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Articolo metodologico

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DOI:

10.3791/55183

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9 febbraio 2017

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1Biomedical Engineering, Tulane University

In questo articolo

Sommario

L'angiogenesi coinvolge interazioni multi-cellula e multi-sistema che devono essere studiate in un ambiente fisiologicamente rilevante. L'obiettivo di questo studio è dimostrare la capacità del modello di coltura del mesentere di ratto di effettuare confronti time-lapse di reti microvascolari intatte durante l'angiogenesi.

Abstract

L'angiogenesi, definita come la crescita di nuovi vasi sanguigni da vasi preesistenti, coinvolge le cellule endoteliali, periciti, cellule muscolari lisce, cellule del sistema immunitario, e il coordinamento con i vasi linfatici e nervi. Il multi-cella, interazioni multi-sistema comportano la necessità di ricerca di angiogenesi in un ambiente fisiologicamente rilevanti. Così, mentre l'uso di modelli di coltura cellulare in vitro hanno fornito intuizioni meccanicistici, una critica comune è che essi non riassumono la complessità associata con una rete microvascolare. L'obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare la possibilità di fare confronti time-lapse di reti microvascolari intatte, prima e dopo la stimolazione dell'angiogenesi nei tessuti di ratto coltivate mesentere. tessuti coltivati ​​contengono reti microvascolari che mantengono la loro gerarchia. etichettatura immunoistochimica conferma la presenza di cellule endoteliali, cellule muscolari lisce, periciti, vasi sanguigni e vasi linfatici. In unddition, etichettatura dei tessuti con BSI-lectina consente un confronto time-lapse di aree di rete locali prima e dopo la stimolazione siero o fattore di crescita caratterizzato da un aumento della germinazione capillare e densità dei vasi. Rispetto ai modelli comuni di coltura cellulare, questo metodo fornisce uno strumento per gli studi di lignaggio delle cellule endoteliali e specifica valutazione dei farmaci angiogenico tessuto in fisiologicamente rilevanti reti microvascolari.

Introduzione

Crescita della rete microvascolare e rimodellamento sono denominatori comuni per la funzione dei tessuti, la guarigione della ferita, e molteplici patologie e un processo chiave è l'angiogenesi, definita come la crescita di nuovi vasi sanguigni da quelli esistenti 1, 2. Per Tissue Engineering nuovi vasi o la progettazione di terapie basate angiogenici, comprendendo l'importanza delle dinamiche cellulari coinvolti nell'angiogenesi è fondamentale. Tuttavia, questo processo è complesso. Può variare in punti specifici all'interno di una rete microvascolare e coinvolge più tipi di cellule (ad esempio cellule endoteliali, cellule muscolari lisce, periciti, macrofagi, cellule staminali) e sistemi multipli (reti linfatici e reti neurali). Sebbene i modelli in vitro hanno contribuito enormemente ad esaminare il rapporto tra le diverse cellule coinvolte nell'angiogenesi 3, la loro rilevanza fisiologica può essere compromessa a causa di thei r limitata complessità e il fatto che essi non riflettono strettamente uno scenario in vivo. Per superare queste limitazioni, sistemi di coltura tridimensionale 3, ex vivo modelli di tessuto 4, sistemi microfluidici 5, 6, e 7 modelli di calcolo sono stati sviluppati e introdotti negli ultimi anni. Tuttavia, vi è ancora la necessità di un modello con funzionalità time-lapse per studiare l'angiogenesi in reti microvascolari intatti ex vivo. La creazione di nuovi modelli di time-lapse per gli studi di angiogenesi con quel livello di complessità fornirà uno strumento prezioso per comprendere i meccanismi alla base che regolano l'angiogenesi e per migliorare le terapie.

Un modello potenziale che permette alla ex vivo indagini dell'angiogenesi attraverso una rete microvascolare intatto è il modello di cultura mesentere ratto> 8. Nel recente lavoro, abbiamo dimostrato che il sangue e le reti microvascolari linfatici rimangono vitali dopo la cultura. Ancora più importante, il mesentere modello di cultura del ratto può essere utilizzato per studiare le interazioni funzionali periciti-endoteliale di cellule del sangue, e le connessioni delle cellule endoteliali linfatiche, e time-lapse imaging. L'obiettivo di questo lavoro è quello di fornire il nostro protocollo per il metodo time-lapse imaging. I nostri risultati rappresentativi documentano le molteplici tipi di cellule che rimangono vitali dopo la stimolazione dell'angiogenesi con siero e offrono esempi di utilizzo di questo metodo per quantificare specifiche risposte angiogenici dei tessuti così come endoteliali studi di monitoraggio delle cellule.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali e le procedure sono state approvate dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale della Tulane University (IACUC).

