È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Sviluppo di un sistema di consegna economico DNA da "Acufection" e la sua applicazione alla ricerca della pelle

6.8K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/55206

⸱

19 aprile 2017

 ,  , 
1Graduate Institute of Immunology, National Taiwan University College of Medicine

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo è un'alternativa economica per esprimere il DNA plasmidico nudo in pelle topo. L'obiettivo generale del protocollo è quello di consegnare i geni immuno-correlati nel tessuto della pelle di delineare il ruolo funzionale di un gene specifico in infiammazione cutanea.

Abstract

Disregolazione della risposta immunitaria in pelle è associata a numerosi disturbi della pelle umana. Trasferimento diretto dei geni immuno-correlati nel tessuto della pelle è un approccio interessante per indagare la modulazione immunitaria di infiammazione cutanea in modelli murini di malattie umane. Qui vi presentiamo un protocollo costo-efficacia che ha trasportato DNA nudo in pelle mouse e porta alla espressione del transgene. Il metodo è coniato "acufection", che denota acu DNA puntura mediata fection trans. Per eseguire acufection, pelle di topo è stato infuso con il DNA in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e poi punge leggermente con un fascio di aghi per favorire l'assorbimento di DNA e trasfezione in cellule. Il DNA plasmidico è presumibilmente occupato da cheratinociti e cellule dendritiche (DC) nella pelle ed espresso in proteine. Puntura meccanico con il aghi per sé non ha causato danni alla pelle o indurre attivazione dei cheratinociti. L'espressionedei geni trasfettati è stato rilevato nella pelle sia a livello trascrizionale e traslazionale seguenti acufection per 2 giorni e mantenuto fino a 7 giorni. L'obiettivo primario per lo sviluppo di questo metodo acufection è stato quello di indagare su un'isoforma precedenza indefinito di IL-15. Usando questo metodo, un splicing alternativo IL-15 isoforma con parzialmente eliminato esone 7 (IL-15ΔE7) è stata espressa nella pelle e successivamente trattati con un recettore Toll-like 7 (TLR7) agonista, imiquimod (IMQ), per indurre infiammazione. Acufection consegnate IL-15ΔE7 in pelle soppressa proliferazione dei cheratinociti, spessore epidermico e il reclutamento di neutrofili nell'infiammazione cutanea IMQ-indotta. Con crescente interesse nell'identificazione dei meccanismi regolatori di infiammazione cutanea, il protocollo qui descritto fornisce un costo alternativo efficace e versatile al cannone gene o microseeding per la consegna del DNA in vivo. Essa può consentire potenzialmente scoperta della funzione di un romanzogene in pelle o per indagare nuovo trattamento per le malattie cutanee.

Introduzione

La pelle è la prima linea di difesa ospite. Cheratinociti (KC) sono il tipo di cellula importante nella pelle degli esseri umani e topi. In risposta a stimoli ambientali (per esempio luce solare, ossigeno, prodotti chimici e invasione patogeni), KC sono attivati e produrre una vasta gamma di citochine proinfiammatorie e chemochine, quali IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF α e GM-CSF 1. Insieme innescano il reclutamento di cellule immunitarie per la pelle. Infiammazione cutanea aggravata è spesso associata a numerose malattie umane compresi dermatite da contatto ectopica acuta e l'infiammazione mediata da cellule T cronica (es dermatite allergica da contatto e psoriasi) 2. Modulando risposte proinfiammatorie nella pelle inibendo l'attivazione KC è un approccio plausibile per trattare l'infiammazione cutanea. Questo protocollo descrive un nuovo approccio per esprimere transitoriamente un gene citochina nell'epidermide per studiare res immunitarioponse conseguenti ad un tale trattamento nella pelle.

