Sviluppo di un protocollo di raffinata per Trans-sclerale Subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico umano negli occhi di topo

La retina umana situato sul retro le funzioni dell'occhio come un leggero tessuto sensoriale e svolge un ruolo critico nella percezione visiva. Disfunzione delle cellule retiniche o morte delle cellule di conseguenza causa problemi alla vista o cecità permanente. Disordini che coinvolgono la degenerazione o disfunzione delle cellule in diversi strati della retina sono conosciuti come malattie degenerative retiniche, tra cui AMD è il tipo più comune e la causa principale di cecità irreversibile negli anziani nei paesi sviluppati ^1,2. Il processo patologico di AMD è associato con accumulazione "drusen" tra lo strato RPE e della membrana di Bruch sottostante, che a sua volta altera supporto RPE di fisiologia del fotoricettore, che conduce all'atrofia della retina neurale e visione perdita^{3, 4,5}. Finora, non esiste una cura per avanzati (non neovascolare) DMLE secca. L'emergere della terapia con cellule staminali come un nuovo paradigma nella medicina rigenerativa porta la speranza di sostituire le cellule RPE disfunzionali o morte con cellule staminali derivate le cellule sane. Infatti, vasti studi preclinici di trapianto staminali (ad es., cellule staminali embrionali umane)-derivate cellule RPE in RPE-degenerativa modelli animali sono stati eseguiti^6,7, alcuni dei quali hanno progredetto per studi clinici^8,9 (NCT01344993, ClinicalTrials.gov). Recentemente, una fonte alternativa di cellule staminali residenti nel livello RPE umano, le cellule staminali umane di RPE (hRPESCs), è stata identificata dal nostro laboratorio e attualmente è utilizzata negli studi preclinici di terapia di trapianto cellulare (hRPESC-RPE) di hRPESC derivato-RPE per AMD ^{10 , 11 , 12 , 13}.

La tecnica di iniezione subretinal è applicata negli studi preclinici citati sopra da più gruppi, tra cui il nostro gruppo. Ci sono due approcci generali per iniezione subretinal negli animali: trans-vitreal e trans-sclerale. L'approccio trans-vitreal ha il vantaggio del chirurgo essendo in grado di osservare direttamente l'estremità dell'ago come penetra l'occhio anteriore, attraversa la cavità intera vitreal adiacente alla lente e penetra la retina sul retro per l'occhio per raggiungere il subretinal spazio^14,15,16. Tuttavia, occorre interrompere la retina in due posizioni (anteriore e posteriore), comporta il rischio di danneggiare la lente e può causare riflusso delle cellule nel corpo vitreo quando l'ago è ritirato. Al contrario, l'approccio trans-sclera, in linea di principio, evita il coinvolgimento della retina e vitreo e riflusso esce l'occhio. In roditori pigmentate, il chirurgo può osservare inizialmente penetrazione della sclera, ma dopo il passaggio in coroidico pigmentato, l'estremità dell'ago non è più visibile. Senza osservazione diretta, violando la retina è comune e può provocare dissezione retinica e consegna di cellule e/o sangue nel vitreo. Inoltre, poiché la superficie dell'occhio è curvo, è molto difficile sapere quali gli angoli dell'ago e la profondità sono più efficaci per iniezioni trans-sclerale.

In questo articolo visualizzato in quel momento, vi presentiamo un metodo di iniezione subretinal trans-sclerale informato mediante l'uso di valutazioni post-chirurgiche con tomografia a coerenza ottica (OCT), che consente un esame dettagliato del sito di iniezione. La nostra tecnica di iniezione trans-sclerale utilizza posizioni definite, angoli e profondità per aghi per iniezione per produrre trauma chirurgico molto basso e l'alta affidabilità. Qui, dimostriamo in particolare l'iniezione di cellule hRPESC-RPE nello spazio subretinal del ratto RCS, un modello preclinico di AMD umano. Con questo metodo di iniezione, correttamente e coerentemente consegnammo le cellule hRPESC-RPE nello spazio subretinal di occhi di topo RCS con un tasso di successo molto alta. Iniezione delle cellule precedentemente è stato trovato per causare nella conservazione dei fotorecettori RCS almeno 2 mesi dopo iniezione¹³. Questa procedura viene eseguita sotto il microscopio per dissezione ed è facile da imparare. Richiede due persone (un chirurgo e un assistente) per eseguire l'iniezione e il tempo medio di iniezione per ogni animale è meno di 5 minuti. Gli angoli definiti e le profondità per aghi per iniezione rendono possibile per i laboratori, dove non è disponibile, per ottenere successo iniezione subretinal OCT. Esso permette un accesso subretinal altamente riproducibile e può essere utilizzato non solo per trapianto di cellule, ma anche per terapie farmacologiche consegna e gene.