1. Procedura di impostazione chirurgica

  1. strumenti Autoclave, forniture chirurgiche, e le forniture di cultura prima dell'intervento. forniture chirurgiche per ogni ratto sono: 1 telo, 1 telo con foro pre-cut (0,5 x 1,5 in) al centro, garze, e 1 underpad assorbente. Strumenti chirurgici includono: 1 bisturi con lama numero 10, 2 paia di pinzette, e un paio di forbici sottili. forniture Cultura includono: 1 telo, 1 paio di pinzette, e preparati inserti 6 pozzetti con filtri in policarbonato.
  2. Sterilizzare una piattaforma plexiglass, una fase chirurgica e uno spazio banco chirurgica con il 70% di etanolo. Mantenere la fase chirurgica in una vaschetta sterile fino al momento dell'uso.
    1. Creare una fase chirurgica perforando un approssimativamente 2 da 1 nel foro al centro di un piatto di coltura a 100 mm. Successivamente, utilizzare carta vetrata per lisciarebordi taglienti e aggiungere uno strato di colla di silicone ai bordi del foro per creare una superficie sollevata per i tessuti.
    2. In alternativa, progettare la fase chirurgica utilizzando il software CAD e di fare del 3-D stampa (Figura 1).
  3. Posizionare un underpad assorbente sterile verso il basso e porre una piattaforma di plexiglas su di esso. Posizionare il telo, senza un foro pretagliato, su un tampone riscaldato accanto al underpad assorbente.
  4. Pre-caldo sterile PBS (PBS), mezzi di comunicazione e soluzione salina a 37 ° C. Inserire i supporti e PBS in piatti della cultura separati in cima alla piastra elettrica e il luogo di soluzione salina in una provetta da 50 ml accanto alla configurazione chirurgica.
  5. Assicurarsi che tutti i pacchetti vengono aperti prima dell'inizio della chirurgia per garantire una manipolazione sterile di tutti i materiali. Un elenco completo degli strumenti comuni utilizzati in questa procedura sono elencati nella Tabella di materiali chirurgici specifici e strumenti.

2. Mesentery Tissue raccolta

  1. Usa adulti ratti maschi Wistar (350 ± 25 g, 6 - 8 settimane di età). Altri ceppi e l'età dei ratti possono essere sostituiti.
  2. Anestetizzare ratto con una iniezione intramuscolare di ketamina (80 mg / kg di peso corporeo) e xilazina (8 mg / kg di peso corporeo). Confermare il ratto è sotto anestesia da pizzicare tra le dita per controllare che la risposta riflessa; ci dovrebbe essere nessuno. analgesia preventiva per questa procedura terminale non è necessaria.
  3. Radere la regione addominale e rimuovere i capelli rimanenti con crema depilatoria. Pulire la pelle addominale due volte con alcool isopropilico al 70% seguita da iodopovidone. Per le salviettine il chirurgo deve iniziare al centro del sito chirurgico e spostare all'esterno dell'area preparata in modo circolare da non sovrapporsi aree che sono stati precedentemente lavati con lo stesso pezzo di garza sterile o tampone di cotone sterile. Poi il trasferimento degli animali al setup chirurgica sterile e posizionare in cima alla piattaforma plexiglassmodulo.
  4. Utilizzando una lama di bisturi, fare un 0.75 a - 1.25 in incisione nell'intestino a partire dal 1 nel sotto lo sterno. Fare attenzione a non forare l'intestino o meso (1 strato di pelle, 1 strato di tessuto connettivo, e 1 strato di muscolo).
  5. Posizionare un drappo con un foro pre-taglio sopra l'incisione e posizionare una fase chirurgica sterile in cima al telo. Assicurarsi che le allinea apertura con l'incisione. Utilizzare applicatori di cotone con punta sterile per individuare ed estrarre l'ileo attraverso l'apertura fase chirurgica.
  6. Tirare 6 - 8 finestre mesenterica attraverso la fase utilizzando applicatori con punta in cotone, e fare attenzione a non toccare le finestre (Figura 1). I tessuti sono tipicamente raccolti dalla regione ileo dell'intestino tenue partire vicino cieco. Mantenere tessuti esposti umido con soluzione salina sterile riscaldato se necessario utilizzando una siringa sterile a gocciolare la soluzione.
  7. Euthanize il ratto mediante iniezione intracardiaca di sodio pentobarbital (0,2 ml per topo). Prima di rimuovere mefinestre senteric, assicurano il ratto è eutanasia palpando il cuore; ci dovrebbe essere nessun impulso.
  8. Rimuovere i tessuti mesentere desiderato utilizzando pinzette per afferrare il cuscinetto di grasso e forbici sottili per tagliare la finestra. Lasciare un bordo di grasso (2 mm) intorno alla finestra. Lavare i tessuti una volta riscaldato PBS sterile e una volta in media.
  9. Rientro ileo esteriorizzato alla cavità addominale e smaltire animali secondo le linee guida istituzionali.