L'epidermide compone lo strato più superficiale della pelle. Essa funge da barriera fisica mantenendo sostanze esterne come acidi nucleici e patogeni di entrare negli strati più profondi della pelle. Diverse tecniche senza ago sono stati stabiliti per il trasferimento epidermica DNA 3, 4. DNA in soluzione o associata con liposomi cationici o vettori di adenovirus è stata applicata direttamente alla epidermide modificati con tecniche come la rimozione dello strato corneo o il trattamento con il reagente depilazione. Rimozione dell'epitelio corneo facilita DNA attraversare la barriera epidermica e l'interazione con cheratinociti e cellule di Langerhans per indurre risposte immunitarie 5. Mentre una grande area di superficie disponibile per il trasferimento di DNA e questo approccio non comporta aghi, ci sono svantaggi tra cui il requisitoper le grandi quantità di DNA periodo (10 - 100 pg), trattamento duro sulla pelle di strippaggio, ei risultati inconsistenti nell'indurre risposta immunitaria negli animali immunizzati senza consegna DNA richiamo 6. Consegna intracellulare microparticelle mediata da DNA nudo alla pelle ha dimostrato di essere altamente efficiente e riproducibile per indurre la risposta immunitaria 7, 8. Una pistola gene portatile è stato utilizzato per bombardare sito bersaglio pelle con plasmide particelle d'oro rivestite di DNA 2 micron di diametro di dimensioni per mezzo del flusso d'aria in pressione dell'elio 9. Il DNA plasmidico è presumibilmente assorbito dalle cellule dendritiche (DC) KCsand nella pelle e la proteina è espressa localmente o essere trasportati a linfonodi drenanti dalle DC 10. Anche se il sistema di pistola gene è semplice e non richiede esperienza tecnica limitata, il costo per la preparazione e la consegna dei "bul DNAlet "(cioè polvere d'oro, gas elio) e per la pistola gene stesso ha limitato l'applicazione generale. Inoltre, la necessità di un sistema di erogazione di gas elio limita la facilità di trasporto pistola genica quando gli esperimenti sono condotti in luoghi diversi. Microseeding è stato dimostrato per ottenere una maggiore efficienza del trasferimento genico di singola iniezione e bombardamento di particelle 11. Microseeding utilizza una pistola tatuaggio per consegnare il DNA alla pelle senza l'uso di perline di particelle 11. oscillante i microaghi sulla pelle utilizzando questo approccio rischia di raschiare direttamente la membrana cellulare e quindi trasferire il DNA a più celle contemporaneamente. Tuttavia, il dolore associato con il gran numero di iniezioni con aghi 0,254 mm di diametro è uno svantaggio.

Qui forniamo un approccio alternativo alla consegna del DNA in vivo. Il "acufection" protocollo abbiamo descritto qui fornisce un modo economico ed efficiente per fornire DNA plasmidico in pelle topo. Brevemente, dieci aghi (0,2 mm di diametro x 13 mm di lunghezza) sono stati legati in un fascio con nastro adesivo. Un volume di 10 microlitri di PBS con 10 pg di DNA plasmide contenente il transgene di interesse è stato posto sulla rasata, depilatoria pelle fianco crema-trattata. Utilizzando il fascio di agopuntura oscillare la superficie (1 cm x 1 cm) della pelle, le cheratine a strato corneo sono stati allentati e il DNA plasmidico applicato alla superficie è stato assorbito nell'epidermide. danni alla pelle è stata monitorata ed è risultato essere il minimo. Espressione del gene trasfettato nella pelle acufected stato confermato sia quantitativa real-time PCR (qRT-PCR) ed ELISA. Gli effetti modulatori del sistema immunitario del acufection consegnate IL-15ΔE7 su infiammazione cutanea sono stati dimostrati utilizzando il modello di topo IMQ-trattati 12. Mentre acufection dimostra di essere un dema facile e menoMetodo nding per la consegna del DNA in vivo, la quantità ottimale di DNA per i diversi geni e le volte per pungere la pelle deve essere attentamente ottimizzata per ottenere risultati riproducibili.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