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state approvate dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) presso la State University di New York Albany.

1. pre-iniezione preparazione

1. Preparazione di una sospensione di cellule hRPESC-RPE
   Nota: Le seguenti operazioni vengono eseguite in cappuccio sterili per coltura ed è necessario avere familiarità con base tecnica sterile.
   1. Isolare le cellule di hRPE primario da donatore umano occhi invecchiati 50-90 anni e cellule di coltura in piastre da 24 pozzetti¹². Crioconservare le cellule al passaggio 1, disgelo secondo necessità e cultura passaggio 2 (P2) celle per 4-5 settimane (Figura 1A) per iniezione.
   2. Rimuovere il terreno di coltura¹² e delicatamente risciacquo pozzi due volte con 500 µ l pre-riscaldati 1 X tampone di Dulbecco fosfato isotonico senza calcio & magnesio (1 x DPBS-CMF) aggiungendo 1 X DPBS-CMF nei pozzetti usando una pipetta di 1.000 µ l e rimuoverlo utilizzando un vuoto.
   3. Aggiungere 300 µ l tripsina/dnasi in ciascun pozzetto. Incubare le cellule hRPESC-RPE in tripsina/dnasi (4 kU dnasi per 1 mL di 0,25% tripsina-EDTA) per 4 min a 37 ° C per dissociare le cellule.
   4. Controllare le cellule al microscopio per vedere se essi sono arrotondati. Continuare a incubare le cellule in tripsina/dnasi per altri 2 minuti, se essi non hanno arrotondato ancora.
   5. Una volta che le cellule sono arrotondate per eccesso, è possibile utilizzare una pipetta di 1.000 µ l per triturare le cellule distaccate dal pozzo e trasferire la tripsina/dnasi contenenti cellule indipendente in una provetta conica da 15 mL con uguale volume di terreno di coltura pre-riscaldato, per inattivare la tripsina/dnasi.
   6. Lavare i pozzetti con pre-riscaldato 1 X DPBS-CMF pipettando delicatamente su e giù, specialmente intorno ai bordi del pozzo; quindi aggiungere queste cellule al precedente tubo conico.
   7. Centrifugare la provetta conica a 286 x g per 5 min a 4 ° C per agglomerare le cellule.
   8. Rimuovere il supernatante e risospendere le cellule con 1 mL di terreno di coltura.
   9. Contare le celle utilizzando un emocitometro.
   10. Centrifugare a 286 x g per 5 min a 4 ° C per agglomerare le cellule.
   11. Rimuovere il supernatante e risospendere le cellule in sterile bilanciato sale soluzione (BSS) a 50.000 cellule / µ l (per fornire 50.000 cellule in 1 µ l di volume durante l'iniezione subretinal).
   12. Trasferire la sospensione cellulare finale (CS) in un tubo del microcentrifuge 1,7 mL e mantenere in una miscela di acqua e ghiaccio fino all'utilizzo di iniezione.
2. Preparazione dell'iniettore di cella
   1. Inserire un ago smussato 33 sterile nella siringa per iniezione ed avvitare strettamente per assemblare l'iniettore.
   2. Pulire l'iniettore con etanolo 100% 5 - 6 volte.
   3. Pulire l'iniettore con etanolo al 70% 5 - 6 volte.
   4. Pulire l'iniettore con BSS 5 - 6 volte.
   5. Contrassegnare l'ago dell'iniettore con un pennarello nero sterile in una posizione di 600 µm distanza dalla punta dell'ago sotto il microscopio per dissezione (Figura 1B).
   6. Posizionare l'iniettore su un micromanipolatore per iniezione.

