Abbiamo sviluppato una preparazione fetta orizzontale della retina di mammifero adulto con il piano di sezionamento parallelo alla superficie della retina. campi dendritiche di neuroni della retina nonradially orientate non sono stati troncati, consentendo lo studio di elaborazione dei segnali con tecniche di patch-clamp e di imaging.
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Articolo metodologico
Preparazione di orizzontali Fette di topo adulto Retina per elettrofisiologiche Studi
In questo articolo
Sommario
Abstract
preparati fetta verticali sono ben stabiliti per studiare i circuiti e la trasmissione del segnale nella retina dei mammiferi adulti. Il piano di sezionamento in queste preparazioni è perpendicolare alla superficie della retina, che lo rende ideale per lo studio dei neuroni orientate radialmente come fotorecettori e cellule bipolari. Tuttavia, le grandi pergole dendritiche di cellule orizzontali, cellule amacrine in tutto il campo, e le cellule gangliari sono per lo più troncati, lasciando marcatamente ridotta attività sinaptica in queste cellule. Mentre le cellule gangliari e le cellule amacrine sfollati possono essere studiati in un preparato tutto montato della retina, cellule orizzontali e le cellule amacrine situate nello strato nucleare interno sono solo scarsamente accessibili per gli elettrodi in tutto il tessuto della retina.
Per ottenere la massima accessibilità e l'integrità sinaptica, abbiamo sviluppato una preparazione fetta orizzontale della retina di topo, e studiato la trasmissione del segnale alla sinapsi tra i fotorecettori e orizzontalecellule. sezionamento orizzontale consente (1) facile e univoca identificazione visiva dei corpi cellulari orizzontali per l'elettrodo il targeting, e (2) la conservazione dei campi dendritiche cellule orizzontale estesa, come un prerequisito per integro e funzionale cono di ingresso sinaptico a dendriti delle cellule orizzontali.
cellule orizzontali da fette orizzontali esposte attività sinaptica tonica nel buio, e hanno risposto a brevi lampi di luce, con una riduzione di attività sinaptica verso l'interno attuale e diminuita. evidenza immunocitochimica indica che quasi tutti i coni nel campo dendritica di una cella orizzontale stabiliscono sinapsi con i dendriti periferici. La preparazione fetta orizzontale è quindi adatto per studiare le proprietà fisiologiche dei neuroni della retina distese orizzontalmente, nonché la trasmissione del segnale sensoriale e l'integrazione attraverso le sinapsi selezionati.
Introduzione
informazioni visive è codificata come un modello dinamico spazio-temporale dell'attivazione fotorecettori, e la sinapsi nastro tra fotorecettori e neuroni di secondo ordine determina il trasferimento valle di informazioni visive. La preparazione fetta verticale della retina dei mammiferi è uno strumento molto utile per studiare l'elaborazione del segnale nei percorsi verticali, cioè tra fotorecettori e cellule bipolari, e tra le cellule bipolari e alcuni tipi di cellule amacrine 1, 2, 3, 4.
Tuttavia, sezionamento verticale determina sempre gravi troncamento dei campi dendritiche di molti neuroni della retina, con conseguente notevole perdita di contatti sinaptici. Soprattutto nella retina esterna, cellule orizzontali sono colpiti a causa delle loro campi dendritiche estesi lateralmente diffondersi e sistemi terminali assone 5. In verticalepreparazione fetta, l'ingresso sinaptico di centinaia di terminali cono fotorecettori ai dendriti di una cellula orizzontale è così ridotto a un paio di contatti sparsi. Questo potrebbe essere sufficiente per studiare le proprietà delle singole sinapsi, ma lo fa in nessun modo rappresentano le capacità di elaborazione del segnale alla base l'attivazione sincronizzata delle sinapsi nastro fotorecettori.
Abbiamo quindi sviluppato una preparazione fetta orizzontale, che lascia quasi tutto il fotorecettore cono di ingresso sinaptica di dendriti di cellule orizzontali intatte e funzionali. Il piano di piste sezionamento parallela alla superficie della retina, idealmente taglio attraverso lo strato nucleare interno tra cellule orizzontali e le cellule amacrine. Così, fette orizzontali della retina esterna vengono creati contenenti, sul sito presinaptica, fotorecettori con segmenti interni ed esterni, nonché terminali sinaptici, e cellule orizzontali e cellule bipolari sul sito postsinaptico. Questa preparazione è adatto to indagare ingressi sinaptici coordinati in dendriti delle cellule orizzontali da tutti i fotorecettori cono all'interno del suo campo dendritiche. E quindi potrebbe rivelarsi utile per comprendere meglio il funzionamento della sinapsi nastro fotorecettore, che è cruciale per il trasferimento di informazioni visive dalla matrice di attivazione dei fotorecettori in una risposta post-sinaptica.