topi femmina a 8 - 12 settimane di età sono stati utilizzati per questo studio. C57 / BL6 wild-type (WT) e IL-15 carente (IL15 - / -) topi sono stati acquistati da National Laboratory Animal Centre (NLAC), Taiwan e Taconic Farm, rispettivamente. IL-15-deficienti (IL15 - / -) e IL-15-dominante (IL15 +/- e IL15 + / +) hanno mostrato un rapporto 1: 3 nella seconda generazione dalla croce di eterozigoti IL15 +/-. Il genotipo di IL-15 - / - mice è stata confermata da analisi PCR. I topi sono stati mantenuti nella struttura specifico patogeno libero (SPF) presso il Laboratorio Animal Center (LAC), National Taiwan University (NTU) College of Medicine. Tutte le procedure di animali, tra cui i materiali ei metodi di anestesia sono stati eseguiti in conformità con il protocollo degli animali approvato dalla National Taiwan University College of Medicine e al Collegio della sanità pubblica Istituzionale Animal Care and Use Committee (IACUC) (Dichiarazione giurata di approvazione del protocollo Animal 20.130.225).

1. Preparazione di aghi agopuntura

NOTA: Aghi di agopuntura sono dispositivi medici composti da un'impugnatura ed un'estremità dell'ago (Figura 1A). I diametri dell'ago agopuntura variava da 0,2 mm (36 G) a 0,35 mm (28 G). Selezioniamo il punto più fine dell'ago per evitare danni potenziali delle cellule eccessivo durante pungendo la pelle. Ci sono 4 differenti lunghezze dell'ago 0,2 mm di cui 13 mm (0,5 pollici), 25 mm (1,0 in), 40 mm (1,5 pollici) e 50 mm (2,0 pollici) di lunghezza. Un fascio di 10 aghi con spezzone 13 mm, purché la presa migliore confortevole durante oscillazione dell'ago su C57BL / 6 mouse pelle. I parametri possono essere modificati se il metodo viene applicato sulla pelle di animali più grandi o eseguito da ricercatori con mani più grandi.

  1. Rimuovere aghi dalla confezione sterile, apirogena. Mettere gli aghi su un telino sterile.
  2. Usare nastro adesivo per legare l'etichettatura 10 aghi insieme ina fascio (Figura 1B).
    NOTA: I 10 aghi sono geometricamente disposti a formare una forma cilindrica. Per comodità, utilizzare un pezzo di parafilm per stabilizzare la disposizione prima di applicare il nastro adesivo. Assicurarsi che tutti i punti di ago sono sullo stesso piano. Utilizzando un fascio invece di un singolo ago facilita infusione DNA massima aumentando l'area di contatto tra gli aghi e la cute.

2. Preparazione di un Importo di grandi dimensioni e privo di endotossine plasmidi DNA

  1. Trasformare cellule batteriche competenti chimicamente con il DNA plasmidico.
  2. Selezionare e inoculare una singola colonia batterica in 3 mL di terreno LB contenenti antibiotici e incubare a 37 ° C in un agitatore notte.
  3. Scalare la cultura diluendo la coltura batterica a 1: 100 a 250 mL di terreno LB con antibiotici e agitazione durante la notte a 37 ° C.
  4. Preparare una grande quantità di DNA utilizzando un alta quality, endotossine kit di preparazione gratuito plasmide seguendo le istruzioni del produttore.
    NOTA: protocollo Acufection richiede un'elevata purezza e una grande quantità di DNA plasmidico. Uso di alta qualità, è consigliabile endotossine e DNA plasmidico purificato colonna.
  5. Eluire il DNA in acqua sterile. DNA Conservare in piccole aliquote a -20 ° C fino al momento acufection.
    NOTA: Evitare ripetuti di congelamento e scongelamento del DNA al fine di garantire plasmide di espressione del DNA coerente.
  6. Diluire DNA plasmidico a 1 mg / ml in PBS sterile per acufection.

3. Procedura per Acufection

NOTA: La quantità ottimale di DNA e l'area della superficie della pelle bersaglio può variare per diversi geni e devono essere ulteriormente ottimizzata. La forza spillatura e il numero di volte per disperdere lo strato corneo della pelle può anche variare a seconda dello spessore della pelle. Queste condizioni devono essere determinate con cura dopo aver valutato il livello di espressione del gene transcri acufectedpts da qRT-PCR.

