Articolo metodologico

Un cellulare semplice Red Blood Metodo Lysis per l'istituzione di B linfoblastoidi linee cellulari

DOI:

10.3791/55191

⸱

14 gennaio 2017

 ,  , 
1Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, 2Genetic Resources Center, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences

In questo articolo

Sommario

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Un semplice metodo di lisi dei globuli rossi per stabilire B-LCL stato sviluppato con alta efficienza di immortalizzazione, richiede una piccola quantità di sangue e risparmio di tempo tra l'inizio di crioconservazione.

Abstract

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Esistono numerosi metodi per la trasformazione dei linfociti B da parte del virus di Epstein Barr in vitro in linee cellulari immortalizzate. Abbiamo sviluppato un nuovo metodo con una strategia potente e semplice per l'istituzione di B-LCLs, il metodo di lisi dei globuli rossi. Questo metodo ha semplificato la procedura di separazione della PBMC con la rimozione dei globuli rossi e ha utilizzato un minimo di 0,5 ml di sangue intero per stabilire linee cellulari immortalizzate da EBV, che possono proliferare in un numero elevato di cellule in un tempo relativamente breve con un tasso di successo del 100%. Il metodo è semplice, affidabile, fa risparmiare tempo e si applica al trattamento di un gran numero di campioni clinici.

Introduzione

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Le cellule B a riposo potrebbero essere trasformate dal virus di Epstein-Barr (EBV) in vitro in linee cellulari linfoblastoidi B (B-LL) che proliferano attivamente. Le B-LCL sono simili alle cellule germinali nella differenziazione e nello sviluppo e il tasso di mutazione somatica delle B-LCL è stato solo dello 0,3%1, con alterazione genetica e fenotipica trascurabile. Pertanto, i B-LCL, come surrogati delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC), hanno sostanzialmente accelerato il progresso dello studio genomico, trascrittomico e proteomico delle malattie associate all'EBV2,3. Inoltre, i B-LCL hanno anche importanti applicazioni nello screening degli anticorpi monoclonali4,5.

Sono stati sviluppati diversi metodi per l'immortalizzazione dei linfociti B da parte di EBV. Le procedure più comuni includono l'isolamento dei linfociti B e l'uso di linee cellulari B95-8 per produrre EBV infettivo. Dall'isolamento alla trasformazione, questi metodi si dividono in tre strategie. I linfociti vengono separati dal sangue fresco mediante centrifugazione in gradiente di densità e trasformazione diretta di EBV6-8, chiamato metodo di separazione in gradiente di densità in questo studio. Tuttavia, altre tecniche superano la difficoltà di spedire sangue fresco e utilizzano una procedura per il congelamento dei linfociti purificati e il successivo scongelamento e l'infezione da EBV9-11. Il sangue intero crioconservato può essere utilizzato anche per l'isolamento dei linfociti B e la trasformazione12,13. Oltre alla centrifugazione a gradiente di densità per separare i linfociti B, alcuni ricercatori utilizzano un selezionatore di cellule magnetiche per selezionare i linfociti B12. Tuttavia, la separazione magnetica è un processo costoso, complesso e dispendioso in termini di tempo. Sebbene questi metodi siano utili per immortalare i linfociti B con un alto tasso di successo, la necessità di trattare un gran numero di campioni clinici e il volume relativamente piccolo di sangue richiedono un metodo più semplice per la creazione di una linea cellulare permanente.

Un altro metodo meno comunemente usato è l'uso del sangue intero come fonte di cellule nucleate per l'infezione da EBV e la creazione di B-LCL. Questi metodi semplificano la tecnica omettendo la procedura di separazione. Solo una piccola quantità di sangue intero, fresco14 o congelato15,16, è sufficiente per ottenere le linee cellulari. Sfortunatamente, c'è una grande variabilità nel successo dai documenti15,16 e da molti dei nostri test di convalida. Inoltre, le colonie trasformate sono difficilmente riconoscibili al microscopio a causa delle grandi impurità contaminanti. Pertanto, è necessario un metodo più affidabile per la trasformazione.

Sulla base delle considerazioni di cui sopra, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per stabilire B-LCL senza previa purificazione dei linfociti, chiamato metodo di lisi dei globuli rossi. Questo metodo è conveniente, fa risparmiare tempo ed è applicabile a un gran numero di campioni. Appena 0,5 ml di sangue intero sono stati sufficienti per ottenere B-LCL che sono facilmente ottenibili da neonati e anziani senza danneggiare in modo significativo la loro salute.

