL pallone a essiccata a forno di ancoretta e aggiungere 35 mL di acetonitrile. Misurare 1,14 g acetammide (19,3 mmol) e trasferire nel pallone di reazione. Sigillare il pallone con un setto di gomma.
    2. Rimuovere il pallone di reazione dalla scatola e in forma con un oven-essiccato 24/40 condensatore a riflusso che è stato spurgato con azoto e dotato di acqua refrigerata.
    3. Riscaldare la reazione a riflusso a 85 ° C in un bagno d'olio con agitazione.
    4. Dopo 3 ore a riflusso, si raffredda la reazione rimuovendo la beuta dal bagno d'olio. Dopo raffreddamento a temperatura ambiente, rimuovere il solvente su un collettore di gas sotto vuoto dotato di alto vuoto.
    5. Dopo aver rimosso le sostanze volatili sotto vuoto, riprendere il residuo di reazione in 15,0 mL THF. A questa soluzione aggiungere 3,21 ml di n -butanol (35,1 mmol).
    6. Mescolare la reazione a temperatura ambiente per 1 h.
    7. Rimuovere il solvente su un collettore di gas sotto vuoto dotato di alto vuoto per ottenere il prodotto grezzo.
    8. In un vano portaoggetti, isolare il prodotto tramite cromatografia su colonna di gel di silice, usando una miscela di pentano ed etere etilico (5: 1) come eluente. Rimuovere volatili dalle frazioni di prodotto contenenti usando un collettore di gas sotto vuoto dotato di alto vuoto per ottenere il prodotto puroun solido bianco.
      NOTA: Il rendimento può variare da 82% a 87%.
  2. Preparazione di N -H- B etil-1,2-azaborine (5)
    1. In un vano portaoggetti, misurare 1,00 g N- H -B- OBU-1,2-azaborine (4) (6,62 mmol) in 100 mL pallone a fondo del forno-essiccato con ancoretta e aggiungere 25 ml di Et 2 O. Seal il pallone con un setto di gomma e di luogo in N 2 su un collettore di gasolio sotto vuoto.
    2. In un Pallone da 100 ml a fondo tondo separata forno-essiccato, aggiungere 26,5 ml di soluzione ethyllithium (0,5 M in benzene / cicloesano, 13.2 mmol) in atmosfera di azoto. Togliere il composto del solvente (benzene / cicloesano) dal reagente ethyllithium per evitare problemi con l'isolamento del prodotto azaborine desiderato. Riprendere il ethyllithium solido in 13,0 ml di Et 2 O.
      NOTA: Attenzione: reattivi di organo-litio sono piroforico (infiammabile a contatto con l'aria o acqua). Il prodotto desiderato (5 ) È particolarmente volatile (PM = 106.96). Pertanto, è necessaria la rimozione di solvente benzene / cicloesano dal reagente ethyllithium per un efficace isolamento del prodotto puro a causa della volatilità simile con il prodotto desiderato.
    3. Raffreddare il pallone di reazione contenente 4 a -30 ° C con un bagno di raffreddamento.
    4. Aggiungere la soluzione ethyllithium al pallone di reazione mediante cannula a -30 ° C. Tenere agitazione a questa temperatura per 1 h e lasciare che lentamente portarlo a temperatura ambiente.
    5. Monitorare la reazione 11 B NMR. (Il picco intermedia desiderata appare a circa 39,8 ppm.)
    6. Al termine di reazione, si raffredda la reazione a -30 ° C e aggiungere 6,62 mL di soluzione di HCl (2.0 M in Et 2 O, 13.2 mmol). Mescolare la reazione per 1 h, consentendo a caldo lentamente a temperatura ambiente.
    7. Rimuovere il solvente su un collettore di gas sotto vuoto dotato di basso vuoto (20-25 Torr) per ottenere la miscela di prodotto grezzo.
    8. In un vano portaoggetti,isolare il prodotto tramite cromatografia su gel di silice colonna, utilizzando 2-metilbutano come eluente. Rimuovere il volatile un collettore di gas sotto vuoto equipaggiato con un vuoto attenuata per ottenere il prodotto puro come un liquido incolore.
      NOTA: La resa è del 56%.