  1. Pesare i topi e amministrare tribromoethanol (400 ug per peso corporeo gm) mediante iniezione peritoneale.
    NOTA: 2,2,2-tribromoethanol è un agente anestetico iniettabile che era comunemente usata nei topi. Le soluzioni sono realizzate sciogliendo un grado non farmaceutico 2,2,2-tribromoethanol (2,5 g) in acqua distillata (200 mL) contenente 2,5% di 2-metil-2-butanolo.
  2. Utilizzare veterinario oftalmologica pomata sugli occhi per prevenire la secchezza sotto anestesia.
    NOTA: effetto anestetico sarà indotta a 1 - 2 min. Controllare il pinch riflesso punta a garantire sufficiente profondità dell'anestesia prima del funzionamento.
  3. Radere la pelle dorsale fianco e applicare una crema depilatoria per sciogliere proteine ​​di cheratina nel fusto del capello.
    NOTA: L'uso della crema depilatoria per eliminare i peli faciliterà l'infusione di DNA nella pelle.
  4. Utilizzare batuffoli di cotone imbevuto di acqua per rimuovere la crema depilatoria.
    NOTA: La crema depilatoria è solubile in acqua. La rimozione completa del wil cremal prevenire una superficie unta e garantire un risultato migliore puntura.
  5. Usare un tampone di cotone sterile imbevuta di etanolo al 70% per disinfettare la superficie della pelle.
  6. Mark l'area di destinazione (1 cm x 1 cm) sulla pelle depilata con uno stampino predosato. NOTA: In occasione del sito di destinazione vi aiuterà ad applicare il fascio ago su e giù all'interno di un'area definita. Questo è importante per garantire la consegna della stessa quantità di DNA ad una superficie specifica per minimizzare la variazione esperimento a esperimento.
  7. Una goccia 10 ml di DNA plasmidico (10 ug) sulla pelle sensibile.
    NOTA: La quantità di DNA per acufection varia con differenti geni e il tipo di vettore di espressione. La quantità di DNA usato deve essere attentamente titolato prima di effettuare l'esperimento di interesse. Il 10 microlitri è una piccola goccia di liquido e si siede bene sulla pelle rasata e depilate senza rotolare giù mentre puntura. Includere un gruppo di controllo di topi trattati con 10 microlitri vuoto vettore di DNA da confrontare con un topicufected con il gene di studio.
  8. Tenere il fascio di agopuntura (Figura 1B) e forare la superficie contrassegnata con un movimento su e giù per 100 volte o finché l'umidità dal DNA in PBS sulla pelle scompare. NOTA: può verificarsi un certo rossore della superficie della pelle. Evita di fare tagli profondi che sanguinano. Il numero di up-and-down pungendo movimenti sulla superficie della pelle è operativamente determinata quando l'umidità dal DNA in PBS (10 mL) scompare sulla pelle. Abbiamo deciso 100 volte in 30 s, perché ha dato i risultati più consistenti da geni acufection-consegnato. Se del caso, gli aghi possono essere riutilizzati per 6 punture pelle bersaglio (1 cm x 1 cm ciascuno). Risciacquare gli aghi in etanolo al 70% e PBS tra acufection. Cambiare per nuovi aghi quando sono spenti o per diversa DNA plasmidico per evitare la contaminazione incrociata.
  9. Mettere i topi acufected su una piastra elettrica per mantenere la temperatura corporea fino a quando sveglio.
  10. Rientro topi per loro gabbia quando hannoripreso conoscenza sufficiente. Nota: Tenere topi acufected in gabbia separata (meno di 5 animali per gabbia) dalla gabbia di topi non-acufected.
  11. Mettere bottiglia d'acqua in luogo e tornare la gabbia alla IVC (gabbie a ventilazione individuale) rack.

Cura 4. post-operatorio

  1. Per le prime 48 ore dopo la procedura, monitorare attentamente i topi per qualsiasi disagio compresi i cambiamenti comportamentali (irrequietezza, agitazione o disturbo alimentare) o aspetto anomalo (pelo ruvido o la postura ricurva).