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Protocollo

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Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Istituto di Genetica e Biologia dello sviluppo, e il protocollo segue le linee guida istituzionali per il benessere umano.

1. Preparazione di EB Virus

  1. Il giorno 1, scongelare B95-8 cellule e di coltura in 6 mL completo RPMI 1640 medium, supplementato con 10% siero fetale bovino, 2 mM L-glutammina e antibiotici (100 mg / ml di streptomicina, 100 U / ml penicillina) in un T25 pallone di coltura. Mettere il pallone di coltura in 5% CO 2 incubatore a 37 ° C.
  2. Il giorno 2, osservare la morfologia delle cellule al microscopio. Le cellule sono in buone condizioni quando sono luminose e rotondo. Aggiungere 10 ml completo di media RPMI 1640.
  3. Il giorno 4, aggiungere 10 ml di fresco completo RPMI 1640, e poi trasferire in un pallone di coltura T75.
  4. Il giorno 8, aggiungere 20 ml completo di media RPMI 1640.
  5. Mantenere le cellule per 8 giorni senza l'aggiunta di mezzo fresco, vale a dire, la fame.
  6. Il giorno 16, osservare le celluleosservata al microscopio. Raccogliere le cellule in una provetta da 15 centrifuga, 12 ml / provetta.
  7. Cryo-conservazione a -80 ° C per 1 ora, e poi rapidamente scongelare a 37 ° C. Ripetere 3 volte fino a quando le particelle virali vengono rilasciati dalle cellule.
  8. Centrifugare a 240 xg per 10 min a temperatura ambiente.
  9. Filtrare il surnatante attraverso un filtro di 0,22 micron, aliquota, 12 mL / tubo, e conservare a -80 ° C.

2. Trattamento di sangue intero con Globulo rosso Lysis Buffer

  1. Aggiungere 0,5 ml di sangue intero anticoagulato con EDTA · K 2 in una provetta da 15 ml.
  2. Mettere 1 ml tampone di lisi dei globuli rossi (filtrati da 0,22 micron filtro e scongelati a temperatura ambiente prima dell'uso) per il sangue intero e mescolare bene. Posizionare la miscela a temperatura ambiente per 4 min. Poi aggiungere 5 - 7 mL PBS 1x rapidamente alla reazione di arresto.
  3. Centrifugare a 240 xg per 5 min a temperatura ambiente. I globuli bianchi precipitano sul fondo della provetta.
  4. Eliminare il surnatante e lavare la precipitazione con l'aggiunta di 7 ml 1640 medium di base. Centrifugare per 5 minuti a 240 xg a temperatura ambiente. Ripetere due volte.
  5. Risospendere il pellet di cellule in 300 microlitri di media trasformazione (terreno RPMI 1640, contenente 20% di siero fetale bovino e 10 ug / ml fitoemoagglutinina (PHA)).

3. EBV infezione

  1. Aggiungere 60 ml di 20 mg / ml ciclosporina A (CsA) alla sospensione cellulare.
  2. Rapidamente scongelare un'aliquota di EBV a 37 ° C. Aggiungere 240 microlitri EBV alla sospensione cellulare.
  3. Mescolare bene e mettere la sospensione cellulare ad una piastra a 96 pozzetti, 200 ml per pozzetto. Per evitare l'evaporazione, aggiungere 200 microlitri di PBS 1x ad ogni bene intorno della piastra a 96 pozzetti. Porre la piastra in un incubatore CO 2 5% a 37 ° C.

4. Ampliamento e crioconservazione di B-LCL

  1. Modificare la metà del mezzo una volta a settimana per il primo mese dopo l'infezione da EBV. Solo un laye spessorer di frammenti cellulari è visibile al microscopio al giorno 7 (figura 2). Dopo un mese di infezione EBV, gruppi di cellule linfoblastoidi sono visibili sotto uno spesso strato di frammenti cellulari al microscopio (Figura 2).
  2. Cambiare la metà del mezzo ogni 3 giorni fino a quando i gruppi di cellule sono chiaramente visibili al microscopio (Figura 2). In genere, questo processo richiede da 10 a 20 giorni.
  3. Dopo la miscelazione, pipettare le cellule e trasferire alla piastra 24 pozzetti. Raddoppiare il volume di terreno di coltura con completo RPMI 1640 mentre diventa giallo. Questo processo dipende dal tasso di crescita cellulare.
  4. Successivamente, trasferire le cellule a pallone di coltura T25. Raddoppiare il volume del terreno di coltura come risulta giallo finché il volume del mezzo espande a 10 - 15 mL.
  5. Cambiare media 24 ore prima del congelamento. sospensione cellulare Centrifugare per 5 min a 240 x g. Contare le cellule con un contatore di cellule e congelare ad una densità di 5 - 10 x 10 6 / ml in frSoluzione Ozen contenente 90% FBS e il 10% dimetilsolfossido (DMSO). Congelare a una velocità di 1 ° C per min a -80 ° C e poi trasferire direttamente in azoto liquido.