3. Mesentere Tissue Culture per gli Studi Time-Lapse

  1. Trasferimento forniture autoclave cultura (vedere paragrafo 1.1) e dei tessuti ad una cappa a flusso laminare sterile.
  2. Utilizzare le pinzette per trasferire ogni tessuto in cima ad una membrana filtrante di policarbonato. tessuti afferrare da parte del cuscinetto di grasso per evitare di danneggiare il sistema vascolare.
  3. si diffuse rapidamente il tessuto con il cuscinetto adiposo, facendo attenzione a non toccare la finestra. Invertire l'inserto con il tessuto nel fondo di una piastra da 6 pozzetti e coprire con 3 mL di supporti (Figura 1 ). supporti tipici utilizzati per questa procedura include mezzi minimi essenziali (MEM) con 1% penicillina streptomicina (PenStrep) e il 10% siero fetale bovino (FBS). I supporti possono essere integrati con altri sieri e / o fattori di crescita per stimolare l'angiogenesi.
  4. Ripetere i passaggi 3,2-3,3 per ogni tessuto e la cultura in condizioni normali incubatore (5% di CO 2, 37 ° C) per un massimo di 5 giorni.

4. Time-Lapse Imaging di Mesentere Tissue

  1. Il giorno dell'imaging, integrare i media in ciascun pozzetto con coniugato BSI-lectina ed incubare in condizioni standard di coltura per 30 min. Lavare i tessuti due volte con mezzi privi di lectina. BSI-lectina macchia rimarrà visibile sul tessuto mesentere per un massimo di 3 giorni in coltura.
  2. Trasferire la lastra ad una fase microscopio. Identificare i vasi sanguigni e linfatici in base alla loro morfologia e la struttura di rete.
  3. Individuare un'area di rete desiderata su ogni tessuto e prendere le immagini. Prendere nota del dell'imagingposizione per garantire la stessa regione verrà catturato per le immagini successive. Se si utilizza un palco motorizzato, documentare le coordinate.
  4. Rientro tessuti per l'incubatore e continuare alla cultura fino punto finale desiderato. Ripetere i passaggi 4,1-4,3 come necessario a seconda momenti sperimentali desiderati.

