Method Article

La visualizzazione delle variazioni del ciclo cellulare e la determinazione di nucleazione in postnatali cardiomiociti

DOI:

10.3791/55204

⸱

February 24th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Physiology I, University of Bonn

In This Article

Summary

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Per distinguere la divisione cellulare dalle variazioni del ciclo cellulare nei cardiomiociti, presentiamo protocolli che utilizzano due linee di topi transgenici: Myh6-H2B-mCh topi transgenici, per l'identificazione inequivocabile dei nuclei dei cardiomiociti, e topi CAG-eGFP-anillina, per distinguere la divisione cellulare dalle variazioni del ciclo cellulare.

Abstract

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I cardiomiociti sono soggetti a variazioni del ciclo cellulare, come l'endoreduplicazione (cicli continui di sintesi del DNA senza cariocinesi e citochinesi) e la mitosi acicitocinetica (cariocinesi ma senza citochinesi). Tali variazioni atipiche del ciclo cellulare provocano cellule poliploidi e multinucleate piuttosto che la divisione cellulare. Pertanto, per determinare il turnover e la rigenerazione cardiaca, è di fondamentale importanza identificare correttamente i nuclei dei cardiomiociti, il numero di nuclei per cellula e il loro stato del ciclo cellulare. Ciò è particolarmente vero per l'uso di marcatori nucleari per identificare l'attività del ciclo cellulare, come gli analoghi della timidina Ki-67, PCNA o pHH3. Qui presentiamo i metodi per riconoscere i cardiomiociti e la loro nuclearità e per determinare la loro attività del ciclo cellulare. Utilizziamo due sistemi transgenici pubblicati: la linea di topi transgenici Myh6-H2B-mCh, per l'identificazione inequivocabile dei nuclei dei cardiomiociti, e la linea di topi CAG-eGFP-anillina, per distinguere la divisione cellulare dalle variazioni del ciclo cellulare. Combinati insieme, questi due sistemi facilitano lo studio della rigenerazione cardiaca e della plasticità.

Introduction

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La corretta identificazione dei nuclei cardiomiociti e lo stato del ciclo cellulare è di cruciale importanza per la determinazione del fatturato muscolo cardiaco e la rigenerazione. Ciò è particolarmente vero per l'uso di marcatori nucleari, come pHH3, Ki-67, o analoghi della timidina, per l'identificazione dell'attività ciclo cellulare. Poiché la capacità proliferativa dei cardiomiociti mammiferi adulti è molto piccolo 1, una falsa identificazione di un nucleo positivo per un marker di proliferazione di un nucleo cardiomiociti potrebbe fare una differenza cruciale nel risultato di un saggio di proliferazione. Inoltre, cardiomiocit....

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Protocol

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Tutte le procedure di questo protocollo che coinvolge gli animali erano in conformità con gli standard etici della Università di Bonn e rispettate le linee guida della direttiva 2010/63 / UE del Parlamento europeo sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici.

1. In Vitro visualizzazione di Cell ciclo di attività in postnatale cardiomiociti

  1. Postnatale dissociazione cardiomiociti
    1. preparazioni pre-sperimentali
      1. Preparare terreni di coltura (IMDM, 1% di penicillina / streptomicina, aminoacidi non essenziali 1%, 0,1% β-mercaptoetanolo); medio 1: aggiungi FCS al 2%; media 2: aggiungere FCS al....

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Results

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Al fine di analizzare gli effetti di siRNA / miRNA sull'attività ciclo cellulare di cardiomiociti post-natale in vitro, cardiomiociti di topi Myh6-H2B-MCH / CAG-eGFP-anillin doppio transgenici sono stati isolati in postnatale giorno 3 (P3) e transfettate con ciclo cellulare attività che inducono miR199 5, siRNA p27, e siRNA Fzr1. Rispetto al controllo negativo (Figura 1A), le immagini di miR199- (Figura 1B) e siRNA p27- <.......

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Discussion

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C'è una polemica sul fatto cardiomiociti sono in grado di rientrare nel ciclo cellulare e dividere dopo l'infortunio e durante l'omeostasi dei tessuti. I valori per il fatturato base dei cardiomiociti hanno ricevuto nell'intervallo tra 1% e 80% 1 7. Anche dopo una lesione cardiaca, l'induzione dell'attività ciclo cellulare e la generazione di nuovi cardiomiociti è stata riportata nella zona di confine, con valori compresi tra 0,0083%