2. preparazione proteina e cristallizzazione di T4 lisozima Mutanti

  1. espressione della proteina e purificazione
    1. Crescere le cellule di E. coli RR1 trasformate con i plasmidi subclonati (L99A o L99A / M102Q) 17, 20 in 200 mL LB (Terreno di Luria Bertani) multimediali integrati con 40,0 mg di ampicillina a 37 ° C per 12 h.
      NOTA: La composizione di LB media è 12 g di triptone, 5 g di estratto di lievito, cloruro di sodio 10 g, 1 g di glucosio per 1 LH 2 O.
    2. Seminare 4,00 L LB supporti (integrato con 800 mg ampicillina) con 160 ml di coltura durante la notte e incubare a 37 ° C a 240 rpm con una filterealimentazione aria d.
    3. Quando la densità ottica raggiunge 0,7 a 600 nm, raffreddare la coltura batterica a temperatura ambiente rimuovendolo dal termostato.
    4. Misurare 695 mg di isopropil-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (concentrazione finale di 0,7 mM) in una provetta conica e centrifugazione aggiungere 4 mL mezzi LB a dissolversi.
    5. Aggiungere la soluzione IPTG alla cultura di indurre l'espressione della proteina. Incubare le culture a 110 giri al minuto per 21 ore a 25 ° C.
    6. Centrifugare la coltura a 4.412 xg per 30 min a 4 ° C. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 300 ml di 0,1 M sodio fosfato (pH 6,6), 0,2 M NaCl e aggiungere 30,0 ml di 0,5 M di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (pH 8,0). Mescolare la sospensione per 17 ore a 4 ° C.
    7. Aggiungere 30,0 ml di 1,0 M MgCl 2 e 0.500 ml di desossiribonucleasi I (DNasi I) alla sospensione e agitare a temperatura ambiente per 8 h.
    8. Centrifugare la sospensione cellulare lisate a 30.913 xg per 30 min a 4 76; C. Raccogliere il surnatante contenente proteina espressa e scartare il pellet.
    9. Dializzare lisato contro 20 mM sodio fosfato (pH 6.5 per L99A e pH 6.3 per L99A / M102Q) a 4 ° C durante la notte.
    10. Lavare ed equilibrare 20,0 mL di perline scambio ionico carbossimetilici con tampone di equilibrazione (50 mM Tris, 1 mM EDTA (pH 7,3)) in una colonna. Caricare la proteina soluzione contenente sulle perline e lavare la colonna con 100 mL di tampone di equilibrazione. Eluire la colonna con un gradiente mL 600 lineare di 300 mM NaCl nel tampone di equilibrazione.
    11. Utilizzare un sistema di cromatografia a bassa pressione per la purificazione colonna. Utilizzare un tasso pompa di 1 ml / min e raccogliere frazioni di 10 ml. Raccogliere le frazioni contenenti proteine ​​pure.
      NOTA: Durante l'eluizione, monitorare la densità ottica (OD) a 280 nm per verificare la presenza della proteina. Determinare la purezza di ogni frazione mediante SDS-PAGE e raccogliere solo le frazioni più puri.
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Figura 3: Risultati rappresentativi per la purificazione di proteine di T4 lisozima mutante L99A / M102Q. A) Chromatogram che mostra l'assorbanza UV misurata in AU a 280 nm (linea blu) e conducibilità in / cm (linea rossa Ms). Le frazioni 20-23 sono stati combinati e la purezza è stata determinata mediante SDS-PAGE. B) 15% gel SDS-PAGE mostra la presenza di proteine purificate di frazioni 20-23 a 18,6 kDa. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