5. Imiquimod (IMQ) trattamento della pelle IL-15ΔE7-acufected

NOTA: l'espressione trascrizionale e proteine ​​produzione di gene acufected sono rilevabili il giorno 3. I topi acufected con il plasmide di interesse può essere trattata con diversi tipi di stimolanti 3 giorni dopo la trasfezione. Illustriamo qui trattando la pelle del mouse IL-15ΔE7-acufected con crema di IMQ. IMQ è un f imidazoquinolin ammina approvatoo trattare genitali esterni e verruche perinatali 13. Il trattamento topico IMQ è mostrato di indurre disturbi della pelle psoriasi-come l'essere umano nei topi con la manifestazione di pelle squamosa, la proliferazione epidermica e l'infiltrazione 12, 14, 15 dei neutrofili cutanea.

NOTA: Il vettore plasmidico conteneva intera lunghezza topo IL-15 cDNA, sotto la regolazione del fattore di allungamento-1 α (PEF), fiancheggiata da un peptide segnale IL-2 e un tag FLAG al C-terminale (pEF-IL- 15, 5859 paia di basi), che è stato costruito come descritto da Bamford et al. 16. Il plasmide viene utilizzato come modello IL-15 per eliminare i primi 16 ammino acidi nelle residui 33 - 48 nell'esone 7 del IL-15 gene IL-15ΔE7 (pEF-IL-15ΔE7, 5.811 paia di basi) da SOE (sintesi per estensione sovrapposizione) PCR 17. colonie batteriche che sono stati con successotrasformato con IL-15ΔE7 sono stati verificati mediante digestione con enzimi di restrizione e sequenziamento del DNA seguita da 12, 18. Una grande quantità di DNA plasmidico privo di endotossine è stato preparato come descritto nel passaggio 2 protocollo.

  1. Anestetizzare topi acufected mediante iniezione intraperitoneale di tribromoethanol (400 ug per peso corporeo gm) e applicare veterinario pomata oftalmica sugli occhi per evitare secchezza sotto anestesia. Controllare il pinch riflesso punta per assicurare sufficiente profondità dell'anestesia prima dell'inizio delle procedure operative. NOTA: Poiché una pelle 2 cm x 2 cm verranno trattati per IMQ, 2 dosi di pil-15ΔE7 DNA plasmidico (10 mg in 10 ml di PBS per dose) è acufected su 2 siti bersaglio (1 cm x 1 cm ciascuno).
  2. Mark affiancano pelle (2 cm x 2 cm) che copre l'area acufected.
  3. Utilizzare Q-applicatore per applicare topicamente la crema IMQ sulla superficie contrassegnata. Nota: passo 5.1 viene eseguita soltanto per la prima dose (60 mg / dose).I prossimi dosi consecutive vengono applicati ai topi non anestetizzati.
  4. Documentare i cambiamenti della pelle dorsale IMQ-trattati giornalmente con una videocamera ad alta definizione. Nota: Una persona tiene il mouse mentre un altro sta registrando. Ancora immagini sono girato e montato in un secondo momento.
  5. Euthanize topi iniettando una dose eccessiva di tribromoethanol (800 mg per peso corporeo gm) seguita da dislocazione cervicale il giorno 4 o 7 ° giorno dopo il trattamento IMQ. La pelle è asportato ed elaborato (passi 4,1-4,5).

6. Omogenato della pelle del mouse

  1. Utilizzare un paio di forbici chirurgiche per eseguire un taglio orizzontale dalla base della coda. Procedere bilateralmente alla base della arti posteriori e continuare a tagliare verticalmente lungo il fianco alla base dell'arto anteriore.
  2. sbucciare accuratamente la pelle dal tessuto sottostante dal posteriormente al anteriore. Usare le forbici per tagliare la pelle dorsale. Posizionare la pelle su una piastra di Petri sterile.
  3. Utilizzare un bisturi per asportare bersagliopelle e congelare in azoto liquido immediatamente. Nota: Le stesse dimensioni della pelle acufected colpo (1 cm x 1 cm) o con il trattamento IMQ (2 cm x 2 cm) è fissato per ogni mouse per minimizzare le variazioni esperimento-to-esperimento.
  4. Posizionare il tessuto della pelle congelata al centro di un pre-raffreddata malta 2-vano con manici e un pestello. Utilizzare un martello di piombo sulla malta per polverizzare il tessuto.
  5. posizionare rapidamente il tessuto polverizzato in una nuova provetta contenente 500 ml di reagente di lisi cellulare per l'estrazione di RNA o ad una provetta contenente 50 ml di PBS e 1x proteasi inibitore cocktail avere lisato proteico.