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Disclosures

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgements

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Ringraziamo S. Grünberg (Bonn, Germania) e P. Freitag (Bonn, Germania) per la loro assistenza tecnica.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Piastra Petri 10 cmSarstedt821472
100 µ Filtro per cellule mBecton Dickinson GmbH/Falcon352360
2,3-Butandione monoxime (BDM)Sigma-AldrichB0753
G20x1 ½ cannula per iniezione, StericanBraun, Melsungen4657519
ago calibro 20Becton Dickinson GmbH301300
piastre a 24 pozzettiBecton Dickinson GmbH/Falcon353047
2-metil-butanoCarl Roth GmbH + Co. KG3927.1
Soluzione di formaldeide al 37%AppliChem GmbH A0936,1000
Rubinetto a 3 vieB. Braun Medical Inc.16494C
Siringa da 50 mlB. Braun Medical Inc.8728810F
70% etanoloOtto Fischar GmbH27669
Alexa-Anticorpo secondario coniugato con fluor,Jackson ImmunoResearch115-605-205
Alfa-Aktinin EA-53, IgG di topoSigma-Aldrich, SteinheimA7811
CaCl2Sigma-AldrichC4901
Micropiastra per colture cellulari, 96 pozzetti, Mezza areaGreiner bio-one675986
Collagenasi BRoche11088815001
microscopio confocale Eclipse Ti-ENikon
criostato CM 3050SSiero
Jackson Immuno Research, Suffolk, GB017-000-121
Soluzione salina tamponata con fosfato di DulbeccoSigma-AldrichD8537
EDTASigma-AldrichE4884
fetale di vitelloPromoCell,
(4%)PanReac AppliChemA3697
Gelatina da pelle suina, tipo ASigma-Aldrich,G2500
VWR631-0146
GlucosioSigma-AldrichG7021
Heidelberger tubo di prolungaIMPROMEDIFORM GmbHMF 1833
Eparina-NatrioRatiopharm5394.02.00
HEPESSigma-AldrichH3375
HistoBond vetrini per microscopioMarienfeld0810000
Hoechst 33342 (1  mg/mL)Sigma Aldrich, TaufkirchenB2261
Siringa da insulinaBecton Dickinson GmbH300334
Iscove' s Dulbecco' modificato s Medium (IMDM)Gibco/Life Technologies, Darmstadt21980-032
KClSigma-AldrichP9333
LamininCorning354221
Laser Scanning Mikroskop Eclipse TiNikoninstruments, Dü
Lipofectamine RNAiMAXInvitrogen/Life Technologies, Darmstadt13778075
Topo IgG Cy5 (asino)Jackson ImmunoResearch715-175-151
MgCl2Sigma-AldrichM8266
provetta per microcentrifugaSarstedt72690
Mini agitatoreVWR12620-940
mirVana miRNA mimic, has-miR199a-3pAmbion/Thermo Fischer Scientific4464066
Biopsy MoldSakura Finetek/ VWR4565
M-slide 8-well ibiTreatibidi80826
NaClSigma-AldrichS9888
NaOHMerck Millipore567530
negativo controllo (RNA criptato)Ambion/Thermo Fischer ScientificAM4611
Kit di dissociazione cardiaca neonataleMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach130-098-373
Elementi NIS AR 4.12.01-4.30.02-64bitNikoninstruments, Dü
Aminoacidi non essenziali, NEAAGibco/Life Technologies, Darmstad11140-035
Opti-MEM, Siero ridotto MediumGibco51985-026
P21-siRNAAmbion/Thermo Fischer Scientific 4390771
P27-siRNAAmbion/Thermo Fischer Scientific4390771
Penicillina/StreptomicinaGibco/Life Technologies, Darmstadt15140-122
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Sigma-Aldrich, Steinheim14190-094
Mezzo di montaggio in alcool polivinilico con DABCO®, antifadingSigma-Aldrich10981
RNase AQiagen1007885
RNaseZapInvitrogen/Life Technologies, DarmstadtAM9780
contenitori per campioniVitlab80731
Pipetta sierologicaGreiner607180
software NIS ElementsNikon
SucroseSigma-AldrichS0389
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura Finetek/ VWR25608-930
ToPro3 ioduro (642/661)Molecolare sonde/ThermoFisher ScientificT3605
TrisSigma-AldrichT1503
Triton XFluka93418
Triton X-100Fluka93418
TripsinaSigma-AldrichT1426
Agglutinina di germe di grano (WGA) Fluoresceina marcataVector LaboratoriesVEC-FL-1021-5
Anticorpo &alfa;-actininaSigma-AldrichA7811
β-MercaptoetanoloSigma-Aldrich, SteinheimM3148
, , , , d'asino Leica siero soluzione di formaldeide Heidelberg vetrini coprioggetti Steinheim sseldorfsseldorf

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  2. Raulf, A., et al. Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell ....

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