Articolo metodologico

Imaging cellulare dal vivo e analisi 3D del recettore dell'angiotensina di tipo 1a tratta degli transfettati embrionali umane cellule renali Utilizzando Microscopia confocale

DOI:

10.3791/55177

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27 marzo 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Georgetown University Medical Center, 2Department of Medicine, Georgetown University Medical Center, 3Department of Physics, Georgetown University Medical Center, 4Department of Oncology, Georgetown University Medical Center

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui vi presentiamo un protocollo per celle di immagine che esprimono fluorescenti tipo angiotensina recettori 1a proteina-tag verde durante endocitosi avviate dal trattamento angiotensina II. Questa tecnica comprende lisosomi etichettatura con un secondo marcatore fluorescente, e quindi utilizzando software per analizzare la co-localizzazione di recettori e lisosomi in tre dimensioni nel tempo.

Abstract

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Live-cell imaging è usata per acquisire contemporaneamente time-lapse immagini di recettori di tipo angiotensina 1a (AT 1a R) e compartimenti intracellulari in cellule embrionali umane del rene trasfettate-293 (HEK) dopo stimolazione con angiotensina II (Ang II). Cellule HEK sono transitoriamente trasfettate con il DNA plasmide contenente AT 1a R contrassegnate con maggiore proteina fluorescente verde (EGFP). Lisosomi sono identificati con un colorante fluorescente rosso. Le immagini in diretta delle cellule vengono catturati su una scansione laser microscopio confocale dopo stimolazione Ang II e analizzati dal software in tre dimensioni (3D, voxel) nel corso del tempo. live-cell imaging consente indagini traffico recettore ed evita confonde associati con fissaggio, in particolare, la perdita o spostamento artefatti di recettori di membrana EGFP-tag. Così, come singole cellule sono tracciati nel tempo, la localizzazione subcellulare dei recettori può essere ripreso e misurato. Le immagini devono essere acquisite sufficiently rapidamente per catturare il movimento delle vescicole rapida. Tuttavia, a velocità di imaging più veloce, il numero di fotoni raccolti è ridotta. Compromessi devono essere effettuate anche nella selezione dei parametri di imaging come la dimensione voxel per ottenere velocità di esposizione. applicazioni significative di live-cell imaging sono di studiare il traffico di proteine, la migrazione, la proliferazione, ciclo cellulare, apoptosi, l'interazione autofagia e proteina-proteina e dinamiche, per citarne solo alcuni.

Introduzione

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L'obiettivo generale è quello di ottenere dati quantitativi nel tempo e nello spazio dei recettori colocalizzazione con specifici organelli subcellulari dopo il trattamento con un agonista del recettore. Così, l'obiettivo immediato è quello di catturare time-lapse immagini confocale di lisosomi e un transmembrana spanning recettore in cellule renali embrionali umane (HEK) dopo trasfezione e da montare successivamente e analizzare i dati di imaging in 3D per misurare quantitativamente la consegna del recettore lisosomi. Indagare il traffico simultaneo di un recettore transmembrana con i lisosomi o altri organelli durante endocitosi quando attivato dal recettore ligando può aiutare a determinare come il recettore transmembrana è regolato in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche.

AT 1a R si presume essere degradato nei lisosomi dopo il trattamento con Ang II in sistemi di cellule modello, soprattutto HEK293 1, anche se la maggior parte dei receptors sono principalmente localizzate in endosomi riciclaggio multivesicular per il riciclaggio successivamente alla membrana plasmatica mentre la massa del legante, Ang II, è degradata nel lisosoma 2, 3, 4, 5. Più recentemente, Li et al. dimostrata mediante trasferimento di Förster energia di risonanza (FRET) e la fluorescenza di imaging durata microscopia (FLIM) tecniche che colocalizza AT 1a R (on ~ 10 nm scala) LAMP1, una proteina di membrana lisosomiale suggerendo che almeno una parte del recettore colpisce selettivamente e degradate da lisosomi 6. Questi autori hanno notato che la clorochina inibitore lisosomiale bloccato a 1A associazione R-LAMP1 che è coerente con le precedenti relazioni che suggeriscono che un effetto di clorochina è quello di bloccare la fusione di endosomi ritardo o autofagosomi con i lisosomi. Altri approcci indiretti per determinare a 1a R localization in lisosomi hanno utilizzato bafilomicina, un inibitore lisosomiale inferire AT 1a presenza R in lisosomi 3, 4, 5, 6, 7, 8.