5. 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil-tetrazolio bromuro (MTT) Assay 17

  1. Preparare una sospensione singola cellula B-LCL con il mezzo 1640 contenente il 10% di siero fetale bovino. Seed 3 x 10 4 cellule per pozzetto sulla piastra da 96 pozzetti, 100 ml per pozzetto.
  2. Porre la piastra in 5% CO 2 incubatore a 37 ° C per 12 - 16 h.
  3. Aggiungere MTT (5 mg / ml) per i pozzi in cui le cellule sono in crescita e tenere lontano dalla luce per 4 ore a 37 ° C.
  4. piastra di cella Centrifugare per 10 min a 168 x g.
  5. Rimuovere il surnatante e aggiungere 100 ml di DMSO per pozzetto.
    NOTA: Attenzione. Non toccare i cristalli di colorante aghiformi.
  6. Agitare la piastra per 10 min a bassa velocità per sciogliere completamente i cristalli.
  7. l'assorbimento di misura a 570 nm perutilizzando uno spettrofotometro per micropiastre.

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Risultati

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Durante il processo di trasformazione, i cambiamenti morfologici di cellule sono visualizzati al microscopio ottico (Figura 2). Piccoli gruppi di cellule erano chiaramente visibile con il metodo di separazione gradiente di densità dopo 7 giorni di infezione, mentre solo uno spesso strato di frammenti cellulari sono visibili dal metodo di lisi dei globuli rossi. Tuttavia, gruppi di cellule linfoblastoidi sono visibili sotto lo spesso strato di frammenti di cellule di 30 g...

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Discussione

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Riportiamo lo sviluppo di un nuovo metodo per immortalare cellule B umane da sangue intero mediante lisi dei globuli rossi, e la sua vitalità cellulare dei stabilita B-LCL è stata valutata mediante il saggio MTT. I risultati hanno mostrato che la vitalità cellulare di B-LCL stabilita con il metodo di lisi dei globuli rossi è molto superiore a quella del metodo di separazione gradiente di densità. Il principale vantaggio del metodo di lisi dei globuli rossi è che è semplice e richiede un piccolo volume (non più di 0,5 ml...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato dai progetti chiave dell'Accademia Cinese delle Scienze (KFZD-SW-205), sistema strategico di supporto tecnologico delle risorse biologiche dell'Accademia Cinese delle Scienze (CZBZX-1).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
CentrifugaTechcompCT6Tautomatizzato per centrifugazione
 Countstar  IC 1000 Per il conteggio delle cellule 
Spettrofotometro per micropiastre EpochBioTek InstrumentsSN263839Per misurare l'assorbanza
colture cellulari a 96 pozzettiCorning Incorporated3599piastre in polistirene
cluster di colture cellulari a 24 pozzettiCorning Incorporated3524piastre in polistirene
25 cm2 pallone per colture cellulariNido707001Polistirene nbsp;
FBSGibco10270Componente di B-LCLs medio
RPMI medio 1640Gibco31800-022Per B-LCLs medio
L-Glutammina   Amresco0374Componente di B-LCLs medio
100x streptomicina penicillina soluzione BioRoYeeBRY-2309BioRoYeeBRY-2309Componente di B-LCLs medio
Ficoll paque plusGE  Sanità17-1440-03Per in vitro isolamento del linfocita
PHA-MSigma L8902Per stimolare la proliferazione dei linfociti
Ciclosporina ACayman  Sostanza chimica12088Per inibire l'effetto di citotossicità delle cellule
T Tampone di lisi dei globuli rossiTiangenRT122-01Per la lisi dei globuli rossi
MTTAmresco0793Per il rilevamento della vitalità cellulare
DMSOSigmaD2650Per il congelamento delle cellule
Contatore di celle cluster di

Riferimenti

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