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Protocollo
Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con le linee guida per gli esperimenti sugli animali emessi dalla Repubblica federale di Germania.
Nota: Poiché il tessuto retinico sarà privo di ossigeno durante prolungate parti di questa procedura, tutti i passaggi devono essere eseguiti più velocemente possibile. I topi dovrebbero essere adattata al buio di almeno 3 ore prima della dissezione. Per evitare la luce adattamento della retina, la preparazione e taglio deve essere effettuata sotto la luce rossa fioca.
1. Preparazione di media e altre sostanze chimiche
- Preparare Ames 'Medium 6. Dopo la dissezione, immergere il tessuto retinico in Medio Ames 'in ogni momento.
- Sciogliere 2,2 g di Ames 'Medium e 298 mg HEPES in 250 ml di acqua distillata. La concentrazione di HEPES sarà di 5 mM. Mescolare delicatamente fino a quando tutte le particelle sono dissolti.
- Bubble Ames 'Piano a temperatura ambiente con CarboGen (95% di ossigeno, 5% autoanidride bon) per almeno 5 minuti. CarboGen di alimentazione con una pipetta Pasteur di vetro alla soluzione. Collegare la pipetta Pasteur tramite tubazione appropriata all'uscita del regolatore di gas.
- Aggiungere 475 mg di bicarbonato di sodio alla soluzione. L'aggiunta di bicarbonato dopo gorgogliamento impedisce la precipitazione di carbonato di calcio.
- Preparare a bassa temperatura agarosio gelificazione. Agarosio è necessaria per l'integrazione del tessuto retinico durante vibratome sezionamento.
- Sciogliere 180 mg agarosio in 9 ml di Ames 'Medium e 1 ml di acqua distillata. Utilizzare un forno a microonde per riscaldare lentamente la soluzione di agarosio fino a quando tutti i solidi sono dissolti. Il calore in 5 - 10 sec incrementi per evitare l'overflow. Soluzione deve essere chiara e trasparente.
- Conservare disciolto agarosio a bagnomaria a 37 ° C per la durata della procedura.
2. Impostazione del Vibratome
NOTA: Tutti sezionamento è stata effettuata con ilvibratome elencati nella tabella materiali. Le date impostazioni si riferiscono a questo tipo di solo vibratome. Per ulteriori dettagli su vibratomo sezionamento del tessuto neurale si rimanda per fare riferimento a 7.
- Posizionare vibratome lama iniettore nella porta lama.
- Misurare deflessione verticale della lama con il dispositivo "Vibrocheck". Utilizzare la vite di regolazione sul portalama per inclinare la lama finché non è parallela al piano di taglio. L'esatto posizionamento della lama è necessario per prevenire effetti veneziane sulla superficie sezione e per produrre un tratto piano che contiene cellule viventi sulla sua superficie.
- Impostare vibratome alle seguenti impostazioni: ampiezza, 1.00; Velocità, 0.20; spessore 180 - 200 micron.
3. La dissezione del mouse Retina
- Anestetizzare adulti C57BL / 6 del mouse per la vaporizzazione di circa 1 ml di isoflurano in un contenitore a tenuta d'aria. Quando l'anestesia è completa, l'eutanasia degli animali da dislocazione cervicale. Ilmouse non dovrebbe essere più di 3 mesi, altrimenti la qualità delle fette peggiorerà.
- Rimuovere bulbo oculare mettendo una pinza curva sotto l'occhio. Delicatamente sollevare il bulbo oculare esporrà il nervo ottico. Tagliare il nervo ottico, con una forbice molla e trasferire la palla occhio di una capsula di Petri 35 millimetri contenente 2 ml di Ames 'Medium.
- Eseguire tutti i passaggi successivi sul palco di un microscopio stereo. Regolare l'ingrandimento ad un valore che consente il controllo visivo ottimale delle seguenti procedure (passi 3.4 - 3.9) si.
- Forare la cornea al passaggio alla sclera con una pinza a punta o con un ago 20 G. Durante questa fase, ferma la palla con un altro occhio pinze. Fare attenzione a non danneggiare la retina con il dispositivo punzonamento.
- Inserire le forbici primavera nel piccolo foro praticato nel punto 3.3 e tagliare un cerchio intorno alla cornea. Anche in questo caso, ferma la palla occhio con una pinza durante il taglio. Mantenere l'incisione molto vicino alla superficie per non cut nella retina.
