Consegna intraduttale al Coniglio ghiandola mammaria

Sommario

Qui, descriviamo una tecnica per la somministrazione localizzata di reagenti alla ghiandola mammaria del coniglio tramite un'iniezione intraduttale. Inoltre, descriviamo un protocollo per la visualizzazione e la conferma della somministrazione mediante imaging ecografico ad alta risoluzione degli agenti di contrasto.

Abstract

Trattamenti intraduttale localizzati per il cancro al seno offrono potenziali vantaggi, compresa la lettura efficiente al tumore e ridotta tossicità sistemica e effetti avversi ^{1, 2, 3, 4, 5, 6, 7.} Tuttavia, rimangono molte sfide prima di questi trattamenti possono essere applicati più ampiamente. Lo sviluppo e la validazione di terapie intraduttale in un modello animale adeguato facilitano lo sviluppo di strategie terapeutiche per i pazienti intraduttale. Mentre la ghiandola mammaria topo è stato ampiamente utilizzato come sistema modello di sviluppo mammario e tumorigenesi, l'anatomia è distinta dalla ghiandola umana. Un modello animale più grande, come il coniglio, può servire come un modello migliore per la struttura della ghiandola mammaria e sviluppo terapeutico intraduttale. in contrast a topi, in cui dieci alberi dotto sono spazialmente distribuiti lungo l'asse del corpo, ciascuna terminante in un capezzolo a parte, la ghiandola mammaria di coniglio assomiglia più da vicino la ghiandola umana, con più sistemi duttale sovrapposti che escono attraverso le aperture separate in una tettarella. Qui, vi presentiamo i metodi minimamente invasive per la fornitura di reagenti direttamente nel condotto mammaria coniglio e per la visualizzazione della stessa consegna con ecografia ad alta risoluzione.

Introduzione

La consegna intraduttale di agenti terapeutici è stata studiata in modelli di roditori e in fase iniziale sperimentazione umana ^{3, 4, 5, 6, 11, 12.} Un recente studio di fase I ha dimostrato la sicurezza e la fattibilità di carboplatino intraduttale o intraduttale doxorubicina liposomiale pegilata in donne in attesa di mastectomia per il trattamento del cancro invasivo ^2.

Precedenti protocolli per la consegna intraduttale sono stati sviluppati per topo e ratto mammarie ghiandole ^{6, 7, 8, 9.} Per scopi di ricerca, iniezioni di cellule tumorali intraduttale e la consegna lentivirale vettore di oncogeni sono stati anche eseguiti in modelli di roditoriref "> ^{13, 14, 15, 16.} Tuttavia, un ideale modello in vivo del processo di consegna intraduttale dovrebbe consentire lo sviluppo di nuove classi di composti terapeutici e facilitare la valutazione preclinica. differenze anatomiche tra i roditori e gli esseri umani hanno complicato la traduzione di questi studi.

Diversamente topi, in cui ciascun condotto termina in un capezzolo separata, il seno umano è costituito da 5 a 9 sistemi duttali indipendenti, ognuno con un'apertura separata termina al capezzolo. Coniglio ghiandole mammarie porto quattro sistemi duttale indipendenti, ciascuna separatamente, accessibile attraverso uno dei quattro orifizi in una sola tettarella. Un modello di coniglio più si avvicina al anatomia umana e consente lo studio di drug delivery intraduttale in un contesto più rilevante.

Qui, usiamo due tecniche per valutare la consegna intraduttale. La co-somministrazione di uncolorante vitale permette la visualizzazione attraverso la pelle e fornisce una conferma semplice e rapida del metodo. Per alcune applicazioni, la mappatura risoluzione maggiore dei condotti può essere preferito. Presentiamo qui un protocollo per l'imaging ad ultrasuoni dei condotti attraverso la consegna intraduttale di un reagente non mirato contrasto.

Protocollo

Le procedure che utilizzano soggetti animali sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali della University of Texas di Austin.