2. subretinal iniezione

1. Area chirurgica e preparazione degli animali
   1. Pesare un ratto RCS (60-100 g) di 4-5 settimane vecchio e anestetizzare utilizzando il sistema di erogazione del vapore isoflurano.
      Nota: Per indurre l'anestesia mantenere il tasso di flusso di isoflurane al 5%. Confermare la profondità dell'anestesia con le zampe e quindi ridurre il tasso di flusso a 2-3% per la manutenzione di anestesia durante l'intervento chirurgico.
   2. Posizionare un drappo di chirurgia sterile, con un rilievo di riscaldamento sotto, sul palco del microscopio per dissezione per impostare una zona operatoria sterile.
   3. Trasferire il ratto l'area chirurgica e posizionarla ratto in un cono di naso collegato al sistema isoflurano per mantenere l'anestesia.
   4. Coprire il corpo del ratto con garza. Un pizzico di punta del ratto per confermare l'anestesia completa.
2. Trans-sclerale iniezione subretinal sotto il microscopio
   1. Applicare una goccia di lubrificante occhio sull'occhio non operato del ratto.
   2. Posizionare il ratto sul suo lato destro con il suo occhio sinistro rivolto verso il soffitto per iniezione, la testa verso destra del chirurgo e le spalle verso il chirurgo.
   3. Tagliare qualsiasi baffi che coprono l'occhio con piccole forbici.
   4. Una piccola quantità di lavaocchi da lato temporale dell'occhio sinistro a goccia e raccogliere l'eccesso sul lato nasale con un applicatore di cotone per sciacquare l'occhio.
   5. Dilatare la pupilla con 1% tropicamide e 2,5% fenilefrina (preparata da fenilefrina 10% diluendo in soluzione fisiologica 0,9% sterile il giorno dell'intervento) per un esame OCT post-iniezione applicando una goccia di ciascuno.
   6. Tirare delicatamente la pelle che circonda l'occhio 4 - 6 volte per aprire la palpebra in modo che l'occhio è leggermente proptosed per facilitare l'accesso alle regioni posteriori al limbus.
   7. Applicare una goccia di lavaocchi e mantenere umido occhio.
   8. Delicatamente triturare il CS (preparato al punto 1.1.12) e caricare l'iniettore con 1,2 µ l CS. L'extra 0,2 µ l è utilizzato per compensare il riflusso di iniezione.
      Nota: Basato su nostre misurazioni, circa 5.000-8.000 celle vengono persi nel riflusso con un'iniezione di 50.000 cellule / µ l che è uguale a circa il 10-16% di perdita delle cellule e un extra di 0,2 µ l CS è stato iniettato per compensare questa perdita di cellule.
   9. Posizionare l'iniettore riempito con CS su un micromanipolatore (o avere un assistente tenerlo) verticalmente come RPE cellule tendono ad affondare facilmente in sospensione.
   10. Applicare una goccia di 0.5% proparacaine (anestetico locale) sull'occhio e rimuovere l'eccesso con un applicatore di cotone.
       Nota: Questo passaggio dovrebbe sopprimere il riflesso corneale e impedire che l'occhio lampeggi durante i passaggi successivi.
   11. Utilizzare pinze per afferrare la congiuntiva posteriormente al limbus, ruotare l'occhio per via nasale e sollevare la congiuntiva per fare una "tenda".
   12. Usare le forbici per tagliare la parte superiore della "tenda" per fare una piccola apertura nel conjunctiva ed esporre la sclera sottostante.
   13. Utilizzare pinze per afferrare il bordo del margine restante congiuntiva accanto al limbus e ruotare l'occhio per via nasale in modo che l'asse pupillare è un angolo di circa 30 gradi rispetto al piano del tavolo (Figura 1). Costante di presa del margine congiuntiva è necessaria per fornire una contro-forza durante gli inserimenti dell'ago e per mantenere l'occhio ad un angolo ottimo.
   14. Per realizzare un foro pilota per iniezione di cellule, posizionare l'estremità di un ago sterile smussato 31-calibro insulina a 1.200-1.500 µm posteriormente al limbus con l'apertura della punta rivolta verso l'alto.
   15. Regolare l'angolo dell'ago dell'insulina in modo che è 10-15 gradi di sopra della sclera (tangenziale di un piano immaginario al sito di iniezione desiderato). Lentamente penetrare il complesso sclera-coroide alla profondità dell'ago di circa 500 µm. Nel ratto pigmentato, l'estremità dell'ago sarà 'scomparire' sotto coroidico pigmentato. Per la marca di insulina ago usato qui, la distanza tra la punta dell'ago e la smussatura è 500 µm.
   16. Estrarre delicatamente l'ago da insulina (una molto piccola effusione del sangue può essere visto).
   17. Se si nota un eccessivo sanguinamento, lancia un occhio può essere applicata per deselezionare il foro, se necessario. Emorraggia continuata dopo l'applicazione lancia indica una nave potrebbe essere danneggiato.
   18. Guida ago dell'iniettore cella-caricato di RPE nel foro pilota, con l'apertura rivolta verso il basso e con un angolo di circa 10-15 gradi rispetto alla superficie locale della sclera.
   19. Inserire delicatamente l'ago dell'iniettore nel foro pilota ad una profondità di circa 500 µm per accedere allo spazio subretinal. Ci dovrebbe essere circa un margine di 100 µm tra il bordo del marchio penna nera e il punto dove l'ago è coperto da coroidico pigmentato (Figura 1 e 1 D).
   20. Chiedere all'assistente di premere delicatamente lo stantuffo della siringa iniettore per iniettare il volume appropriato di cellule (circa 1,2 µ l). Essere pronti a fornire alcune contro-forza come assistente preme sullo stantuffo.
       Nota: Prassi precedente finto con l'assistente possono fornire sia il chirurgo e l'assistente con la necessaria esperienza con questo passaggio.
   21. Mentre visivamente concentrandosi sulla penna segnare bordo, fissano l'iniettore per 25-30 s e poi ritirare lentamente l'iniettore. Una piccola quantità di riflusso è osservata comunemente.
       Nota: Se nessun riflusso è osservato, ci può essere stato un'iniezione intravitreale. Se vedete riflusso attraverso il sigillo o cellule di riempimento sotto la sclera, l'iniezione era troppo bassa.
   22. Risciacquare l'efflusso di cellulare dal sito di iniezione con il lavaocchi sterile 3 volte e raccogliere l'eccesso con un applicatore di cotone.
   23. Applicare una goccia di lubrificante occhio occhio operato e il ratto di trasferimento alla stazione OCT per esaminare la posizione delle cellule trapiantate e le dimensioni della vescichetta subretinal.