- Rimuovere con attenzione cornea, lenti e corpo vitreo con una pinza. Il corpo vitreo comprende uno strato sottile trasparente nella parte posteriore dell'occhio. Tuttavia, è essenziale per vibratome sezionamento che il corpo vitreo è completamente rimosso.
- Nella capsula di Petri, posizionare l'oculare in modo che si guarda attraverso il foro in basso sulla retina. Il bordo dell'apertura dovrebbe consistere soltanto il tessuto sclerale. Se il taglio circolare (passo 3.4) è stata effettuata troppo vicino all'equatore del oculare, tessuto retinico sarà presente anche vicino all'incisione. Fate attenzione quindi a non danneggiare la retina al punto 3.8.
- Afferra la sclera con una pinza e strappare con cura il tessuto a parte. È essenziale non rottura retina durante questa fase. Se necessario, staccare la retina dalla serrata per stabilizzare la parte sclerale del tessuto con le pinze e con attenzione si staccava la retina con le altre pinze. Mantenere la pinza chiusi; mai gestire il retina con una pinza in quanto il tessuto è molto morbido e darà atto immediatamente.
NOTA: A questo punto, la retina e il resto della conchiglia oculare sarà collegato solo alla testa del nervo ottico. - Tagliare il sito di attacco alla testa del nervo ottico con le forbici a molla. La retina dovrebbe ora essere liberamente fluttuante in un unico pezzo di tessuto in media Ames '.
- Tagliare la retina in 4 - 6 piccoli rettangoli di circa 23 mm con una lama di bisturi curvo tenendo retina lungo i bordi con la pinza, per manipolare in posizione. Evitare di pizzicare il tessuto retinico all'interno dei rettangoli. Dai pezzi delle parti centrali della retina, non la periferia lontano.
- Trasferimento pezzi retinici con un grande diametro plastica pipetta Pasteur ad un piatto di plastica Petri 35 mm, il cui fondo è stato sostituito da una maglia con dimensione della griglia inferiore a 1 mm. Fissare la piastra di Petri nel terzo superiore di un matraccio becher o conica e immergere pezzi retiniche in bu Piano Ames 'bbled con CarboGen.
4. Integrazione di retina Pezzi in Agarosio
- Trasferire accuratamente 2 - 3 pezzi della retina in 35 mm piatto di plastica Petri insieme con alcuni dei Ames 'Medium. È più conveniente usare un grande diametro di plastica pipetta Pasteur per il trasferimento. In questa fase, l'orientamento esatto dei pezzi retiniche non importa.
- Rimuovere il più possibile del Piano rimanente Ames 'con una pipetta Pasteur di vetro. Non appena il liquido è stato rimosso procedere con passo 4.3. Non lasciare che la retina asciugare il tessuto.
- coprire immediatamente pezzi della retina con 2 ml di agarosio disciolto (37 ° C). Date le dimensioni di cui al punto 3.10, i pezzi non rannicchiarsi all'interno agarosio.
- All'interno agarosio liquido, spingere delicatamente pezzi retina al fondo della capsula di Petri. Lo strato di cellule gangliari deve essere rivolto verso il basso. Utilizzare un microscopio stereo per la sentenza della posizione esatta. Per il posizionamento, gestire pi retinaECE con una piccola spatola. Posizionare la retina più veloce e preciso possibile poiché l'agarosio solidifica rapidamente.
- Disporre pezzi retinici paralleli al fondo del piatto di vetro; altrimenti sezioni saranno tangenziale o oblique. Singoli pezzi non dovrebbero toccare l'un l'altro, ma anche non dovrebbero essere troppo distanti. Prova a mettere pezzi della retina più o meno sullo stesso livello orizzontale.
- Mettere in vetro capsula di Petri con pezzi della retina incorporati in frigorifero (4-6 ° C) per almeno 2 minuti. Questo si indurisce rapidamente l'agarosio per l'ulteriore elaborazione. Non appena l'agarosio si è polimerizzato procedere con il passaggio successivo.
5. Montaggio della retina Pezzi
- Rimuovere con attenzione il blocco di agarosio contenente pezzi retina dalla capsula di Petri. Utilizzare una spatola o un dispositivo simile per sollevare il blocco agarosio dal vetro. A causa di forze adesive, questo può rivelarsi molto difficile. Tuttavia, evitare di rompere ilblocco agarosio. Eseguire questo e tutti i successivi passaggi a temperatura ambiente.