7. H & E e la colorazione immunoistochimica di Sezione della cute

  1. Posizionare il tessuto cutaneo in una cassetta e immergerlo in paraformaldeide al 4% durante la notte.
  2. Incorporare e sezione di tessuto, che nel nostro caso è stato eseguito dal Laboratorio Patologia LAC, NTU. Nota: La sezione è tagliato ad uno spessore di 5 um. Luogo secti tessutions su vetrini con carica positiva.
  3. Riscaldare le diapositive a 65 ° C per 15 min.
  4. Porre i vetrini in un rack di colorazione. Immergere il rack in corrispondenti serbatoio contenente sostituto xilene per 5 minuti seguita due volte per immersione sequenziale in 100%, 95%, 80%, 75%, 60% e 50% di etanolo (5 min ciascuna) per la reidratazione. Immergere i vetrini in acqua di rubinetto per 3 minuti prima della colorazione.
  5. Eseguire ematossilina ed eosina. Nota: H & E macchia è stata eseguita su richiesta al Laboratorio di Patologia presso il LAC, NTU.
  6. Per macchia immunoistochimica, bloccare la sezione con soluzione blocco a temperatura ambiente per 5 minuti per ridurre il fondo non specifica colorazione. Nota: La soluzione blocco viene sviluppato commercialmente con tecniche di immunoistochimica. Nessun siero animale è contenuto in questo prodotto.
  7. Immergerlo in PBS per sciacquare la soluzione blocco.
  8. Diluire la soluzione blocco in PBS a 1:10 e aggiungere 2% di siero fetale bovino (FBS) (soluzione diluente).
  9. Pipettare l'anticorpo primario opportunamente diluito sulla sezione e incubare per 60 min a temperatura ambiente. Nota: Gli anticorpi sono diluiti in soluzione diluente. concentrazioni di anticorpi per questa colorazione sono stati ottimizzati a 1: 800 e 1: 200 per Ki67 (clone SolA15) e Ly6G (clone 1A8), rispettivamente. Queste concentrazioni si trovano a mostrare macchie distinte, senza colorazione di fondo.
    1. Macchiare una sezione serie nello stesso ciclo con la stessa soluzione omettendo l'anticorpo primario per controllare per il legame non specifico dell'anticorpo secondario.
  10. Lavare i vetrini tre volte in TBS più 0,1% Tween-20 (soluzione TBST) per 5 minuti ciascuna. Cambio soluzione tra un lavaggio.
  11. Pipetta una goccia di polimeri etichettate per ogni sezione e incubare a temperatura ambiente per 40 min. Nota: Il polimero marcato viene commercialmente preparato combinando polimeri amminoacidici con perossidasi e l'anticorpo secondario che si riduce ad un frammento Fab'. Il reagente è pronto all'uso percolorazione immunoistochimica di sezioni di tessuto mouse.
  12. Lavare i vetrini tre volte in TBST per 5 minuti ciascuno. Cambio soluzione tra un lavaggio.
  13. Pipetta 3,3'-diaminobenzindine tetraidrocloride soluzione (DAB) sulla sezione di tessuto e lasciare riposare a temperatura ambiente fino un precipitato marrone è visibile sotto un microscopio campo chiaro. Nota: Il tempo per DAB precipitare in presenza di perossidasi è di circa 30 min.
  14. Immergere i vetrini in acqua per interrompere l'attività perossidasica. Immergere i vetrini in soluzione verde di metile per la colorazione nucleare. Lavare i vetrini tre volte in PBS per 5 minuti ciascuna.
  15. Posizionare un coprioggetto sulla sezione macchiato che è coperto con montante fisso (8 ml per sezione).

