Questo protocollo descrive un test per misurare la funzione CFTR e le risposte del modulatore CFTR in tessuti coltivati da soggetti con fibrosi cistica (FC). Gli organoidi intestinali derivati dalla biopsia si gonfiano in modo guidato dal cAMP, una risposta che è difettosa (o fortemente ridotta) negli organoidi FC e può essere ripristinata dall'esposizione ai modulatori CFTR.
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Articolo metodologico
Forskolin indotta Gonfiore intestinale organoidi: An
In questo articolo
Sommario
Abstract
I farmaci che modulano il regolatore della conduttanza transmembrana (CFTR) per la fibrosi cistica sviluppati di recente correggono l'espressione superficiale e/o la funzione del canale CFTR mutante in soggetti con fibrosi cistica (FC). L'identificazione dei soggetti che possono beneficiare di questi farmaci è difficile a causa dell'ampia eterogeneità delle mutazioni CFTR, nonché di altri fattori sconosciuti che contribuiscono all'efficacia dei singoli farmaci. Qui, descriviamo un test semplice e relativamente rapido per misurare la funzione e la risposta individuale del CFTR ai modulatori CFTR in vitro. Gli organoidi epiteliali tridimensionali (3D) vengono coltivati da biopsie rettali in terreno organoidico standard. Una volta stabiliti, gli organoidi possono essere biobancarizzati per analisi future. Per il saggio, 30-80 organoidi vengono seminati in piastre a 96 pozzetti nella matrice della membrana basale e vengono quindi esposti a farmaci. Il giorno dopo, gli organoidi vengono colorati con verde calceina e il rigonfiamento indotto dalla forskolina viene monitorato mediante microscopia confocale su cellule vive a 37 °C. Il rigonfiamento indotto dalla forskolina è completamente dipendente dal CFTR ed è sufficientemente sensibile e preciso da consentire la discriminazione tra le risposte ai farmaci di individui con mutazioni CFTR diverse e persino identiche. Le risposte di rigonfiamento in vitro sono correlate alla risposta clinica alla terapia. Questo test fornisce un approccio economicamente vantaggioso per l'identificazione di individui responsivi ai farmaci, indipendentemente dalle loro mutazioni CFTR. Potrebbe anche essere determinante per lo sviluppo di futuri modulatori CFTR.
Introduzione
CF è causata da mutazioni nel gene della fibrosi cistica regolatore della conduttanza transmembrana (CFTR), che codifica per un canale anionico epiteliale. CF colpisce circa 85.000 persone in tutto il mondo 1. Oltre 2.000 mutazioni CFTR sono state identificate ( www.genet.sickkids.on.ca ). Questa diversità spiega in parte un ampio spettro di fenotipi della malattia osservati ( www.CFTR2.org ) 2, 3. Sei classi di mutazioni CFTR sono definiti in base alla loro effetto sulla espressione della protein....
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Protocollo
Tutti sperimentazione utilizzando tessuti umani qui descritti è stato approvato dal Comitato Etico presso University Medical Center di Utrecht (UMCU; TcBio # 14-008). Il consenso informato per la raccolta dei tessuti, la generazione, la conservazione e l'uso delle organoidi è stato ottenuto dai pazienti a Hospital (WKZ) -UMCU Wilhelmina bambini.
| attrezzatura | consumabili | Utensili |
| cappa a flusso laminare | 15 e 50 ml provette coniche | Zeiss LSM 800 - Z.... |
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Risultati
La figura 1A mostra un isolamento rappresentante fresco di cripte incorporati su BMM. Le cripte sono da una biopsia del colon-retto di un soggetto CF. Di solito, un organoide è generato da ogni cripta (Figura 1A - C). A causa della disfunzione del CFTR, la maggior parte dei organoidi colon CF non sono cistica, ma piuttosto sono compatti e con proiezioni e buddings (Figura 2A - 2B). Tuttavia, alcuni CF or.......