- Posizionare il blocco di agarosio su un vetrino di vetro e regolarne le dimensioni con una lama di bisturi. Lasciare 1 - 2 mm di agarosio su ciascun lato dei pezzi retiniche. La dimensione finale del blocco dovrebbe essere di circa 1.066 millimetri (10 mm si riferisce all'altezza del blocco, 6 mm per la lunghezza bordo).
- Incollare il blocco di agarosio al titolare del campione del vibratome utilizzando un adesivo istantaneo. pezzi retiniche dovrebbero essere collocati nella parte superiore del blocco di alta 10 mm e orientata parallelamente alla sua superficie, mentre la parte inferiore è fissata al supporto.
- Coprire il blocco immediatamente versando Media precedentemente bollito Ames 'nel cassetto del buffer della vibratome.
6. Preparazione orizzontale vibratome Sezioni
- Inizia sezionamento. Inizialmente, impostare lo spessore di tagliare manualmente fino frammenti di tessuto retinico appaiono nella fetta. Quindi modificare le impostazioni al punto 2.3. poiché latopo retina è solo di circa 200 micron di spessore, non ci saranno più di 2 - 3 fette per blocco di agarosio.
- Rimuovere sezioni dal vassoio buffer con una bacchetta di vetro e trasferirli 2 ml Ames 'medie da 35 mm piastra di Petri.
- Conservare sezioni immediatamente in un incubatore a 37 ° C (5% CO 2/55% O 2). L'agarosio che circonda sezioni resterà solida in incubatrice e può essere utilizzato per gestire le sezioni senza danneggiare la retina. Migliore qualità fetta viene ottenuta quando immagazzinati a 37 ° C entro la rispettiva atmosfera rispetto a Media ossigenato Ames 'a RT. Le sezioni possono essere utilizzate immediatamente o possono essere memorizzati fino a 4 ore in incubatrice con buoni risultati fisiologici.
- Incorpora prossimi pezzi della retina in agarosio e ripetere le sezioni 4 - 6.
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Risultati
In fette orizzontali della retina di topo, corpi cellulari orizzontali potrebbero essere facilmente identificati in base alla loro morfologia unico con diverse dendriti primari emergono da un corpo cellulare poligonale (Figura 1A). corpi cellulari orizzontali situati vicino alla superficie della fetta sono stati regolarmente accessibili per gli elettrodi di patch-clamp. Durante le registrazioni, le cellule sono state riempite con un colorante fluorescente, riveland...
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Discussione
Contrariamente alle porzioni verticali, la morfologia dendritica dei neuroni orientate radialmente come cellule orizzontali e cellule amacrine è ben conservata. Rispetto ai preparati intere retina, questi tipi di cellule sono facilmente accessibili per microelettrodi e possono essere studiate da entrambe le tecniche elettrofisiologiche e di imaging. Qui, ci siamo concentrati sulla retina esterna; tuttavia, un approccio simile è stato segnalato in particolare per le cellule amacrine della retina interna
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG FOR701 e FE464/11-1 to A.F. Gli autori ringraziano l'eccellente assistenza tecnica di Andrea Nerz.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ames' Medium | Sigma | A1420 | |
| Bicarbonato di sodio | Sigma | S5761 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | |
| Carbogen | Air Liquide | ||
| Agarose | Sigma | A9045 | |
| 35 mm Petri (plastica) | Nunc Thermofisher | 150318 | |
| Petri di vetro piatto | Chemoline | 50-1470-40 | |
| Dispensario di isoflurano | ospedale universitario | ||
| Lama iniettore vibratomo | Biosystems | 39053250 | |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT1200 | |
| Vibrocheck | Leica Microsystems | ||
| Microonde | |||
| Bagnomaria | |||
| Pinze | |||
| 20 G aghi Forbici | |||
| a molla | |||
| Lame | |||
| Stereomicroscopio | |||
| Pipetta Pasteur in plastica Pipetta | |||
| Pasteur in vetro |
Riferimenti
- DeVries, S. H., Li, W., Saszik, S. Parallel processing in two transmitter microenvironments at the cone photoreceptor synapse. Neuron. 50, 735-748 (2006).
- Jackman, S. L., et al. Role of the synaptic ribbon in transmitting the cone light response. Nature Neuroscience. 12 (3), 303-310 (2009).
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- Singer, J. H., Lassová, L., Vardi, N., Diamond, J. S. Coordinated multivesicular release at a mammalian ribbon synapse. Nature Neuroscience. 7 (8), 826-833 (2004).
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Ristampe e permessi
