Un metodo di montaggio versatile per il lungo termine Imaging di sviluppo Zebrafish

Summary

Qui, presentiamo un metodo di montaggio versatile che consente l'imaging time-lapse a lungo termine dello sviluppo posteriore del corpo di embrioni vivi di pesce zebra senza perturbare il normale sviluppo.

Abstract

embrioni di zebrafish offrono un sistema sperimentale ideale per studiare processi morfogenetici complessi a causa della loro facilità di accessibilità e trasparenza ottica. In particolare, l'allungamento del corpo posteriore è un processo essenziale nello sviluppo embrionale da cui più deformazioni tissutali agiscono insieme per dirigere la formazione di una grande parte dell'asse corpo. Per osservare questo processo time-lapse imaging a lungo termine è necessario utilizzare una tecnica di montaggio che consente il supporto sufficiente a mantenere campioni nell'orientamento corretto durante il trasferimento al microscopio e acquisizione. Inoltre, il montaggio deve anche fornire sufficiente libertà di movimento per la conseguenza della regione di corpo posteriore senza alterarne il normale sviluppo. Infine, ci deve essere un certo grado di versatilità del metodo di montaggio per consentire imaging diverse immagini set-up. Qui vi presentiamo una tecnica di montaggio per l'imaging lo sviluppo di posteriori elongatio corpon nel zebrafish D. rerio. Questa tecnica comporta embrioni tale che le regioni della testa e del sacco vitellino sono quasi interamente inclusi in agarosio montaggio, lasciando la regione di body posteriori ad allungarsi e svilupparsi normalmente. Vi mostreremo come questo possa essere adattato per posizione verticale, capovolta e verticale luce fogli microscopia set-up. Anche se questo protocollo si concentra su embrioni per l'imaging per il corpo posteriori di montaggio, potrebbe facilmente essere adattato per l'imaging dal vivo di molteplici aspetti dello sviluppo zebrafish.

Introduction

Posteriore allungamento corpo è un processo essenziale nello sviluppo embrionale da cui l'embrione si estende per formare una grande parte dell'asse corpo. Si tratta di un esempio di un complesso processo morfogenetico da cui comportamenti delle cellule multiple agire coordinatamente per generare la morfogenesi a livello dei singoli tessuti. Queste deformazioni tissutali differenziale quindi agiscono insieme per generare l'allungamento del corpo posteriore, a tutto il livello della struttura. Per capire come questi processi sono controllati e coordinati durante lo sviluppo, dobbiamo essere in grado di seguire questi processi a scale multiple (cioè

Protocol

1. preparazione di soluzioni e tirato Vetro ago

1. Fare una soluzione 25x magazzino di Tricaine (3-amino acido benzoico etil estere, chiamato anche etil 3-aminobenzoate) a 4 mg / ml in 20 mM Tris pH 8.8 e portare questa soluzione è a pH 7. aliquota del 4 ml e conservare a -20 ° C.
   NOTA: L'anestetico Tricaine agisce preferenzialmente sui canali del sodio voltaggio-dipendenti neurali bloccando così contrazioni muscolari e il movimento ^6.
2. Effettuare una soluzione di lavoro di Tricaine ad una concentrazione finale di 0,17 mg / ml in terreno di embrione E3. ⁷
   NOTA: Rendere il Tricaine soluzione di....

Results

Il protocollo descritto sopra dettagli una tecnica versatile per il montaggio di embrioni di zebrafish per l'imaging lasso di tempo a lungo termine. Un esempio di questo è mostrato in Figura 2A e animato / video Figura 1. Gli embrioni sono stati iniettati nella fase 1 cella con mRNA codificante la proteina fluorescente fotoconvertibile kikumeGR. Nella fase 15 somite sono stati montati come descritto sopra e ripreso per 12 ore su un microscopio confocale .......

Discussion

Questa tecnica di montaggio consente di embrioni da tenere ancora durante il trasferimento al microscopio e oltre esperimenti di imaging time-lapse a lungo termine volti a seguito posteriore allungamento del corpo a più scale di lunghezza. Inoltre, è versatile in quanto consente per l'esposizione su entrambi microscopia verticale e capovolto set-up, e un suggerimento è fatto per come questo può essere ulteriormente adattata per SPIM orientato verticalmente.

Un passo fondamentale in quest.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CONSUMABILI
Piastre con fondo in vetro	Mattek	P35-1.5-10-C	Piastra Petri da 35 mm, micropozzetto da 10 mm. N. 1,5
capillari in vetro di copertura per aghi da iniezione	Sutter	BF 120-94-10	Utilizziamo vetro orosilicato con filamento, OD 1,20 mm, ID 0,94 mm, lunghezza 10 cm. Tuttavia, gli aghi per filamenti non sono necessari e la maggior parte degli aghi standard per iniezione dovrebbe funzionare.
Micro-bisturi	Feather	P-715	Micro Feather bisturi oftalmico monouso con manico in plastica
Pasteur Pipette			230 mm lunghe
REAGENTI
Tricaina	Sigma-Aldrich	A5040
Agarosio a basso punto di fusione	Sigma-Aldrich	A9414
< forte>ATTREZZATURA
Pinza fine	STRUMENTI DI SCIENZA FINE GMBH	11252-30	Dumont #5
Estrattore dell'ago	Sutter	P97	Estrattore di aghi a filamento riscaldante Microscopio
binoculare da dissezione	Leica	S8 Apo