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Discussione
Qui, forniamo un protocollo completo per la generazione, l'espansione, il congelamento, lo scongelamento e di organoidi colorettali umani. Mentre abbiamo stabilito le culture umane organoide qualche tempo fa 17, è a volte dimostrato difficile stabilire la tecnologia in altri laboratori, senza una formazione pratica. Prevediamo che questi protocolli sostituiranno tale formazione.
Wnt-3A-condizionata mezzo è uno dei reagenti più importanti al fine di riuscire a stab.......
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Dichiarazioni
Hans Clevers è un inventore di brevetti per la coltura di organoidi e il saggio di rigonfiamento indotto da Forskolina. Jeffrey M Beekman è un inventore di un brevetto per il test di rigonfiamento indotto da Forskolina. Sylvia F Boj e Robert Vries lavorano presso la Foundation Hubrecht Organoid Technology (HUB), che detiene la licenza esclusiva per la Organoid Technology. Per il resto, gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal programma HIT-CF della olandese CF fondazione (NCFS), ZonMw (40-00812-98-14103), Fondo di ricerca dell'ospedale dei bambini di Wilhelmina e CZ, e Zilverenkruis / Achmea. Vorremmo ringraziare S. Heida-Michel, M. Geerdink, KM de Winter-de Groot, e G. Berkers (Dipartimento di Pneumologia Pediatrica, Ospedale Wilhelmina bambini, UMC Utrecht), e RHJ Houwen (Dipartimento di Gastroenterologia Pediatrica, Wilhelmina Ospedale pediatrico, UMC Utrecht) per avvicinare i pazienti e ottenere le biopsie per la generazione di un CF Biobank.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Dulbecco' avanzato s Medium Modified Eagles con miscela di nutrienti F-12 Prosciutti (Ad-DF) 500 ml | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #12634 | conservato a 4 gradi C |
| GlutaMax | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #35050 | conservato a 4 gradi C |
| Hepes | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | # 15630-056 | memorizzato a 4 gradi |
| C Penicillina/Streptomicina | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #15140-122 | conservato a -20 gradi Piastra |
| coltura C 96 pozzetti | Cellstar | #655180 | |
| Piastra di coltura a 24 pozzetti | Cellstar | #662160 | |
| Piastra di coltura a 6 pozzetti | Cellstar | #657160 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (-) CaCl2 (-) MgCl2) (DPBS) | Life Technologies: Gibco | #14190-094 | conservato a 4 ° C |
| Dulbecco' s Aquile modificate medie (DMEM) 500 ml | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #31966-021 | Per la produzione media condizionata Wnt-3A. Immagazzinato a 4 gradi C |
| Siero fetale bovino (FBS) | Bovogen | #SFBS LOT # 11113 | per la produzione di mezzi condizionati Wnt-3A. Immagazzinato a -20 ° C |
| L Wnt3A linea cellulare | ATCC | #CRL-2647 | Per la produzione di mezzi di trattamento Wnt-3A. |
| Plasmidi TOP/FOP | Millipore | #17-285 | Per misurare l'attività Wnt |
| pTK-Renilla | Promega | #E2241 | Per misurare l'attività Wnt |
| HEK-293 | ATCC | #CRL-1573 | Per misurare l'attività Wnt |
| saggio reporter a doppia luciferasi | Promega | #E1910 | Per misurare l'attività Wnt |
| Zeocin | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #R250-01 | la selezione della linea cellulare Wnt-3A |
| Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #17504-044 | conservato a -20 gradi C | |
| N-Acetilcisteina | Sigma Aldrich | #A9165-5G | conservato a -20 ° C |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | #N0636 | conservato a -20 gradi C |
| Fattore di crescita epiteliale umano (hEGF) | PrepoTech | #AF-100-15 | conservato a -20 gradi C |
| Gastrin | Sigma Aldrich | #G9145 | conservato a -20 gradi C |
| Inibitore del recettore del TGFb tipo I (A83-01) | Tocris | #2939 | conservato a -20 gradi C |
| Y-27632 dicloridrato (RhoKi) | Selleckchem | #S1049 | conservato a -20 ° C |
| p38 Inibitore MAPK (p38i) (SB202190) | Sigma Aldrich | #S7067 | conservato a -20 ° C |
| Primocin | InvivoGen | #ant-pm-1 | conservato a -20 gradi C |
| Human Noggin (hNoggin) | PrepoTech | #120-10C | stoccato a -20 ° C |
| R-spondina umana 3 (hRspo-3) | R& D Systems | #3500-RS/CF | immagazzinato a -20 ° C |
| Vancomicina | Sigma Aldrich | #861987- 250mg | conservato a -20 ° C |
| Gentamycin | Life Technologies: Gibco | #15710-049 | conservato a -20 ° C |
| Acido etilendiammina tetraacetico (EDTA) | Sigma Aldrich | #431788 | Conservato a 4 gradi C |
| Matrigel | Corning | #354230 | conservato a -80 gradi C |
| TryplE Express | Life Technologies: Gibco | #12605-010 | per organoidi tripsinizzanti per il congelamento |
| Congelamento di colture cellulari di recupero Medium | Life Technologies: Gibco | #12648010 | per il congelamento |
| di Calcein | Life Technologies: Gibco | #C3100MP | conservato a -20 ° C |
| Forskolin | R& D Systems | #1099-50 mg | conservato a -80 ° C |
| Lumacaftor (VX-809) | Selleckchem | #s1565 | conservato a -80 ° C |
| Ivacaftor (VX-770) | Selleckchem | #s1144 | immagazzinato a -80 ° C |
| Nome dei reagenti/Materiale | Solvent | Concentrazione stock | Concentrazione finale |
| GlutaMax | 200 mM | 2 mM | |
| Hepes | 1 M | 10 mM | |
| Penicillina/Streptomicina | 10K U/ml 10K µ g/ml | 100 U/ml 100 µ g/ml | |
| di zeocina | 100 mg/ml | 125 & micro; g/ml | |
| di integratore di B27 | 100x | 1x | |
| N-acetilcisteina | MiliQ H2O | 500 mM | |
| Nicotinamide | DPBS | 1 M | 10 |
| mM Fattore di crescita epiteliale umano (hEGF) | DPBS 0,1% BSA | 0,5 mg/ml | 50 ng/ml |
| Gastrin | DPBS | 100 &; M | 10 nM |
| TGFb tipo I Inibitore del recettore (A83-01) | DMSO | 5 mM | 500 nM |
| Y-27632 dicloridrato (RhoKi) | DMSO | 10 mM | 10 µ M |
| p38 Inibitore di MAPK (p38i) (SB202190) | DMSO | 30 mM | 10 µ M |
| Primocin | 50 mg/ml | 100 µ g/ml | |
| Noggin umano (hNoggin) | DPBS 0,1%BSA | 100 µ g/ml | 100 ng/ml |
| R-spondina umana 3 (hRspo-3) | varia per lotto | 300 ng/ml | |
| Vancomicina | 10 mg/ml | 50 &; g/ml | |
| Gentamicina | 10 mg/ml | 50 µ g/ml | |
| Acido etilendiammina tetraacetico (EDTA) | MiliQ H2O | 0,5 M | 2 mM |
| Calceina | DMSO | 10 &; g/ml | 3,3 ng/ml |
| Forskolina | DMSO | 10 mM | variabile |
| Lumacaftor (VX-809) | DMSO | 20 | mM variabile |
| Ivacaftor (VX-770) | DMSO | 20 | mM variabile |
Riferimenti
- De Boeck, K., Amaral, M. D. Progress in therapies for cystic fibrosis. Lancet Respir Med. 4 (8), 662-674 (2016).
- Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Rev Genet. 16 (1), 45-56 (2015).
- ....
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Ristampe e permessi