live-cell imaging evita potenziali effetti di fissazione su volume cellulare, e la perdita / oscuramento / ridistribuzione dei recettori GFP-chimerico. Studi precedenti hanno invocato cellule fissate per determinare colocalizzazione o co-occorrenza del recettore con i lisosomi o usando cellule vive marcate con surrogati recettore-legante come β-arrestina 1, 2, 3, 4, 5, 6. live-cell imaging di altri GPCR utilizzando confocale disco rotante o laser a scansione punto confmicroscopi Ocal dotati di Gaasp o HYD rilevatori hanno permesso ai ricercatori di osservare l'internalizzazione e la tratta dei recettori in singole cellule imaged in z-stack a 30 s intervalli 9, 10. Tuttavia, anche quando z-stack cellule vive sono rapidamente raccolti, analisi può avvenire solo dopo la selezione di un singolo piano all'interno di ciascuna pila, cioè in 2D 10. Anche se questo potrebbe essere sufficiente per studiare il GPCR o tirosin-chinasi del recettore internalizzato in questione, i Rs 1A a accumula in vescicole che cambiano dimensioni e la posizione nel tempo e, quindi, sono intrinsecamente più difficili da campionare in modo adeguato con una fetta solo rappresentante in ogni punto. Per determinare accuratamente il percorso del marcato a 1A R attraverso la cella e per rilevare ogni sottopopolazione di vescicole che differiscono in termini di dimensioni e la posizione, abbiamo messo a punto un metodo per l'imaging 3D e l'analisi 3D per tenere traccia di questi cambiamenti e di essere usato insieme con etichettatura di diversi compartimenti intracellulari come lisosomi.

Gli investigatori possono utilizzare questo protocollo per live-cell imaging di visualizzare direttamente il movimento di AT 1a R nella cella e il suo trasferimento a compartimenti subcellulari dopo stimolazione Ang II. compartimenti cellulari sono contrassegnati con chimere proteina fluorescente o altri marcatori fluorescenti. Questo protocollo può essere utilizzato anche come un primo approccio per localizzare recettori organelli subcellulari con una risoluzione minima di 200 nm per comparare mutato rispetto recettori wild-type o per rilevare modifiche seguenti trattamenti farmacologici. La tecnica è accessibile poiché può essere effettuata su ogni microscopio confocale attrezzata per live-cell imaging. La relativa facilità di questo approccio contrasta con maggiore competenza e le attrezzature necessarie per svolgere FRET / FLIM / tecniche BRET che rilevano interazioni molecolari 6,"xref"> 11. Queste misure definiscono le interazioni proteina-proteina ad alta risoluzione (~ 10 nm) e la localizzazione all'interno di organelli subcellulari è dedotto. Queste tecniche più avanzate sono utilizzate per seguire e definire ulteriormente le interazioni molecolari di interesse, piuttosto che il passaggio dei recettori attraverso compartimenti subcellulari, e dimostrano direttamente interazioni proteina-proteina in tempi e luoghi specifici all'interno della cella 11. FLIM, una tecnica FRET indipendente dalla concentrazione di accettori, viene spesso eseguita su campioni corretti dopo l'acquisizione dell'immagine è più lento. Al contrario, il rapporto FRET fornisce una rapida delle immagini e ad alta risoluzione colocalization di proteine ​​che interagiscono. Lo svantaggio di rapporto di FRET è che l'imaging utilizza widefield epi-fluorescenza per guadagnare velocità di imaging e di includere l'intera cella, con conseguente ridotta risoluzione e contrasto degli organelli 12. trasferimento di energia di risonanza bioluminescenza (BRET) è un altrotecnica avanzata che è stato applicato al GPCRs per misurare l'acquisizione di prossimità molecolare nel tempo 11. In questa tecnica un fluoroforo proteina è molecolarmente diviso e ciascuna metà collegato ad uno dei due proteine ​​in questione. Quando le due proteine ​​di interesse legano tra loro, le parti del tag chimerico riassemblare acquisire fluorescenza e la maggiore fluorescenza quantificato nel tempo.

