Misurazione simultanea di mitocondriale calcio e mitocondriale potenziale di membrana in cellule vive di Microscopia fluorescente

Sommario

I mitocondri possono utilizzare il potenziale elettrochimico attraverso la loro membrana interna (Δ _Ψm) di sequestrare il calcio (Ca ^2+), permettendo loro di modellare Ca citosolico ^{2 +} Segnalazione all'interno della cellula. Descriviamo un metodo per misurare simultaneamente i mitocondri Ca ²⁺ di assorbimento e ΔΨ _m in cellule vive con coloranti fluorescenti e microscopia confocale.

Abstract

Oltre al loro ruolo fondamentale nel generare ATP, i mitocondri fungono anche da calcio locale (Ca ²⁺⁾ buffer per regolare strettamente concentrazione intracellulare di Ca ^2+. Per fare questo, mitocondri utilizzano il potenziale elettrochimico attraverso la membrana interna (ΔΨ _m) di sequestrare Ca ^2+. L'afflusso di Ca ²⁺ nei mitocondri stimola tre deidrogenasi rate-limiting del ciclo dell'acido citrico, aumentare il trasferimento di elettroni attraverso la fosforilazione ossidativa (OXPHOS) complessi. Questa stimolazione mantiene ΔΨ _m, che viene temporaneamente dissipata come gli ioni di calcio positivi attraversare la membrana mitocondriale interna nella matrice mitocondriale.

Descriviamo qui un metodo per misurare simultaneamente i mitocondri Ca ²⁺ di assorbimento e ΔΨ _m in cellule vive usando la microscopia confocale. Con permeabilizzante le cellule, Ca ²⁺ mitocondriale puòessere misurata utilizzando la fluorescenza Ca ²⁺ indicatore Fluo-4, AM, con la misura di _m ΔΨ utilizzando il tetramethylrhodamine colorante fluorescente, estere metilico, perclorato (TMRM). Il vantaggio di questo sistema è che c'è poca sovrapposizione spettrale tra i coloranti fluorescenti, consentendo una misurazione precisa della mitocondriale Ca ²⁺ e ΔΨ _m simultaneamente. Utilizzando l'aggiunta sequenziale di Ca ²⁺ aliquote, Ca ²⁺ mitocondriale assorbimento possono essere monitorati, e la concentrazione alla quale Ca ²⁺ induce mitocondriale transizione di permeabilità della membrana e la perdita di ΔΨ _M determinato.

Introduzione

I mitocondri svolgono un ruolo importante nella regolazione intracellulare concentrazione di Ca ^2+, agendo come locali Ca ²⁺ buffer ^1. Ca ²⁺ entra nei mitocondri attraverso il Ca ²⁺ uniporter, un processo guidato dal gradiente elettrochimico che esiste attraverso la membrana mitocondriale interna (ΔΨ _m) ^2. Una volta all'interno della matrice mitocondriale, Ca ²⁺ può attivare fosforilazione ossidativa stimolando tre deidrogenasi rate-limiting del ciclo dell'acido citrico ^3. Questa stimolazione mantiene ΔΨ _m, che v....

Protocollo

1. Preparazione di cellule

1. Crescere le cellule in 10 cm piatti di coltura cellulare o 75 cm ² palloni in terreni di coltura [10 ml di Dulbecco Eagles Modificati (DMEM) integrato con il 5% (v / v) di siero fetale bovino (FBS) e 1x penicillina / streptomicina (p / s )] a 37 ° C / 5% CO _2.
2. Per raccogliere le cellule, rimuovere il supporto per aspirazione, quindi lavare con 5 ml di 1x tampone fosfato (PBS 1x). Rimuovere 1x PBS mediante aspirazione, quindi aggiungere 1,5 ml di 0,25% (w / v) Tripsina / 0,25% (w / v) di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e incubare a 37 ° C / 5% di CO ₂ per 2 min. Toccare piatto o p....

Risultati

Abbiamo usato questo protocollo per esaminare gli effetti di una mutazione MT-ND5 sulla capacità dei mitocondri delle cellule 143B per tamponare gli aumenti di calcio ^12. Nell'esempio mostrato qui, le cellule 143B di controllo sono stati caricati con TMRM e Fluo-4, sono davanti a permeabilizzazione con digitonina. Dopo 5 minuti di immagini, otto aggiunte sequenziali di un diluizione 1: 100 di 40 mm esogeni CaCl ₂ sono stati fatti, con la co.......

Discussione

Il calcio gioca un ruolo fondamentale in molti processi cellulari, tra cui la contrazione muscolare, la segnalazione neuronale e proliferazione cellulare ^13. Aumento delle concentrazioni di calcio delle cellule sono spesso associati con la domanda di energia, con il calcio in grado di stimolare direttamente fosforilazione ossidativa mitocondriale per aumentare la produzione di ATP ^3. E 'quindi essenziale che abbiamo la capacità di controllare efficacemente l'accumu.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	ThermoFisher	10566016
siero fetale bovino (FBS)	ThermoFisher	16000044
1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	ThermoFisher	10010023
100x penicillina/streptomicina (p/s)	ThermoFisher	15140122
0,25% tripsina/0,25% EDTA	ThermoFisher
vetrino coprioggetti a 8 pozzetti	ibidi	80826
NaCl	Sigma-Aldrich	793566
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
MgSO4	Sigma-Aldrich	746452
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488
D-glucosio	Sigma-Aldrich	G8270
CaCl2	Sigma-Aldrich	746495
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
HEDTA	Sigma-Aldrich	H8126
malato	Sigma-Aldrich	M1000
glutammato	Sigma-Aldrich	G1626
ADP	Sigma-Aldrich	A5285
Ca2+ senza Hank' s soluzione salina tamponata (HBSS)	ThermoFisher	14175-095
tetrametilrodamina, estere metilico, perclorato (TMRM)	ThermoFisher	T668
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629
Fluo-4 acetossimetilestere (Fluo-4, AM)	ThermoFisher	F14201
dimetil solfossido (DMSO)	ThermoFisher	D12345
cianuro di carbonile p-trifluorometossifenilidrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
digitonin	Sigma-Aldrich	D141
thapsigargin	Sigma-Aldrich	T9033
Pluronic F-127	ThermoFisher	P3000MP
ematocitometro	VWR	631-0925
piastre per colture cellulari da 10 cm	Fiasche per colture cellulari Corning	COR430167
75 cm2	Corning	COR430641

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