  1. Proteine ​​cristallizzazione
    1. Trasferire la soluzione proteica purificata ad un tubo membrana di dialisi (12.000 a 14.000 MWCO). Posizionare il tubo di dialisi in un becher contenente 4,00 L di 100 mM sodio fosfato, 550 mM NaCl, 0,02% NaN 3 (pH 6.5 per L99A e pH 6.3 per L99A / M102). Agitare la soluzione 4 L notte a 4 ° C.
    2. Aggiungere 2-mercaptoetanolo (concentrazione finale di 5 mM) al campione dializzato e concentrato a ~ 40,0 mg / ml usando un concentratore centrifugo (10.000 MWCO). Determinare la concentrazione di proteine ​​misurando l'assorbimento a 280 nm. Rimuovere l'eventuale precipitato dal giro prima di cristallizzazione.
    3. Utilizzare il metodo appeso-drop vapore diffusione per la cristallizzazione delle proteine. Mescolare 5,00 ml di soluzione proteica concentrata con 5,00 ml di soluzione di riserva (2.0-2.2 fosfato M sodio / potassio, pH 6,7-7,1, 50 mm 2-mercaptoetanolo, 50 mm 2-idrossietil disolfuro) su un vetrino siliconato copertura in vetro.
    4. Equilibrare la goccia miscela contro 1,00 mL della soluzione serbatoio posizionando il coperchio scorrevole capovolta sulla parte superiore della soluzione serbatoio ciascun pozzetto contenente. Utilizzare grasso per sigillare ermeticamente ogni pozzetto con la slitta. Impostare varie condizioni utilizzando un 24-pozzetti con la soluzione serbatoio indicato al 2.2.3.Conservare la piastra a 4 ° C per la crescita di cristalli.
      NOTA: I cristalli crescono normalmente entro 1-2 settimane nel buffer Equilibrated sul vetrino di copertura. immediata precipitazione durante la miscelazione soluzione proteica con la soluzione serbatoio nel passaggio 2.2.3 indica un fallimento di cristallizzazione.

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Figura 4: quadro rappresentativo di cristalli di T4 lisozima L99A mutante prima di complessazione con leganti. I cristalli sono nelle acque madri (2,1 M di sodio / potassio fosfato, pH 6,9, 50 mM 2-mercaptoetanolo, 50 mM 2-idrossietil bisolfuro). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

  1. preparazione Complex
    1. Raccogliere i cristalli utilizzando un tubo criogenico a forma in un ciclo (vedi Materiali List) emetterli in una provetta 0,6 microcentrifuga. Aggiungere 50,0 ml di soluzione madre al tubo per evitare secchezza e preservare i cristalli.
      NOTA: selezione cristallo singolo è aiutato utilizzando un microscopio.
    2. Trasferire la provetta contenente cristalli in un vano portaoggetti. Prendere 5,00 ml del ligando azaborine (5) e posto all'interno dello snap-cap del tubo. Cap e conservare il tubo in frigorifero (4 ° C) nel vano portaoggetti per 2-7 giorni per equilibrazione dalla diffusione del vapore.
      NOTA: Le proprietà fisiche (alta volatilità e solubilità in soluzione acquosa) del ligando azaborine (5) consente la complessazione con i cristalli proteici preformati mediante metodo diffusione del vapore.
    3. Trasferire i cristalli utilizzando un tubo criogenico forma in un ciclo per un vetrino contenente una goccia di N-paratone prima flash congelamento in azoto liquido. Scegliere il cristallo protetto con N-paratone e rapidamente flash-freeze immergendo il cristallo suanello in un dewar contenente azoto liquido. Montare il cristallo sul ciclo utilizzando una pinza criogenico.
    4. Raccogliere set di dati di un singolo cristallo utilizzando la radiazione di sincrotrone. Eseguire la sostituzione molecolare utilizzando strutture pubblicati 20, 24; verificare l'esistenza del ligando all'interno del sito di legame della proteina da un blob non-modellato di densità elettronica.