Qui vi presentiamo una tecnica semplice per l'imaging dal vivo di cellule accoppiato con immagine quantificazione di studiare il traffico di AT 1a R nella cella in seguito a stimolazione Ang II e il potenziale cambiamento nella consegna di interiorizzato a 1A R per lisosomi seguenti stimolazione Ang II. L'uso finale per questa tecnica è quello di caratterizzare le differenze di traffico di membrana confronto wild type e recettori mutati. Queste differenze aiuteranno a identificare il meccanismo (s) che hanno un impatto le attività fisiologiche di AT 1a R leading di regolazione della pressione sanguigna.

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Protocollo

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Giorno uno

1. cellulare Semina

  1. Preparare completa di Dulbecco modificato (DMEM). Aggiungere 50 ml di siero fetale bovino, 5 ml di penicillina / streptomicina, 5 ml di L-glutammina a 450 ml di DMEM per ottenere 500 ml di DMEM completo addizionato con siero fetale bovino (10%), penicillina / streptomicina (1%) e L-glutammina (1%).
  2. umane embrionali renali (HEK), le cellule di semi, numero passaggio 6-11 a 50.000 / bene in un sistema di 8 coprioggetti ben camerata in DMEM completo.
  3. Mantenere il vetrino a camera a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di CO 2 per 24 h.

Secondo giorno

2. liposomi Trasfezione

  1. Appena fare AT soluzioni plasmidi e liposomi 1a R-GFP usando condizioni sterili con un armadietto livello di biosicurezza 2.
  2. Diluire 2 ml di DNA plasmide a 900 ng / ml soluzione madre in 178 ml di mezzi siero ridotto per ottenere un concentratione di plasmide DNA di circa 10 ng / ml.
  3. Diluire 4,5 ml di soluzione di liposomi magazzino a 175,5 ml di mezzi siero ridotto di creare una diluizione 1:40 dello stock.
  4. Aggiungere la soluzione liposomi alla soluzione plasmide e mescolare utilizzando una pipetta 1 mL di pipetta su e giù 20 volte per miscelare la soluzione di trasfezione.
  5. Incubare la miscela per 30 minuti a temperatura ambiente (25-27 ° C).
  6. Mentre questa miscela è in incubazione, rimuovere il supporto lentamente con un mL pipetta 1 e aggiungere lentamente 400 ml di 1x tampone fosfato salino (PBS), che è pre-riscaldato a 37 ° C.
  7. Rimuovere delicatamente la PBS e sostituirlo con 200 ml / pozzetto di riduzione dei media siero pre-riscaldato a 37 ° C.
    NOTA: prestare attenzione a tutte le fasi quando si lava le cellule per evitare il distacco delle cellule dal vetrino a causa di pura stress indotto pipettando.
  8. Mantenere le cellule a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di CO 2 per 30 min.
  9. Una volta che ilperiodo di incubazione è finita, aggiungere 80 ml di miscela di trasfezione ad ogni pozzetto e incubare le cellule per 4,0-4,5 h ma non più di 5 ore a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di CO 2.
  10. Dopo il periodo di trasfezione incubazione, rimuovere lentamente il supporto dalle camere con una mL pipetta 1 e sostituire delicatamente con 300 microlitri / pozzetto di DMEM completo e incubare le cellule per 24 ore a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di CO 2 .

Giorno tre

3. Siero fame

  1. Rimuovere il supporto delicatamente con una pipetta mL 1 e sostituire lentamente con 300 ml di DMEM senza siero, senza rosso fenolo.
  2. Mantenere la camera a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di CO 2 per 10-12 h.