8. fotografia e analisi di macchiato sezione di tessuto

  1. Visualizza H & E macchiato e IHC sezioni di tessuto sotto un microscopio a campo luminoso. catturare immagini utilizzando Charge Coupled Device (CCD) collegata al microscopio. per qanalisi QUANTITATIVA, software di imaging può essere utilizzato
    1. Scandire l'intera sezioni colorate usando uno ScanScope con un obiettivo 20X.
    2. Misurare lo spessore epidermico all'interno di un segmento 1 mm dell'epidermide e contare il numero di cellule Ki67-immunoreattive all'interno del segmento.
      NOTA: quantitativa analisi viene eseguita utilizzando la microscopia automazione e immagine software di analisi. spessore epidermico è definito dalla distanza tra lo strato basale e lo strato più esterno dell'epidermide.
    3. Contare il numero di cellule Ly6G-immunoreattive nella zona cutanea (230 x 270 um 2 rettangolo) immediatamente sotto topica cutanea IMQ-trattata.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Mentre alcuni rossore era evidente entro la prima ora dopo puntura con aghi di agopuntura, la pelle liberata il giorno 2 ed è stata osservata alcuna reazione avversa cutanea fino al giorno 7 dopo puntura (Figura 2A). Ago che pungono indotto molto basso livello di epidermico orthokeratosis e infiltrazione dermica minima da H & E analisi comparata con la pelle non trattata (Figura 2B). Lo spessore epidermico

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

La fase più critica per garantire l'espressione del DNA plasmidico è acufected ad oscillare in modo uniforme e allentare lo strato corneo della pelle. Spingendo gli aghi delicatamente senza tagliare la pelle, la forza dovrebbe essere abbastanza duro per deprimere la superficie. Per facilitare l'assorbimento del DNA in 10 microlitri soluzione su un 1 cm x 1 cm di superficie, gli aghi devono oscillare su e giù per circa 100 volte in 30 s. Si può determinare la forza che deve pungere la pelle e notando il numero di...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno interessi finanziari da dichiarare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione da parte del Ministero della Scienza e della Tecnologia (MOST 103-2633-B-002-002, 104-2320-B-002-048). Ringraziamo Drs. Betty Wu-Hsieh e Chien-Kuo Lee al NTU, Leigh Zerboni presso la Stanford University e il dottor Peter Hoffmann presso l'Università delle Hawaii per la lettura del manoscritto, Yun Chien a NTU per l'assistenza tecnica, e il dottor Wen Wei-Chi in agricoltura biotecnologie Centro di ricerca presso Academia Sinica per un parere tecnico.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Accu Handy NeedleAccu36Gx0.5Dispositivo medico
NairTM LozioneChiesa & DwightN/A Utilizzareper rimuovere i peli
Shandon Xyline sostitutoThermo Fisher Scientific6764506Deparaffinizzazione
Avertin (2,2,2-Tribrometanolo)Sigma-AldrichT4,840-2Anestesia
2-metil-2-butanoloSigma-Aldrich152463Solvente per la dissoluzione dell'avertina
DifcoTM LB brodo, MillerBD244620Propagazione e mantenimento di E. coli per biologia molecolare
Complesso ELISA di topo IL-15/IL-15R Kit ELISA Ready-SET-GoeBioscience88-7215Misura la proteina IL-15
Anticorpo anti-topo Ly6GBioLegend127601utilizzato per la colorazione immunoistochimica
anti-topo Ki-67eBioscience14-5698-80Anticorpo utilizzato per colorante immunoistochimico
Simple Stain Mouse MAXPO (Rat)Nichirei Biosciences414341FReagente per bloccare il segnale di fondo nella colorazione topo su topo
Kit substrato DAB Perossidasi (HRP)Vector LaboratoriesSK-4100Substrato perossidato per colorazione immunoistochimica
Blocco Ultra VThermo Fisher ScientificTA-060-UBRidurre la colorazione di fondo aspecifica
Verde metileSigma-AldrichM8884Colorazione nucleare
Vecta MountTMVector LaboratoriesM-5000Conservazione permanente delle colorazioni istochimiche
Compresse cocktail di inibitori della proteasiRoche04-693-116-001Inibire l'attività della proteasi nel lisato cellulare
Crema Aldara3M ParmaceuticalsN/A5% crema imiquimod
Bessman Tissue PulverizerSpectrum Labs189475Utilizzo per polverizzare il tessuto cutaneo
ABI7900HT ciclatoreThermo Fisher ScientificN/ASaggio PCR quantitativo in tempo reale
VideocameraPanasonicHDC-SD60Documentazione dell'immagine
Axio Scope.A1ZEISSN/AMicroscopia a campo chiaro