1. Preparazione preoperatoria

1. Registrare il peso corporeo di ogni coniglio. Come per tutti gli studi preclinici, monitorare i pesi degli animali regolarmente per valutare la potenziale tossicità.
2. Prima di anestetizzare il coniglio, riempire una provetta da 50 ml con gel per ultrasuoni disponibili in commercio e far girare a 500 xg per 30 s; ci dovrebbero essere visibili bolle nel gel al termine della centrifugazione.
3. Somministrare glicopirrolato per via sottocutanea alla dose di 0,1 mg / kg e acepromazine intramuscolare alla dose di 0,75 mg / kg. Attendere 15-20 minuti per il sedativo abbia effetto, mentre il monitoraggio dei segni vitali e il comportamento.
   NOTA: Glicopirrolato è un agente anti-colinergico che impedisce bradicardia e riduce respiratorie e GI secrezioni. Acepromazine è un sedativo che funge da premedication per l'anestesia.
4. Somministrare 35 mg / kg di ketamina e 5 mg / kg di xylazina sottocutanea come anestetico. Tuttavia, come l'operatore diventa più esperto e può compiere la consegna intraduttale più rapidamente, diminuire i dosaggi farmaceutiche a 15 mg / kg di ketamina e 3 mg / kg di xylazina sottocutanea; questo ridurrà il tempo di anestesia e il tempo richiesto per l'animale per recuperare da anestesia.
5. Controllare e documentare la frequenza cardiaca, SPO _2, temperatura, frequenza respiratoria, e il colore membrana mucosa ogni 15 min. Applicare il lubrificante occhio in entrambi gli occhi.
   NOTA: Solo il personale che hanno subito la formazione adeguata e sono stati approvati dalla IACUC della loro istituzione dovrebbe amministrare o monitorare l'anestesia. L'uso di un monitor anestesia veterinario può aiutare ad acquisire segni vitali ed è consigliato. Il monitor anestesia veterinaria, tuttavia, non sostituisce la necessità di controllare manualmente l'animale ogni 15 min. Vedere le istruzioni del produttore Fo l'uso corretto di un monitor veterinaria.
6. Verificare l'insorgenza di anestesia da un pinch punta dolce; il coniglio deve essere non reattivi prima di continuare.
7. radersi con cura l'addome caudale del coniglio nella zona attorno al terzo e quarto coppie di mammelle inguinali.
8. Con la maggior parte dei capelli rimossi, applicare una crema depilatoria over-the-counter all'area rasata. Rimuovere il min crema 10 dopo l'applicazione usando tovaglioli di carta umidi bagnate con acqua tiepida.
   NOTA: la pelle di coniglio è molto fragile / sensibile. La crema depilatoria deve essere utilizzato per non più di 10 min. In realtà, è più sicuro provare un "punto di prova" a 5 min e lasciare solo il più a lungo se posto test indica un tempo più lungo è necessario periodo.
9. Pulire l'area con tamponi di garza imbevuta di alcol per pulire il sito di iniezione.
10. Posizionare il coniglio sul suo dorso in un recipiente a forma di v foderato con un ricircolo coperta acqua calda e un tampone assorbente.

2. Preparation del mezzo di contrasto

1. Ricostituire il reagente non mirati contrasto in base alle istruzioni del produttore. Pipetta su e giù delicatamente per miscelare.
   NOTA: L'agente di contrasto utilizzato in questo protocollo è stabile a temperatura ambiente per 4 - 6 h dopo la ricostituzione. oscillare delicatamente il flaconcino tra ogni recupero.
   NOTA: Il volume di soluzione necessario dipende dal numero di condotti da iniettare. Il coniglio ha 4 aperture duttale per tettarella, e 0,2 ml di soluzione è sufficiente a riempire un albero duttale di un adulto Nuova Zelanda White Rabbit (Oryctolaguscuniculus). Così, un volume totale di 0,8 ml può essere consegnato ad una ghiandola mammaria.

3. La consegna intraduttale

1. Individuare i capezzoli appropriate da iniettare; i 3 ^° e 4 ^° coppie di mammelle inguinali sono raccomandati, poiché essi vengono facilmente visualizzate quando l'animale è posizionato sul suo dorso.
2. Carico 0,2 mL di sterile salina allo 0,9% inuna siringa da tubercolina da 1 ml Luer-serratura con un ago 22 G. Smaltire l'ago G 22 una volta che la soluzione salina è nella siringa e sostituirlo con un ago calibro 25 sterile. Pulire delicatamente l'area con 85% alcol isopropilico ed un tampone di garza.
3. Con la smussatura dell'ago e la siringa parallelo al corpo dell'animale, inserire la smussatura dell'ago nel lato del capezzolo e iniettare lentamente 0,1-0,2 mL di soluzione fisiologica; questo permetterà per una migliore visualizzazione delle aperture duttale.
4. Carico 0,2 ml di soluzione per l'iniezione in una siringa da tubercolina 1 ml Luer-lock.
5. Mantenere la tettarella delicatamente con il pollice e l'indice e sollevarla leggermente per posizionarlo per l'iniezione intraduttale; una lente di ingrandimento oculare indossabile può essere di aiuto nel visualizzare le aperture duttale.
6. Pur mantenendo la posizione sollevata del capezzolo, cannulate accuratamente il condotto di interesse utilizzando un ago smussato punta 25 G.
7. Dopo l'incannulamento, torcere delicatamente la siringa luer-lock sul mozzo della smussato-tip ago infusione fino a quando non si blocca in posizione.
8. Sollevare la tettarella e iniettare la soluzione lentamente per ridurre al minimo i potenziali danni causati dal rapido movimento fluido all'interno della condotta; in nessun momento ci dovrebbe essere la resistenza quando si inietta la soluzione.