Quarto giorno

4. Imaging Live Cell

  1. Compartimenti intracellulari Stain (lisosomi in questo caso).
    1. About 30 minuti prima di imaging lisosomi delle cellule, aggiungere 22,5 ml da un colorante fluorescente soluzione stock 1 micron (0,5 ml di 1 mm colorante fluorescente diluito in 499,5 ml di DMEM senza siero senza rosso fenolo) in ogni pozzetto per una concentrazione di colorante finale di 75 nM.
    2. Incubare per 25-30 minuti a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di CO 2 e quindi rimuovere delicatamente il colorante e aggiungere lentamente 300 ml di DMEM fresco senza siero, senza rosso fenolo.
  2. Preparare il microscopio per l'imaging.
    1. Regolare la fase giù per evitare danni alla lente durante l'avvio di un microscopio automatizzato.
    2. Accendere microscopio, alimentazione dello scanner, potenza del laser e poi emissione laser, e infine la lampada ad alogenuri metallici per l'osservazione visuale (vedi confocale istruzioni del fabbricante microscopio).
    3. Aprire il programma software di imaging e nel turno software sul argon (488 nm) laser e potenza fino a 30-50%. Nota la potenza dipende daetà del laser. All'interno di esperimenti è fondamentale per mantenere le impostazioni costanti.
    4. Accendere laser rosso-emissioni (ad esempio 568 nm o 594 nm).
    5. Set formato di imaging per la profondità a 12 bit.
    6. Impostare il foro stenopeico per la linea di laser ad argon 488 nm e per la 568 nm o 594 nm laser per 1 unità disco di Airy. Se la GFP è molto debole, utilizzare un ambiente di 2 unità disco di Airy, ma abbinare i canali in modo appropriato.
    7. Quando si utilizza set di filtri dicroici, selezionare le lunghezze d'onda di emissione adeguati per GFP e il colorante fluorescente. In alternativa, impostare la lunghezza d'onda di emissione (Em) a 499-580 nm per la GFP e Em 599-680 nm per il colorante fluorescente rosso luminescente.
    8. Controllare che sanguinano attraverso e incrociato non si verificano. Spegnere ogni laser a sua volta e controllare entrambi i canali di emissione per ciascuna. Quando il laser ad argon è spento, l'emissione verde dovrebbe essere pari a zero. Quando il laser che emette verde è spento, il canale di emissione rosso dovrebbe essere zero.
      NOTA: Il metodo più sicuro è quello di un'immagine ogni a tracce separate (Sequziale).
    9. Includere un canale in campo chiaro se lo si desidera. Evitare di imaging contrasto differenziale (DIC), perché può inclinare misure colocalizzazione.
    10. Per l'imaging dal vivo, selezionare la linea sequenziale anziché cornice sequenziale.
  3. Selezionare le celle per l'imaging.
    1. Utilizzare un obiettivo 1.4 apertura numerica (NA), ad esempio un obiettivo 63X / 1.4 NA olio per celle di immagine (o 40X / 1.4 NA). Centrare l'obiettivo e aggiungere una goccia di alta viscosità, l'olio a bassa autofluorescenza di immersione sul oggettiva.
    2. Trasferire la camera con le cellule transfettate dal termostato alla fase del microscopio. Fare attenzione a tenere le diapositive piatto e accertare che la camera è ben posizionato e trattenuto dal movimento.
    3. Spostare l'obiettivo fino alla goccia di olio sfiori la parte inferiore della slitta; il piano focale destra è vicino a questa posizione. In microscopi automatici, salvare questa posizione così come la posizione abbassata da utilizzare per la remainder dell'esperimento di imaging per facilitare cambiando campioni.
    4. Scegli cellule dim. Le cellule overexpressing a 1A R-GFP saranno sviare il recettore nella cellula e disturbare la normale funzione.
    5. Verificare che il contorno della cella, definita dalla membrana plasmatica, è visibile e preferibilmente non sovrapposizione con altre cellule.
    6. Primo e centrare la cella nel campo visivo.
    7. Passa alla modalità confocale.
    8. Selezionare una modalità di imaging veloce. Con una mano sul controllo del fuoco e l'altra sul controllo XY fase mirare e centrare la cella di interesse visualizzata sul monitor.
    9. Verificare che la cella di interesse è ben diffuso e il suo lato inferiore o ventrale giustapposta a stretto contatto con il vetrino, concentrandosi su e giù attraverso la cella.
  4. Impostare i parametri Z-stage a un'immagine cellulari in 3D.
    1. Selezionare il pulsante di accensione per il top Z-stack e finestra inferiore (o equivalente) e concentrarsi sul fondo del cell quindi premere "iniziare". Poi, si concentrano per la parte superiore della cella e premere "fine". Ricontrollare che l'intera cella è incluso nel z-stack.
    2. Impostare la dimensione Z-passo a 1.0 micron.
  5. Impostazioni di imaging SET.
    1. Selezionare Zoom 2, a seconda della lente, in modo che la dimensione finale del pixel è circa 0,279 um x 0.279 micron a 0,14 micron x 0,14 micron nella dimensione XY.
    2. Per le cellule HEK in questo esperimento, impostare la velocità di scansione di circa 1 microsecondo per voxel e selezionare 2 media o 2 accumuli di linea, a seconda della luminosità delle cellule.
    3. Regolare intensità del laser e di ottenere per l'imaging GFP e il colorante fluorescente. In generale, controcolorazioni sarà molto più luminoso e quindi Fotomoltiplicatore rivelatore (PMT) e non fosfuro di gallio arseniuro (Gaasp) o rivelatori ibridi (HYD) dovrebbe essere utilizzato per questo secondo canale di colore che sono necessarie GASP e HYD rilevatori per il canale GFP. Se il hyd o Gaasp rilevanoors sono utilizzati per il colorante fluorescente, esercitare cautela e inizia con il laser ad una potenza estremamente bassa.
    4. Impostare durata della scansione e frequenza di scansione, ad esempio, ogni 30-60 s oltre 25 min o più per vedere il targeting di AT 1a R-GFP ai lisosomi.
    5. Impostare la messa a fuoco automatica per mantenere la stabilità sul piano focale nel tempo.
  6. Iniziare l'esperimento di imaging.
    1. Preparare in anticipo 100x Ang II stock a 5 mg / mL (4,7793 mM) e aggiungere 2,1 ml di questo per 998 ml di media (10 micron).
    2. Iniziare la stimolazione ligando con l'aggiunta di 3 ml di una soluzione stock 100x di ligando (Ang II) per pozzetto contenente 300 microlitri immediatamente prima di imaging (concentrazione finale 100 nM).
    3. Fare clic su Start e l'immagine in 3D per il tempo e frequenza desiderata.
    4. Prima di concludere il lavoro al microscopio, raccogliere un z-stack per un uso successivo in sottrazione del fondo durante l'analisi. In modalità di conteggio di fotoni, questo non ènecessario poiché lo sfondo è essenzialmente 0. illuminazione acceso e tutte le altre condizioni di imaging stesso, ma nessun campione prendere un'immagine campione. Vedere sottrazione del fondo (sotto) in analisi.

