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Articolo metodologico

Non invasivo

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DOI:

10.3791/55180

⸱

8 maggio 2017

 ,  ,  ,  , 
1Werner Siemens Imaging Center, Department of Preclinical Imaging and Radiopharmacy, Eberhard Karls University of Tübingen, 2Department of Nuclear Medicine, Eberhard Karls University of Tübingen, 3Department of Dermatology, Eberhard Karls University of Tübingen

In questo articolo

Sommario

Questo articolo spiega l'applicazione dell'immagine fluorescente utilizzando una sonda ottica attivabile per la visualizzazione dell'attività in vivo delle metalloproteinasi di matrici chiave in due diversi modelli sperimentali di infiammazione.

Abstract

In questo articolo si descrive un metodo non invasivo per l'attività di matrice metalloproteinasi (MMP) di imaging mediante una sonda fluorescente attiva, tramite l' ottica ottica (OI) in fluorescenza in vivo , in due diversi modelli di infiammazione: un artrite reumatoide (RA) e un contatto Modello di reazione di ipersensibilità (CHR). La luce con una lunghezza d'onda nella finestra vicino a infrarossi (NIR) (650 - 950 nm) consente una penetrazione più profonda del tessuto e un assorbimento minimo del segnale rispetto alle lunghezze d'onda inferiori a 650 nm. I principali vantaggi che usano l'OI di fluorescenza è che è conveniente, veloce e facile da implementare in diversi modelli animali.

Le sonde fluorescenti attivatabili sono otticamente silenziose nei loro stati inattivati, ma diventano altamente fluorescenti quando attivata da una proteasi. I MMP attivati ​​portano alla distruzione dei tessuti e svolgono un ruolo importante per la progressione della malattia nelle reazioni di ipersensibilità di tipo ritardato (DTHR) come RA e CHR. Inoltre, i MMP sonoLe proteasi chiave per la cartilagine e il degrado dell'osso e sono indotti da macrofagi, fibroblasti e condrociti in risposta a citochine pro-infiammatorie. Qui usiamo una sonda che viene attivata dai MMP chiave come MMP-2, -3, -9 e -13 e descrivono un protocollo di imaging per l'attività di fluorescenza vicino all'infrarosso OI dell'attività MMP in RA e nei topi di controllo 6 giorni dopo l'induzione della malattia Come nei topi con l'acuto (1x challenge) e la cronica (5x challenge) CHR sull'orecchio destro rispetto alle orecchie sane.

Introduzione

Le malattie autoimmuni come l'artrite reumatoide (RA) o la psoriasi vulgaris sono classificate come reazioni di ipersensibilità di tipo ritardato (DTHR). 1 RA è una malattia autoimmune comune caratterizzata da sinovite erosiva e distruzione congiunta. 2 Le articolazioni artrite infiammate dimostrano l'infiltrazione e la proliferazione delle cellule infiammatorie, una maggiore espressione di cellule pro-infiammatorie che portano alla formazione di pannus, alla cartilagine e alle distruzioni dell'osso. 3 , 4 La scissione di molecole di matrice extracellulare, come il collagene mediante matrici metalloproteinasi (MMPs), è essenziale per la conversione e l'angiogenesi dei tessuti e provoca distruzioni del tessuto. 5 , 6 Le reazioni di ipersensibilità di contatto (CHR) sono caratterizzate dall'aggregazione di neutrofili che portano ad uno scoppio ossidativo. 7 Simili a RA, i MMP in CHR sono involved nella conversione dei tessuti, la migrazione cellulare e l'angiogenesi per stabilire infiammazione cronica.

Per studiare RA, il glucosio-6-fosfato isomerasi (GPI) iniezione -serum modello di topo è stato utilizzato. 8 siero di topi K / BXN transgeniche contenenti anticorpi contro GPI, è stato iniettato in topi BALB / c naive dopodiché infiammazione reumatica cominciato a svilupparsi entro 24 h con un massimo di edemi declivi il giorno 6 dopo l'iniezione GPI-siero (vedi 1.1). Per analizzare CHR cronica, topi C57BL / 6 sono stati sensibilizzati con trinitrochlorobenzene (TNCB) sull'addome. L'orecchio destro è stato sfidato fino a 5 volte a partire 1 settimana dopo la sensibilizzazione (vedi anche 1.1 e 1.2).