4. Ultrasound Imaging

1. Applicare una quantità di gel ultrasuoni centrifugato alla pelle della zona di interesse. Verificare che non vi siano bolle nel gel, in quanto questi saranno compromettere la qualità dell'immagine.
2. Impostare la profondità di imaging a 6 mm. Posizionare il trasduttore 21 MHz in contatto con il gel e la scansione dell'area di interesse in B-mode. Osservare il mezzo di contrasto nella regione scansionata tra cui l'apertura duttale e nel condotto.
   NOTA: Queste impostazioni sono stati sviluppati per l'utilizzo con una specifica macchina ad ultrasuoni fotoacustica. Fare riferimento alla tabella dei materiali per maggiori dettagli. Può essere necessario regolare la potenza di trasmissione e la profondità di imaging di altri sistemi di imaging per ottimizzare mammariavisualizzazione della ghiandola.
3. Rimuovere il gel per ultrasuoni dalla pelle dell'animale con un tampone di garza.

5. Cura postoperatoria

1. Osservare il sito di iniezione: non ci dovrebbero essere i segni di un trauma alla regione del capezzolo o al tessuto circostante, e gonfiore nella zona circostante la tettarella probabilmente indica una mammaria iniezione cuscinetto adiposo, piuttosto che una iniezione di intraduttale successo.
2. Posizionare il coniglio in una posizione sternale. Se necessario, dare 0,2 mg / kg per via endovenosa di yohimbina alla vena marginale dell'orecchio; ciò invertire l'effetto della xilazina e permettere all'animale di recuperare più rapidamente da anestesia.
3. Monitorare il coniglio ogni 15 minuti per tutto il periodo di recupero fino a quando l'animale è vigile, reattivo, e mantiene una posizione sternale.
   NOTA: Questa procedura non dovrebbe causare danni ai tessuti o gonfiore. Se rossore o gonfiore si osservano, somministrare una dose di meloxicam 0.1-0.2 mg / kg PO una volta che l'animale è vigile e in gradodi assumere farmaci per via orale. Contattare personale veterinario dell'istituto per ulteriori indicazioni.

Risultati

Qui mostriamo che la consegna intraduttale di reagenti contrasto ai dotti mammari di un coniglio può essere raggiunta senza traumi al tessuto (Figura 2). Nei conigli, quattro sistemi duttale separati convergono in una sola tettarella e, quindi, possono essere consultati e ripreso individualmente con questo metodo. Aperture individuali duttale sono facilmente visualizzati; notare la marcatura di una seconda apertura duttale adiacente al condotto cannulata in Figur...

Discussione

Questo modo di somministrazione intraduttale alla ghiandola mammaria coniglio può essere utilizzato per i reagenti di contrasto ecografici e molte altre soluzioni acquose, compresi coloranti vitali e terapeutica. Studi precedenti hanno dimostrato la consegna intraduttale di ormoni ^{17, 18, 19.} Nei modelli di roditori, la consegna intraduttale di acidi nucleici ^8, chemioterapici ^6,

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagente di contrasto non mirato MicroMarker	VisualSonics	VS-11694
Luer Lock 1 mL Siringhe BD		309628
Glicopirrolato 0,2 mg/mL	Wedgewood Compounding Farmacia	GLYCOP-INJ013VC	6 mesi di durata di conservazione, la fornitura potrebbe essere limitata.
Atropina solfato 0,5 mg/mL	Animal Health International	15320764	Se il glicopirrolato non è disponibile. Da non combinare con glicopirrolato.
Ketamina HCL 100 mg/mL	Animal Health International	21250699	http://www.animalhealthinternational.com/
Acepromazina 10 mg/mL	Animal Health International	17640541
Xilazina 20 mg/mL	Animal Health International	20101547
Yohimbina 0,2 mg/mL	Animal Health International	14588965
Crema per la rimozione dei capelli	Veet		Soluzione per pelli sensibili. Disponibile presso i rivenditori locali.
Aghi per infusione con punta smussata	Tecnologia di infusione Sai	B14-50	http://www.sai-infusion.com/collections/blunt-needles
Pulsossimetro veterinario	EdanUSA	VE-H100B	http://www.edanusa.com/Product/ Pompa per acqua calda VE-H100B-Veterinary-Pulse-Oximeter.html
	Gaymar	TP700
Coperta per acqua calda	Animal Health International	21232696	Maxi-Therm Lite Cuscinetti riscaldanti
Sistema ad ultrasuoni	VisualSonics	Vevo 2100