Quinto giorno

Analisi 5. Immagine

  1. Esportare le immagini in formato TIFF.
    1. Fare clic destro sul nome del file immagine per vedere i menu e selezionare Esporta o fare clic su File | Export | importare.
    2. Esporta in TIFF per analisi successive avendo cura di esportare il RAW, dati a 12 bit [non il 'Rosso Blu Verde' (RGB) di conversione utilizzato per immagini di qualità pubblicazione]. Non esportare in formato jpeg.
    3. Notare la X, Y, Z dimensioni voxel e la dimensione z-passo per un uso successivo durante l'analisi dell'immagine. Ad esempio, utilizzando un 40X / 1.4. NA obiettivo da questi valori potrebbero essere 0.138 micron x 0,138 micron con 1 micron dimensione z-passo (vedi dati nella sezione Risultati rappresentativi).
  2. Crea serie di immagini per l'analisi.
    1. Apri immagine del software di quantizzazione (Figura 2)
    2. Utilizzare "Azione | Create New | Immagini dalla sequenza selezionata" per generare una singola immagine file da sequenze importati singoli (figura 2, freccia 1 #).
    3. Inserire il numero di canali, il numero di z-sezioni, e il numero di punti temporali.
    4. A seconda della struttura dei file TIFF *, selezionare, per esempio, canali, piano z, e punti temporali come l'ordine dei piani dell'immagine. Controllare che la risma immagine finale rappresenta correttamente i canali di colore, z-stack, e punti temporali dell'immagine originale.
    5. Selezionare il nome dell'immagine (Figura 2, ha evidenziato il nome del file a sinistra, freccia # 2). Fare clic destro sull'immagine e / o il campo immagine, quindi una delle opzioni in fondo alla lista selezionare "Proprietà". Nel pixel micron per (X) (Y) e (Z) formato, inserire le proprietà dell'immagine corretti osservato in precedenza.
  3. Sfondo Sottrarre prima analisi delle immagini. Correzione del fondo può essere realizzato in qualsiasi software di analisi delle immagini. Sottrarre sfondo utilizzando una delle due opzioni.
    1. Opzione 1: Selezionare "Azione | Crea nuovo | sottrazione dello sfondo" (figura 2, freccia # 1). Utilizzare l'immagine di sfondo acquisita ottenuto al termine della sessione di imaging descritto come il "Dark riferimento" immagine sotto "Strumenti | Sottrarre Sfondo".
    2. Opzione 2: Controllare le aree più scure nelle immagini in cui vi è nessun campione, trovare la media o massima luminosità di pixel in quella regione, ignorando eventuali pixel insolitamente brillanti che potrebbero essere fluoroforo spuria, un pixel in modo casuale brillante, o qualche altro fenomeno. Selezionare "Azioni | Crea nuovo | sottrazione del fondo". Utilizzare questa luminosità dei pixel (fatto negativo) come offset.
  4. Verificare la registrazione colore e correggere se necessario.
    1. Utilizzo di un controllo positivo, come microsfere esposta, o, colocalized GFP contenenti vescicole e colorante fluorescente (Figura 3) valutare la necessità di una correzione di commutazione sia il canale di colore rosso o verde e spegnendo. Visivamente, se la registrazione è spento anche da 1 pixel, è evidente per l'occhio.
    2. Generare una correzione della registrazione selezionando "Azioni | Crea Nuovo | correzione della registrazione" (figura 2, freccia # 1) e utilizzare la finestra di dialogo per effettuare le regolazioni. Al termine di un nuovo elemento cartella apparirà dal titolo "correzione della registrazione".
    3. Applicare la registrazione di una o più delle immagini di interesse facendo clic sul nome dell'immagine (Figura 2, ha evidenziato il nome del file a sinistra, freccia # 2) e quindi selezionando "Strumenti | corretta registrazione" (pulsante strumento adiacente Azioni).