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Figura 5: modelli atomici di T4 lisozima mutante L99A tasca di legame con densità elettronica. A) della cavità L99A con una densità elettronica blob non-modellato nel sito di legame. B) della cavità L99A con il ligando azaborine modellata 5 in due conformeri alternative. Si prega di click qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Risultati

La via sintetica schema per 1,2-azaborines è mostrato in Figura 1. Questo protocollo si applica alla sintesi di cinque diverse molecole boro contenenti azoto. Figura 2 rappresenta 11 B NMR spettri misurati nel corso del passo 1.3 per monitorare la formazione del prodotto desiderato (3). Purificazione di proteine è stata effettuata utilizzando il sistema di cromatografia a bassa pressione ed un cromatogramma rappresentativo è m...

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Discussione

Nella prima parte di questo protocollo, abbiamo descritto una sintesi modificata del 1,2-azaborines basate su metodi precedentemente riportati 12, 13. Triallylborane 22 è stato utilizzato come sostituto per le rotte che utilizzano allyltriphenyl stagno o di potassio allyltrifluoroborate per preparare N -allyl- N -TBS- B -allyl cloruro addotto (1). Questo metodo consente un approccio più atomi-ec...

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Dichiarazioni

Tutti gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti in questo manoscritto.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata supportata dal National Institutes of Health NIGMS (R01-GM094541) e dal Boston College.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Tetraidrofurano (THF), senza inibitori, per HPLC, ≥ 99,9%Sigma Aldrich34865
Etere dietilico (Et2O), per HPLC, ≥ 99,9%, senza inibitoriSigma Aldrich309966
cloruro di metilene  (CH2Cl2), (ACS stabilizzato/certificato)FisherD37-20
TolueneFisherT290-4
Pentano, HPLCFisherP399-4
AcetonitrileFisherA21-4
Idruro di calcio (CaH2), grado reagente, 95%Sigma Aldrich208027Palladio piroforico
su carbone attivo (Pd/C), 10% in peso PdStrem46-1900
1,0 M Soluzione di tricloruro di boro in esanoSigma Aldrich211249altamente tossico/piroforico
, ≥ 99,5%Catalizzatore di generazione Sigma Aldrich471283
Grubbs 1st materiaC823
AcetamideSigma AldrichA0500
n-butanolo, anidro, 99,8%Sigma Aldrich281549
soluzione di etillitio, 0,5  M in benzene/cicloesanoSigma Aldrich561452altamente tossica/piroforica
, 2,0 M in Et2OSigma Aldrich455180
2-metilbutano, anidro, ≥ 99%Sigma Aldrich277258
Escherichia coli, (Migula) Castellani e Chalmers (ATCC® 31343™)ATCC31343
Lisozima T4 WT* (L99A)Addgene18476
T4 lisozima mutante (S38D, L99A, M102Q, N144D)Addgene18477
Ampicillina sale sodicoSigma AldrichA0166
isopropil-beta;-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) InvitrogenAM9464
Fosfato di sodio monobasico anidroFisherBP329
Fosfato di sodio bibasico anidroFisherBP332
Cloruro di sodioFisherS642212 
Acido etilendiamminotetraaceticoFisherBP118
Cloruro di magnesioSigma AldrichM4880Corrosivo
Thermo scientifico pierce DNaseIFisherPI-90083
GE Healthcare  Terreni di scambio cationico a flusso rapido di sefarosioFisher45-002-931
Tris-baseFisherBP152-500 
Aziduro di sodioTCIS0489
2-MercaptoetanoloFisher ICN806443 
Sartorius  Concentratori centrifughi Vivaspin 20Fisher14-558-501
Fosfato di potassio monobasicoSigmaAldrich P5379
2-idrossietildisolfuroSigma Aldrich380474
N-paratone Hampton ResearchHR2-643
4 tubi a membrana per dialisi RC da 12.000 a 14.000 Dalton MWCO Fisher08-667E
  TuboHampton Researcha forma di anello
CryoTongThermo Fisherpinza criogenica
Folagaimmagini della densità elettronica sono generate dal software
Trietilammina Soluzione HCl altamente tossico criogenico CryoLoop Le

Riferimenti

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