5. Tessuto immunomarcatura

  1. BSI-lectina Etichettatura
    1. Incubare tessuti per 30 min a 37 ° C con 01:40 lectina FITC-coniugato in mezzi (2,5 mL di soluzione di anticorpi per pozzetto nella piastra da 6 pozzetti) seguito da due risciacqui con supporti. Per risciacqui, aggiungere media e quindi sostituire immediatamente.
  2. Live / Etichettatura Morto
    1. Incubare tessuti per 10 minuti a 37 ° C con 1: 500 2 mM etidio omodimero-1 e 1: 500 1 mM calceina AM in mezzi (2,5 mL di soluzione di anticorpi per pozzetto nella piastra da 6 pozzetti) seguito da due risciacqui con supporti.
  3. BSI-lectina / NG2 Labeling
    1. tessuti Stendere su un microscopio scivolaronoe (1 - 2 tessuti / slide) e lasciare asciugare. Rimuovere il grasso in eccesso con un bisturi, premendo con forza per asportare il grasso.
    2. Fix tessuti in metanolo freddo per 30 minuti a -20 ° C. Lavare tessuti con PBS (3 x 10 min).
    3. Per l'etichettatura anticorpo primario incubare tessuti per 1 ora a temperatura ambiente con 1: 100 di coniglio anticorpo policlonale NG2 e 5% di siero normale di capra (NGS). Lavare tessuti con PBS (3 x 10 min).
    4. Per l'etichettatura anticorpo secondario incubare tessuti per 1 ora a temperatura ambiente con 1: 100 di capra anti-coniglio coniugato CY2-anticorpi (GAR-CY2) e 5% NGS. Lavare tessuti con PBS (3 x 10 min).
    5. Incubare tessuti per 30 min a temperatura ambiente con 01:40 lectina FITC-coniugato in PBS seguito da due lavaggi con PBS. Per risciacqui, aggiungere PBS e quindi sostituire immediatamente.
    6. Per montare le diapositive, coprire i tessuti con 50:50 PBS e soluzione di glicerolo e posto coprioggetto sulla parte superiore. Sigillare i bordi di scorrimento con smalto.
  4. LYVE-1 / PECAM Labeling
    1. Stendere i tessuti su un vetrino da microscopio (1 - 2 tessuti / slide) e lasciare asciugare. Rimuovere il grasso in eccesso con un bisturi, premendo con forza per asportare il grasso.
    2. Fix tessuti in metanolo freddo per 30 minuti a -20 ° C. Lavare i tessuti con PBS + 0,1% saponina (3 x 10 min).
    3. Per l'etichettatura anticorpo primario incubare tessuti per 1 ora a temperatura ambiente con 1: 200 monoclonale biotinilato anticorpo CD31 e 1: 100 policlonale di coniglio LYVE-1 anticorpi in PBS + 0,1% saponina + 2% di albumina sierica bovina (BSA) + 5% NGS . Lavare i tessuti con PBS + 0,1% saponina (3 x 10 min).
    4. Per l'etichettatura anticorpo secondario, incubare tessuti per 1 ora a temperatura ambiente con 1: anticorpi streptavidina 500 CY3 coniugato e 1: 100 GAR-CY2 in PBS + 0,1% saponina + 2% BSA + 5% NGS. Lavare i tessuti con PBS + 0,1% saponina (3 x 10 min).
    5. Per montare scivoli, i tessuti di copertura con 50:50 soluzione PBS e glicerolo e mettere un coprioggetto sulla parte superiore. Sigillare i bordi di scorrimento con smalto.
  5. BrdU / BSI-lectina Etichettatura
    1. Aggiungere 1 mg / mL BrdU a media e sostituire il supporto del tessuto con una soluzione di BrdU. Incubare per 2 ore a 37 ° C.
    2. Stendere i tessuti su un vetrino da microscopio (1 - 2 tessuti / slide) e lasciare asciugare. Rimuovere il grasso in eccesso con un bisturi, premendo con forza per asportare il grasso.
    3. Fix tessuti in metanolo freddo per 30 minuti a -20 ° C. Lavare tessuti con PBS (3 x 10 min).
    4. Denaturare il DNA del tessuto a 2 M HCl per 1 ora a 37 ° C. Lavare tessuti in PBS + 0,1% saponina (3 x 10 min).
    5. Per l'etichettatura anticorpo primario, incubare tessuti per 1 ora a temperatura ambiente con 1: 100 monoclonale anti-BrdU in PBS + 0,1% saponina + 2% BSA + 5% NGS. Lavare i tessuti con PBS + 0,1% saponina (3 x 10 min).
    6. Per l'etichettatura anticorpo secondario, incubare tessuti per 1 ora a temperatura ambiente con 1: anticorpi 100 di capra anti-topo Cy3-coniugati (GAM-Cy3) in PBS + 0,1% saponina + 2% BSA + 5% NGS. Lavare i tessuti con PBS + 0,1% saponina (3 x 10 min).
    7. incubare tessuti per 30 min a temperatura ambiente con 01:40 lectina FITC-coniugato in PBS seguito da due lavaggi con PBS.
    8. Per montare le diapositive, i tessuti di copertura con 50:50 PBS e soluzione di glicerolo e luogo coprioggetto sulla parte superiore. Sigillare i bordi di scorrimento con smalto.
  6. BSI-lectina / etichettatura CD11b
    1. Stendere i tessuti su un vetrino da microscopio (1 - 2 tessuti / slide) e lasciare asciugare. Rimuovere il grasso in eccesso con un bisturi, premendo con forza per asportare il grasso.
    2. Fix tessuti in metanolo freddo per 30 minuti a -20 ° C. Lavare i tessuti con PBS + 0,1% saponina (3 x 10 min).
    3. Per l'etichettatura anticorpo primario incubare tessuti per 1 ora a temperatura ambiente con 1: 100 topo anti-ratto CD11b in PBS + 0,1% saponina + 2% BSA + 5% NGS. Lavare i tessuti con PBS + 0,1% saponina (3 x 10 min).
    4. Per l'etichettatura anticorpo secondario incubare tessuti per 1 ora a temperatura ambiente con 1: 100 GAM-Cy3 in PBS + 0,1% saponina + 2% BSA + 5% NGS. Lavare i tessuti con PBS+ 0,1% saponina (3 x 10 min).
    5. Incubare tessuti per 30 min a temperatura ambiente con 01:40 lectina FITC-coniugato in PBS seguito da due lavaggi con PBS.
    6. Per montare le diapositive, i tessuti di copertura con 50:50 PBS e soluzione di glicerolo e luogo coprioggetto sulla parte superiore. Sigillare i bordi di scorrimento con smalto.