  5. Creare sequenza di misurazione per analizzare a 1A R-GFP vescicole e l'intensità tutta la cella seguenteil trattamento con Ang II.
    1. Selezionare un'immagine (Figura 2, ha evidenziato il nome del file a sinistra, freccia # 2) e disegnare una regione di interesse (ROI) intorno ad una singola cella usando lo strumento freestyle regione (figura 2, freccia 3 #). Utilizzare la modalità di messa a fuoco estesa (2D, menu a discesa in alto a sinistra) per osservare il cellulare come strumento di ritaglio funziona solo in visualizzazione 2D.
    2. Fare clic destro sull'immagine e selezionare "Ritaglia" e un nuovo elemento immagine viene generata.
    3. Selezionare la cella ritagliata facendo clic sul suo nome e quindi selezionare la scheda "Misura" di cui sopra (figura 2, freccia # 4).
    4. Per definire e misurare vescicole interiorizzato per GFP, trascinare "Trova gli oggetti" in "Finding" (figura 2, freccia 5 #) nella casella di sequenza (figura 2, freccia # 6).
    5. Impostare "Trova oggetti" Canale al canale GFP.
    6. impostazioni aperte (icona ruota finestra di dialogo, freccia # 6) e impostare4; Soglia utilizzando: "per SD e" limite inferiore "a 6. Set" Dimensione minima oggetto "da 0 micron 3.
      NOTA: Il limite inferiore SD dipenderà singoli esperimenti. Conferma visiva che gli oggetti corretti thresholded è fatta esaminando diversi intervalli di tempo (figura 2, freccia 7 #). La "Misura | Commenti Opzioni" finestra di dialogo permette di scegliere il modo in cui oggetti selezionati thresholded vengono visualizzate (Figura 2, freccia # 8).
    7. Fai clic su "misura" nella finestra di dialogo "Trova oggetti" (Figura 2 freccia # 6) e selezionare i canali e il tipo di misura. In genere, selezionare "Tutti i canali" e "intensità e volume misurazioni".
    8. Per definire la soglia e filtri per l'identificazione di tutto il cellulare e per misurare l'intensità totale GFP, ripetere i passaggi precedenti (5.5.4 - 5.5.8) utilizzando i seguenti parametri: SD 0 e "Dimensione minima oggetto" per 2 μ; m 3 nella seconda finestra di dialogo "Trova gli oggetti" per identificare le cellule che utilizzano GFP (figura 2, freccia 9 #)
    9. Trascinare "Filtro Popolazione" sotto "Filtro" per la casella di sequenza sotto popolazione 2 (la seconda casella "Trova oggetti", figura 2, freccia # 9). Selezionare "Volume (micron 3> 100).
    10. Visivamente garantire che solo un oggetto viene identificato. L'intera cella deve essere thresholded e tutti gli altri oggetti filtrato via. Il parametro "Filtro" (s) potrebbe essere necessario aggiustamento se la cella è piccola, per esempio.
    11. Una volta che la misurazione è stato standardizzato, salvare il protocollo facendo clic destro sull'immagine e selezionate "Salva Protocol" al fine di riutilizzare ( "Restore protocollo"). Il protocollo può essere esportato anche a fornire una registrazione nella stessa sottodirectory come immagine.
    12. Passare a "Fai la misura" selezionando "Misure | Fai la voce di misura" (Figura 2 , freccia # 8) o clic destro sull'immagine e selezionare "Make misura" e "tutti i momenti".
    13. Inserire il nome misura corretta (copia incolla dall'immagine è conveniente) e il codice di analisi o la data (un'aggiunta utile per la tenuta dei registri) e selezionare "tutti i momenti". Un nuovo elemento foglio verrà creata sotto l'immagine. Mantenere i nomi dei file concisa.
  6. Analizzare ed esportare i dati.