Non invasiva piccoli animali OI è una tecnica basata sulle indagini in vivo del fluorescente-, chemiluminescent- e bioluminescenti-segnali, che vengono utilizzati principalmente nella ricerca preclinica. I dati semiquantitativa acquisita dà intuizioni nel MolecMeccanismi Ular negli organi e tessuti sani e modelli animali sperimentali malati, e consente longitudinale follow up misure (ad esempio per valutare profili di risposta terapeutica in vivo). Un grande vantaggio di studi longitudinali è la riduzione del numero di animali, come gli stessi animali possono essere misurati in studi di follow up in diversi punti temporali invece di utilizzare mouse diversi per punto temporale. La risoluzione di OI permette imaging funzionale dettagliata di organi e strutture tissutali più piccole in animali da esperimento.

L'uso di specifici filtri eccitazione e di emissione con uno spettro di trasmissione ristretta, una protezione contro luce diffusa da una tenuta di luce "scatola scura" ed un dispositivo charged-coupled sensibili (CCD), che viene raffreddata in molti dispositivi fino a -70 ° C , permette altamente specifico e misurazioni sensibili dei segnali di fluorescenza.

Utilizzando agenti fluorescenti con excitation- eGli spettri di emissione nella finestra di fluorescenza ad infrarossi vicino (650 - 950 nm), i rapporti segnale-rumore possono essere migliorati significativamente. La finestra a fluorescenza a infrarossi vicino è caratterizzata da un assorbimento relativamente basso del segnale da parte dell'emoglobina e dell'acqua così come una bassa fluorescenza di fondo. 9 Questo permette una profondità di penetrazione fino a 2 cm nel tessuto dei piccoli animali. Le sonde OI possono indirizzare direttamente un bersaglio ( ad esempio mediante un anticorpo a fluorescenza) oppure possono essere attivate nel tessuto bersaglio (per es. Mediante proteasi). Le sonde OI attuabili sono otticamente silenziose nella loro forma inattivata a causa del trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) ad una parte di quenching, che trasferisce l'energia di eccitazione all'interno della molecola ad un altro dominio. Se il colorante viene ceduto (ad esempio da una proteasi), l'energia non è più trasferita all'interno della molecola e un segnale fluorescente può essere rilevato da OI. Ciò consente la progettazione di sonde OI ad alta specificitày per processi biologici distinti ed eccellenti segnale-rumore-ratio.

Il protocollo che segue illustra in dettaglio la preparazione degli animali, le misurazioni OI utilizzando una sonda OI Activatable all'immagine MMP-2, -3, -9 e -13 attività in vivo e due modelli sperimentali di infiammazione (RA, CHR).

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Protocollo

Tutte le procedure descritte in questo documento, hanno seguito le linee guida e standard internazionali di cura e l'uso di animali da laboratorio e sono stati approvati dal Comitato locale il benessere degli animali ed etica del Paese Commissione Tuebingen, in Germania. 8 - topi 12 settimane BALB / ce C57BL / 6 sono stati tenuti al 12 h: 12 h di luce: buio ciclo e sono stati alloggiati in IVCS e condizioni ambientali standard a 22 ± 1 ° C in gruppi di 2 - 5 con acqua e alimento accesso ad libitum.

1. Preparazione Materiale

  1. Diluire il colorante OI per vicino infrarosso fluorescenza secondo il rispettivo foglio dati direttamente prima dell'iniezione. Il colorante OI attivabile (sonda commerciale con eccitazione a 680 nm) per misurare MMP in vivo è pronto per l'uso ad una concentrazione di 20 nmol in 1,5 ml di PBS 1x. Agitare delicatamente o vortice la soluzione prima dell'uso. colorante OI può essere conservato a 2-8 ° C per un massimo di 6 mesi se protetto dalla luce.
  2. Per via endovenosa (iv) iniezioni preparare un catetere venoso. Utilizzare un 20 U (0,5 mL) di insulina siringa riempita con una soluzione salina allo 0,9% (contenente 10 unità di iniezione di eparina in 50 mL), e un ago da 30 attaccato ad un catetere di polietilene. Iniettare la dose raccomandata di 2 nmol per il mouse del colorante OI.