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Risultati

Dopo 3 giorni in coltura, tessuti sono stati etichettati con un / morti kit di sopravvivenza / citotossicità diretta per dimostrare la fattibilità del microcircolo nel ratto mesentere cultura modello (Figura 2A). La maggior parte delle cellule presenti nel mesentere è rimasto vitale nella cultura in cui le cellule endoteliali sono stati individuati in base alla loro posizione nei segmenti microvascolari. Proliferazione delle cellule endoteliali è stata confermata anche m...

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Discussione

Questo protocollo documenta un metodo per l'utilizzo del modello di cultura di ratto mesentere come uno strumento ex vivo per l'imaging time-lapse di crescita della rete microvascolare. Impieghi precedenti nel nostro laboratorio ha stabilito l'uso del nostro modello di 1) angiogenesi 8, 2) linfoangiogenesi 8, 3) periciti-endoteliali interazioni cellulare 8, e 4) anti-angiogenico test anti-droga 9. La poss...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health Grant 5-P20GM103629 a WLM e al Tulane Center for Aging. Ringraziamo Matthew Nice per il suo aiuto nella redazione del testo del protocollo.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
DrappoCardinal Health401212 "x 12" Bio-Shield Regular Sterilization Wraps
Scalpel HandleRoboz Surgical InstrumentRS-9843Scalpel Handle, #3; Solido; lama chirurgica sterile da 4" di lunghezza
Cincinnati Surgical0110in acciaio inossidabile; Piatto di coltura misura 10
(60 mm)Pinza per 130181 Thermo Scientific10/Sleeve
Graefe (pinzette curve)Strumento chirurgico RobozRS-5135Pinza per micro dissezione; Seghettato; leggera curva; Larghezza della punta 0,8 mm; Pinza Graefe da 4" di lunghezza
(pinzette dritte)Strumento chirurgico RobozRS-5130Pinza per micro dissezione; seghettato, dritto; Larghezza della punta 0,8 mm; 4" di lunghezza
Noyes Micro ForbiceRoboz Strumento chirurgicoRS-5677Noyes Micro Forbici a molla per dissezione;
punte diritte, affilate-smussate; Tagliente da 13 mm; 0,25 mm di larghezza della punta, 4 1/2" di lunghezza totale
GarzeFisherBrand13-761-52Spugne di garza di cotone non sterili; 4" x 4" 12"
Applicatori in cotoneFisherBrand23-400-1246" di lunghezza; fusto in legno; Piastra monouso a
6 pozzettiFisher Scientific08-772-49Fondo piatto con coperchio a bassa evaporazione; Polistirene; Syring sterile apirogeno
5 mLFisher Scientific14-829-45Luer-Lok
Tip Ciotola sterileMedical Action Industries Inc.0123232 oz. Busta a buccia; Blu; Inserti sterili monouso
per piastre a 6 pozzetti (CellCrown Inserts)SIGMAZ681792-3EA; Filtro a membrana in policarbonato non sterile
SIGMATMTP04700Isopore Filtro a membrana; Policarbonato; Idrofilo; 5,0  µ m, 47  mm, Bianco Semplice
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti/Descrizione
BeuthanasiaSchering-Plough Animal Health Corp. Union (Ordinato da MWI Veterinary Supply)MWI #: 011168Principio attivo: Per 100 ml, 390 mg di pentobarbital sodico, 50 mg di fenitoina sodica 
KetaminaFort Dodge Animal Health (Ordinato da MWI Veterinary Supply)MWI #: 000680Kateset 100 mg/mL
XilazinaLLOYD. Inc. (Ordinato da MWI Veterinary Supply)MWI #: 000680Anased 100 mg/mL
Soluzione salinaBaxter2F7122
PBSInvitrogen14040-133
MEMInvitrogen11095080
PenStrepInvitrogen15140-122
FBSInvitrogen16000-044
BSAJackson ImmunoResearch001-000-162
Saponina SIGMAS7900-100G
Fisher ScientificS25372
Operando povidone-iodio82-226
Acido cloridricoSIGMA320331
MetanoloFisher Scientific67-56-1
GliceroloFisher Scientific56-81-5
FITC-coniugato LectinaSIGMAL9381-2MG
Anti-NG2 Condroitina Solfato Anticorpo ProteoglicanoSIGMAAB5320
PECAM (CD31) AnticorpoBD Biosciences555026
LYVE-1 AnticorpoAngioBio Co.11-034
Anticorpo coniugato Cy2 anti-coniglio di capraJackson ImmunoResearch111-585-144
Anticorpo coniugato Cy3 anti-topo di capraJackson ImmunoResearch115-227-003
Anticorpo coniugato Cy3 streptavidina JacksonImmunoResearch016-160-084
Kit di vitalità/citotossicità vivo/mortoInvitrogenL3224
Siero di capra normale Jackson ImmunoResearch005-000-121
5-Bromo-2'-DeossiuridinaSIGMAB5002
Monoclonale di Topo Anti-Bromodeossiuridina                                              Clone Bu20aDakoM074401-8
Topo Anti-Topo CD11b AbD SerotecMCA275R
a 12 strati Inserti per piastre a 6 pozzetti Alcool isopropilico