    1. Fare clic sul nome del file foglio di lavoro e selezionare la scheda "Analizza". Determinare se voxel saturi sono presenti in primo luogo selezionando "Limitare l'analisi per:" selezionare Popolazione 2 (la cella).
    2. Fare clic destro del campo sotto la scheda "Analizza" e nella finestra di dialogo sotto "Analizzare questi dati:" selezionare "Max ([canale di colore GFP])"; sotto "Riepilogate per:" selezionare "Media ([canale di colore GFP]" e sotto "organizzare i dati per:" e "riga" selezionare "timepoint" e click "OK".
      NOTA: Se i dati contiene pixel saturi (ad esempio 65.536 per 16-bit o 4.096 per 12-bit), l'analisi non sarà accurata (sarà sottovalutare il contenuto delle vescicole). Ignorare quella cella per l'analisi. Se non è saturo, passare alla fase successiva.
    3. Successivamente, nella scheda "Raw" e poi nella scheda "Analisi" e tasto destro del mouse i dati trovano "Limita Analisi a:", quindi selezionare Popolazione 1 per vescicole o Popolazione 2 per tutta la cella.
    4. In "Analizzare questi dati:" selezionare "Sum" (canale del colore GFP); sotto "riassunto da:" selezionare "Somma"; e, sotto "organizzare i dati per:" e "riga" selezionare "timepoint" o "Time relativa" e quindi fare clic su "OK". selezioni di analisi possono essere salvate e riutilizzate.
    5. Selezionare e copiare / incollare direttamente dal software di immagine quantificazione di un foglio di calcolo vuoto o esportare i dati del foglio di calcolo facendo clic destro del datuna e selezionando Salva come file .csv. La misura intera intensità cella sarà incluso con le misurazioni di ogni vescicole nella popolazione in modo da essere sicuri di individuare e separarlo dalle vescicole.
      NOTA: Dopo aver tracciato i dati, l'aumento totale della fluorescenza GFP contenuta in vescicole sale rapidamente. Photobleaching, se si verifica, viene rilevato come perdita di intensità totale GFP cellule nel tempo.
  7. Creare sequenza di misurazione per analizzare GFP presente nei lisosomi.
    1. Nei Trova gli oggetti (popolazione 1), impostare "Trova gli oggetti" di canale per il canale rosso e l'icona della ruota all'interno di tale finestra di dialogo indicato dalla freccia # 6 (figura 2) set "Soglia utilizzando:" per SD e "limite inferiore" a 6. Impostare "dimensione minima oggetto" a 0,017 micron 3.
      NOTA: Il limite inferiore SD dipenderà singoli esperimenti. conferma visiva che gli oggetti corretti vengono thresholded dovrebbe essere fatta da esamevorazio diversi punti di tempo. La "Misura | Commenti Opzioni" finestra di dialogo permette di scegliere il modo in cui oggetti selezionati thresholded vengono visualizzate (Figura 2, freccia # 8).
    2. Fare clic su "misura" in "Trova" Oggetti "finestra di dialogo (Figura 2 freccia # 6) e selezionare i canali ei tipi di misure. In genere," vengono selezionati tutti i canali "e" intensità e volume misurazioni ".
    3. Per la popolazione 2, le impostazioni di uso identico a quello utilizzato per identificare l'intera cellula transfettate che esprimono a 1A R-GFP (5.5.9).
    4. Se più cellule (incluse le cellule untransfected con vescicole dye-positivo fluorescenti) sono presenti, il ritaglio della cella nella prima fase di analisi è critica. In alternativa, l'uso di "compartmentalize" dovrebbe essere utilizzato per limitare l'identificazione dei lisosomi all'interno della cellula transfettate che esprimono AT 1a R-GFP. I lisosomi deve essere identificato solo all'interno della cellula GFP eNon da vicino, le cellule untransfected.
    5. Analizzare ed esportare dati come sopra.
      NOTA: Un esempio di cellule thresholded e vescicole è mostrato in figura 4.