2. Induzione di artrite reumatoide e cronica reazione di ipersensibilità di contatto

  1. Artrite reumatoide:
    1. Diluire 100 ml di siero (ottenuto da K / BXN topi 10) anticorpi contenenti (AB) contro glucosio-6-fosfato isomerasi (GPI) 1: 1 con PBS 1x (200 mL) per indurre RA. Conservare il siero diluito a -80 ° C. Procedure dettagliate per l'induzione di RA sono descritti da Monach et al. 8.
    2. Per indurre RA, sollevare ciascun topo delicatamente per la coda e iniettare 200 microlitri di siero diluito intraperitoneale (ip) al giorno 0 di tLui sperimenta. Dopo l'iniezione, posizionare il mouse direttamente nella sua gabbia.
    3. Facoltativamente, misurare i diametri della caviglia di ciascuna caviglia, prima delle iniezioni AB e definire un "punteggio arthritico" ( Figura 1A ). Continuare la misurazione del gonfiore alla caviglia quotidianamente fino al giorno 6 dopo il siero GPI utilizzando un dispositivo di misura meccanico (micrometro).
    4. Iniettare il colorante OI attivo (punto 1.1 - 1.2), per misurare l'attività MMP in vivo IV nella vena di coda di topi RA Il giorno 5 dopo iniezione di siero GPI e nella vena di coda dei topi di controllo. Effettuare esperimenti di imaging ottico 24 h dopo l'iniezione della vena della coda.
  2. Reazione di ipersensibilità di contatto:
    1. Per la sensibilizzazione dei topi C57BL / 6, preparare una soluzione al 5% TNCB sciolta in una miscela di acetone / olio 4: 1.
    2. Anestetizzare i topi C57BL / 6 utilizzando l'1,5% di isoflurano vaporizzati in ossigeno al 100% (1,5 L / min). Una volta che i topi sono anestetizzati, metterlo in un automa-pazzo Cono nasale (una siringa da 5 ml di polietilene, collegata al tubo isoflurano da 1,5 vol%) e mantenere l'anestesia. Applicare unguento veterinario sugli animali anestetizzati per prevenire la secchezza degli occhi durante l'anestesia.
    3. Rasare l'addome con cura (2 x 2 cm) usando un piccolo trimmer di animali. Evitare di danneggiare la pelle, in quanto ciò può portare a segnali fluorescenti non specificati all'interno dell'animale e può influenzare i risultati dello studio.
    4. Applicare lentamente 80 μL della soluzione di TNCB del 5% all'area addominale rasata usando una pipetta da 100 μL per sensibilizzare l'animale. Riposiziona delicatamente il mouse nella sua gabbia, accertandosi che gli occhi del mouse non vengano a contatto con la biancheria per evitare lesioni corneali e evitare temperature corporee durante la fase di recupero.
    5. Sei giorni dopo la sensibilizzazione, preparare una soluzione TNCB da 1% (disciolta in una miscela di acetone / olio 9: 1) e applicare 20 μL all'orecchio destro usando una pipetta per provocare CHSR acuta e cronica."> 1
      1. Iniziare con la prima sfida su entrambi i lati dell'orecchio destro con 20 μL di 1% soluzione TNCB utilizzando una pipetta da 100 μL e ripetere la sfida ogni secondo giorno fino a cinque volte (giorno 15 dopo la sensibilizzazione) per ottenere la CHR ( figura 1B ) . Misurare lo spessore dell'orecchio ogni giorno, utilizzando un dispositivo di misurazione del micrometro.
    6. Iniettare il colorante OI attivo (una sonda commerciale con eccitazione a 680 nm) (fase 1.1-1.2) per misurare l'attività MMP in vivo in topi CHR 12 h dopo la sfida. Eseguire esperimenti di imaging ottico 24 h iniezione venosa della coda della coda ( iv ).