Riferimenti

  1. Effendy, I., Loffler, H., Maibach, H. I. Epidermal cytokines in murine cutaneous irritant responses. Journal of applied toxicology : JAT. 20, 335-341 (2000).
  2. Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nature reviews. 9, 679-691 (2009).
  3. Liu, L. J., et al. Topical application of HIV DNA vaccine with cytokine-expression plasmids induces strong antigen-specific immune responses. Vaccine. 20, 42-48 (2001).
  4. Lu, B., Federoff, H. J., Wang, Y., Goldsmith, L. A., Scott, G. Topical application of viral vectors for epidermal gene transfer. J Invest Dermatol. 108, 803-808 (1997).
  5. Partidos, C. D. Delivering vaccines into the skin without needles and syringes. Expert Rev Vaccines. 2, 753-761 (2003).
  6. Peachman, K. K., Rao, M., Alving, C. R. Immunization with DNA through the skin. Methods. 31, 232-242 (2003).
  7. Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9568-9572 (1990).
  8. Tang, D. C., DeVit, M., Johnston, S. A. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature. 356, 152-154 (1992).
  9. Haynes, J. R. Particle-mediated DNA vaccine delivery to the skin. Expert Opin Biol Ther. 4, 889-900 (2004).
  10. Tuomela, M., et al. Biodistribution and general safety of a naked DNA plasmid, GTU-MultiHIV, in a rat, using a quantitative PCR method. Vaccine. 23, 890-896 (2005).
  11. Eriksson, E., et al. In vivo gene transfer to skin and wound by microseeding. J Surg Res. 78, 85-91 (1998).
  12. Lee, T. L., et al. An alternatively spliced IL-15 isoform modulates abrasion-induced keratinocyte activation. J Invest Dermatol. 135, 1329-1337 (2015).
  13. Rudy, S. J. Imiquimod (Aldara): modifying the immune response. Dermatol Nurs. 14, 268-270 (2002).
  14. van der Fits, L., et al. Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis. J Immunol. 182, 5836-5845 (2009).
  15. Sumida, H., et al. Interplay between CXCR2 and BLT1 facilitates neutrophil infiltration and resultant keratinocyte activation in a murine model of imiquimod-induced psoriasis. J Immunol. 192, 4361-4369 (2014).
  16. Bamford, R. N., DeFilippis, A. P., Azimi, N., Kurys, G., Waldmann, T. A. The 5' untranslated region, signal peptide, and the coding sequence of the carboxyl terminus of IL-15 participate in its multifaceted translational control. J Immunol. 160, 4418-4426 (1998).
  17. Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77, 61-68 (1989).
  18. Tan, X., Lefrancois, L. Novel IL-15 isoforms generated by alternative splicing are expressed in the intestinal epithelium. Genes Immun. 7, 407-416 (2006).
  19. Basner-Tschakarjan, E., Mirmohammadsadegh, A., Baer, A., Hengge, U. R. Uptake and trafficking of DNA in keratinocytes: evidence for DNA-binding proteins. Gene Ther. 11, 765-774 (2004).
  20. Fan, H., Lin, Q., Morrissey, G. R., Khavari, P. A. Immunization via hair follicles by topical application of naked DNA to normal skin. Nat Biotechnol. 17, 870-872 (1999).
  21. Kennedy-Crispin, M., et al. Human keratinocytes' response to injury upregulates CCL20 and other genes linking innate and adaptive immunity. J Invest Dermatol. 132, 105-113 (2012).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Pelle di topoDNA plasmidicoaghi da agopunturaisoforma di IL 15agonista di TLR7trattamento con imiquimodanalisi qRT PCRcolorazione immunoistochimica
Sviluppo di un sistema di consegna economico DNA da "Acufection" e la sua applicazione alla ricerca della pelle
Contattaci
Raccomanda alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.