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Risultati

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In questo insieme rappresentativo di esperimenti, cellule HEK sono state trasfettate con il recettore dell'angiotensina di tipo 1a (AT 1a R-GFP) costruire (E1,2,3-AT 1a R) clonato nel plasmide pEGFP-N2 13. Time-lapse immagini di HEK sono stati acquisiti e giocato come un film (Vedi Cellulare Imaging 1 e imaging cellulare dal vivo 2 film). I filmati e le immagini fisse mostrano che dopo stimolazione ligando, a...

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Discussione

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Esperimenti preliminari qui presentati mostrano che nel corso di un piuttosto breve corso di tempo di 24 min, senza modificare sensibilmente la consegna di AT 1a R-GFP ai lisosomi si è verificato. In generale, la consegna dei recettori internalizzati ai lisosomi potrebbe verificarsi già 15-20 min. Questo esperimento è coerente con l'ipotesi che la maggior parte del interiorizzato a 1A R si rivolge a grandi, endosomi perinucleari. La prova che almeno alcuni AT 1a R arriva in lisosomi ...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Il lavoro di ricerca presentato in questo manoscritto è stato sostenuto dalla concessione R01 HL121456-01A1 a Kathryn Sandberg. Questo lavoro è stato sostenuto in aggiunta dalla disponibilità di una Leica SP8 AOBS in microscopia e di imaging di risorse condivise (MISR) presso la Georgetown University Medical Center, che è parzialmente finanziato da P30-CA051008 dal National Institutes of Health degli Stati Uniti d'America. Noi riconosciamo con gratitudine Leica assistenza di imaging SP8 da Peter Johnson, e l'uso della Zeiss LSM880 nel laboratorio di Thomas Coate, Dipartimento di Biologia presso la Georgetown University con l'assistenza di imaging fornita da Alma Arnold di Carl Zeiss Microscopia LLC. Il contenuto di questo manoscritto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Angiotensina II (Ang II)Sigma-AldrichA9525 
Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x)Gibco -ThermoFisher Scientific11960-044Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso 
Siero fetale bovino (FBS)Sigma-AldrichF2442caldo in 37 ° grado C bagnomaria prima dell'uso
Penicillina Streptomicina (Pen Streptomic)Gibco -ThermoFisher Scientific15140-122Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso
L-Glutammina 200 mM (100x)Gibco (life technologies)25030-081Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso
Rene embrionale umano (HEK)-293 celluleCollezione di colture di tipo americano (ATCC) CRL-1573Passaggio numero 5 - 12
Nunc Lab-Tek II camerato 1.5 Sistema tedesco CoverglassSigma-Aldrich155409
Lipofectamine 2000 Reagente di trasfezioneThermoFisher Scientific11668019Store a 4 ° C 
Opti-MEM, Siero Ridotto MediumGibco- ThermoFisher Scientific31985-070Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso
PBS 10x Fisher BioReagentsBP3994Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima
dell'uso Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x) Gibco -ThermoFisher Scientific31053-028Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso
LysoTracker Red DND-99sonde molecolari -ThermoFisher ScientificL7528Conservare aliquote al buio a -20 ° C . 
6.3 Software di analisi delle immaginiPerkinElmerModuli di visualizzazione e quantificazionePer l'analisi 3D delle immagini di stack di immagini
Leica SP8 AOBS Microscopioconfocale a scansione laserLeica MicrosystemsPer la raccolta
di immagini Zeiss LSM 880Microscopio confocale a scansione laserCarl Zeiss Per la raccolta diimmagini

Riferimenti

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  2. Hein, L., Meinel, L., Pratt, R. E., Dzau, V. J., Kobilka, B. K. Intracellular trafficking of angiotensin II and its AT1 and AT2 receptors: evidence for selective sorting of receptor and ligand. Mol Endocrinol. 11 (9), 1266-1277 (1997).
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  16. Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nat Commun. 6, 7670(2015).
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  18. Yoshimori, T., Yamamoto, A., Moriyama, Y., Futai, M., Tashiro, Y. Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H(+)-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells. J Biol Chem. 266 (26), 17707-17712 (1991).

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