3. Preparazione degli animali per l'imaging ottico

  1. Spostare il topo del mouse (almeno 3 giorni prima dell'immagine) a bassa oa fluorescenza ( ad esempio , senza manganese) per evitare l'interferenza di auto-fluorescenza (circa 700 nm) con il segnale di fluorescenza degli agenti OI usati.
  2. Mettere l'animale inad una scatola di anestesia e anestetizzare con 1,5% vol isoflurano vaporizzato con ossigeno (1,5 L / min) (ossigeno può essere sostituita da aria, ma deve essere standardizzato entro un esperimento).
  3. Quando il mouse è visibilmente anestetizzato, collocarlo in un'ogiva fatto da sé (costruito da un taglio 5 mL polietilene siringa, collegato al tubo% isoflurano 1,5 vol) e mantenere l'anestesia.
  4. Radere l'animale con cura sul sito di destinazione (2 centimetri x 2 cm) con un piccolo trimmer peli. Evitare ferire la pelle, poiché ciò può portare a segnali fluorescenti aspecifici all'interno dell'animale e può influenzare i risultati dello studio.
    NOTA: peli può assorbire il segnale di fluorescenza durante OI (dipendente dal ceppo di topi, più o meno si osserva assorbimento) a seconda della regione di interesse (ROI).
  5. Per l'iniezione endovenosa, posizionare la coda del topo in acqua riscaldata, per indurre vasodilatazione, delicatamente detergere la pelle nel sito di iniezione con alcool, e inizia posizionando il catetereIl sito distale della coda. Posizionare il bordo "tagliato" dell'ago in un angolo di 20 ° nella vena della coda e verificare la corretta collocazione del catetere riattivando la siringa.
  6. Se il catetere è posizionato correttamente, sostituire la siringa e iniettare la sonda OI (2 nmol). Dopo l'iniezione, sostituire la siringa e iniettare 25 μL di soluzione salina di 0,9% per liberare completamente il volume morto del tubo in polietilene.
    NOTA: Il tempo di dimezzamento del tessuto del colorante OI usato (una sonda commerciale con eccitazione a 680 nm) per misurare l'attività MMP in vivo è di 72 ore. Per garantire una completa libertà, non è raccomandata una reinserzione del colorante prima di 7 giorni dopo un'iniezione preventiva.

4. Imaging ottico

  1. Posizionare un foglio di plastica o carta nera nella scatola nera dello scanner OI al centro del campo visivo (FOV).
  2. Impostare un protocollo di misurazione e scegliere la lunghezza d'onda destra (eccitazione: 680 ± 10 nm e eMissione: 700 ± 10 nm) e parametri di imaging.
    NOTA: in alcuni sistemi OI, è predefinito l'impostazione per diversi colori di imaging.
  3. Per scegliere il protocollo corretto per l'imaging di fluorescenza, aprire il software di imaging (fornito dal produttore) e inizializzare il sistema. La maggior parte delle telecamere CCD deve raffreddarsi alla loro temperatura di funzionamento, e questo può richiedere 10 minuti. Per risultati affidabili, attendere che il sistema sia pronto.
  4. Osservate che il pannello di controllo di acquisizione del sistema di imaging in vivo si apre e ciascuna coppia di filtri selezionata rappresenterà un'immagine nella sequenza. In questo caso, acquisire un'immagine con le coppie di filtri per la tintura commerciale con una lunghezza d'onda di eccitazione e emissione rispettivamente di 680 ± 10 nm e 700 ± 10 nm e avviare la misurazione (premere "Acquisire sequenza"). Per istruzioni più dettagliate, consultare il manuale del produttore.
  5. Etichettare le immagini in modo appropriato e salvare le informazioni nella "Modifica immagine"Etichette ", che verrà visualizzata dopo la" sequenza Acquisizione ".
  6. Prendere una scansione di base di ciascun animale prima dell'iniezione del colorante OI, o utilizzare animali di controllo ingenui per differenziare il segnale di sfondo.
  7. H dopo l'iniezione della vena della coda del colorante OI, mettere gli animali al centro del FOV, in grado di misurare il segnale più alto nel sistema OI e avviare le misurazioni.
    NOTA: Importante: l'ipotermia può influenzare sensibilmente la distribuzione degli agenti di imaging. Assicurarsi che la fase sia riscaldata fino a 37 ° C per evitare l'ipotermia dell'animale. L'imaging può essere eseguito simultaneamente con gli animali in gruppi da 1 a 5 topi. Scegliere la dimensione del FOV a seconda del numero di animali da misurare contemporaneamente. È possibile eseguire un'immagine a campo luminoso per verificare se ciascun mouse è visibile.