Riferimenti

  1. Carmeliet, P., Jain, R. K. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature. 407 (6801), 249-257 (2000).
  2. Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
  3. Kaunas, R., Kang, H., Bayless, K. J. Synergistic Regulation of Angiogenic Sprouting by Biochemical Factors and Wall Shear Stress. Cell Mol Bioeng. 4 (4), 547-559 (2011).
  4. Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat Protoc. 5 (9), 1518-1534 (2010).
  5. Song, J. W., Munn, L. L. Fluid forces control endothelial sprouting. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (37), 15342-15347 (2011).
  6. Chan, J. M., et al. Engineering of in vitro 3D capillary beds by self-directed angiogenic sprouting. PLoS One. 7 (12), e50582(2012).
  7. Peirce, S. M., Mac Gabhann, F., Bautch, V. L. Integration of experimental and computational approaches to sprouting angiogenesis. Curr Opin Hematol. 19 (3), 184-191 (2012).
  8. Stapor, P. C., Azimi, M. S., Ahsan, T., Murfee, W. L. An angiogenesis model for investigating multicellular interactions across intact microvascular networks. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (2), H235-H245 (2013).
  9. Azimi, M. S., et al. An ex vivo model for anti-angiogenic drug testing on intact microvascular networks. PLoS One. 10 (3), e0119227(2015).
  10. Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Lab Invest. 63 (1), 115-122 (1990).
  11. Hutter-Schmid, B., Kniewallner, K. M., Humpel, C. Organotypic brain slice cultures as a model to study angiogenesis of brain vessels. Front Cell Dev Biol. 3, 52(2015).
  12. Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat Protoc. 5 (10), 1659-1665 (2010).
  13. Unoki, N., Murakami, T., Ogino, K., Nukada, M., Yoshimura, N. Time-lapse imaging of retinal angiogenesis reveals decreased development and progression of neovascular sprouting by anecortave desacetate. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (5), 2347-2355 (2010).
  14. Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).
  15. Kelly-Goss, M. R., Sweat, R. S., Azimi, M. S., Murfee, W. L. Vascular islands during microvascular regression and regrowth in adult networks. Front Physiol. 4, 108(2013).
  16. Kelly-Goss, M. R., et al. Cell proliferation along vascular islands during microvascular network growth. BMC Physiol. 12, 7(2012).
  17. Skalak, T. C., Price, R. J. The role of mechanical stresses in microvascular remodeling. Microcirculation. 3 (2), 143-165 (1996).
  18. Kadohama, T., Nishimura, K., Hoshino, Y., Sasajima, T., Sumpio, B. E. Effects of different types of fluid shear stress on endothelial cell proliferation and survival. J Cell Physiol. 212 (1), 244-251 (2007).
  19. Milkiewicz, M., Brown, M. D., Egginton, S., Hudlicka, O. Association between shear stress, angiogenesis, and VEGF in skeletal muscles in vivo. Microcirculation. 8 (4), 229-241 (2001).
  20. Corliss, B. A., Azimi, M. S., Munson, J. M., Peirce, S. M., Murfee, W. L. Macrophages: An Inflammatory Link Between Angiogenesis and Lymphangiogenesis. Microcirculation. 23 (2), 95-121 (2016).

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