5. Analisi dei dati

NOTA: Esegui un'analisi dei dati utilizzando il seguente software di immagineProtocollo del produttore.

  1. Per le misurazioni di RA, utilizzare l'unità calibrata dell'emissione di fotoni come mostrato in Figura 2 , mentre la CHSR cronica è rappresentata come intensità del segnale in percentuale (efficienza).
  2. Per disegnare manualmente i ROI, utilizzare la piastra utensile. Per l'analisi delle immagini RA usate un cerchio standardizzato, posizionato intorno al segnale più alto in tutte le caviglie e zampe di ogni animale. Per analizzare il CHSR, posizionare i ROI intorno all'orecchio destro e sinistro in base all'immagine del campo luminoso.
  3. Per misurare le emissioni di fotoni oi valori di intensità del segnale nella specifica ROI disegnata, premere "misura". Il sistema fornirà valori nel ROI disegnato per analisi statistiche descrittive.

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Risultati

Per indurre l'artrite reumatoide (RA) in topi naive BALB / c, gli animali sono stati iniettati ip con auto-anticorpi (1: 1 diluizione con PBS 1x) contro GPI al giorno 0. L'infiammazione massima (gonfiore alle caviglie) in questo GPI-siero indotta modello di RA è il giorno 6 dopo l'iniezione 11. Pertanto, 2 nmol del colorante OI attivabile stata preparata ed iniettata iv nella vena caudale di topi artritici e animali sani di controllo ...

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Discussione

OI è uno strumento molto utile, veloce e poco costoso per l'imaging molecolare non invasivo in vivo nella ricerca preclinica. Una particolare forza di OI è la capacità di monitorare processi altamente dinamici come risposte infiammatorie. Inoltre, l'OI permette di seguire il corso di una malattia per un lungo periodo di tempo, che va dai giorni alla settimana.

L'OI ha diversi vantaggi rispetto ad altre modalità di imaging in vivo , come la tomografia a ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo Daniel Bukala, Natalie Altmeyer e Funda Cay per un ottimo supporto tecnico. Ringraziamo Jonathan Cotton, Greg Bowden e Paul Soubiran per aver redatto il manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Werner Siemens e dalla Facoltà di Medicina dell'Università Eberhard Karls Tübingen ('' Promotionskolleg '') e dal DFG attraverso la CRC 156 (progetto C3).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
CornergelGerhard Mann GmbH1224635unguento oftalmico 
ForeneAbbott GmbH4831850insulina isoflurano
U40Becton Dickinson and Company324876
HeparinSintetica6093089
High-Med-PE 0,28 x 0,61 mmReichelt Chemietechnik GmbH+Co28460tubo in polietilene, diametro interno 0,28 mm, diametro esterno 0,61  mm 
Aghi smussati regolari BD, 30 GBecton Dickinson & Co. Ltd.Cannulaper iniezione 305106 30 G
RTA-0011 Vaporizzatore isofluranoVetland Medical Sales and Services LLC-Artagain
carta da disegnoStrathmore Artist Paper446-8nero carbone
IVIS SpectrumPerkin Elmer124262Sistema di imaging ottico
BD Regular Bevel Needles, 25 GBecton Dickinson and Company305122
2-cloro-1,3,5-trinitrobenzeneSigma Aldrich GmbH7987456FTNCB
MMPSense 680Perkin Elmercolorante perimaging fluorescente
Oditest Koreplin GmbHC1X018misura meccanica
Miglyol 812SASOL-Oil
  BALB/C, C57BL/6Charles River Laboratories -Topi utilizzati per esperimenti
PBSSigma Aldrich GmbHPer la diluizione del siero AR 
Pipetta (100 & micro; L)Eppendorf Utilizzato per l'applicazione TNCB 
rasoio Wahl 9962Tagliacapelli di animali
Living Image Perkin Elmer Software di imaging per misurare l'OI
siringa da NEV10126

Riferimenti

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