3. post-iniezione trattamento

1. Trattamento analgesico antinfiammatorio e dolore
   1. Iniettare buprenorfina a 0,1 mg/kg di peso corporeo in soluzione fisiologica per via sottocutanea per diminuire il dolore.
   2. Iniettare desametasone a 1,6 mg/kg di peso corporeo in soluzione salina tramite l'iniezione intraperitoneale (I.P.) per controllo di infiammazione.
2. Recupero degli animali
   1. Restituire il ratto della gabbia di recupero sotto una lampada di calore per mantenere la temperatura corporea.
   2. Osservare l'occhio operato per segni di emorragia.
   3. Osservare il ratto affinché che si tratta dall'anestesia.
   4. Restituire l'animale recuperato a una gabbia fresca flag la gabbia con una carta di chirurgia e monitorare quotidianamente per eventuali segni di afflizione, emorragia oculare o opacità corneali. Notificare immediatamente il veterinario se ci sono preoccupazioni.

Utilizzando la tecnica descritta in questo articolo, abbiamo consegnato costantemente le cellule hRPESC-RPE nello spazio subretinal dei ratti RCS con precisione il controllo della posizione, angolo e profondità dell'inserimento dell'ago dell'iniettore nel tessuto (Figura 1B-D ). Immediatamente dopo trapianto, un esame OCT è stato effettuato per osservare il sito di iniezione e la vescichetta subretinal creato dalle cellule trapiantate. Valutazione post-chirurgica OCT serve come uno strumento di screening per valutare la qualità di iniezioni e monitoraggio per danni alla retina o emorragia. Entrambi la vescichetta subretinal (Figura 2A, C e D) e il sito di iniezione (Figura 2A e B) potrebbe essere visto chiaramente sotto la scansione OCT. La vescichetta subretinal di solito si risolve in 24 ore dopo l'iniezione. Anche se la misurazione delle dimensioni delle vescichette è difficile utilizzando OCT, possiamo stimare l'area di vescichetta supponendo che è uguale alla zona di conservazione del fotoricettore da trapianto della cellula. Precedentemente abbiamo dimostrato che un'iniezione di 1 µ l di 50.000 cellule potrebbe portare a circa 6-7% di risparmio area della retina RCS intorno al sito di iniezione13. Come mostrato nella Figura 2A, C e D, retinico strati erano intatti al sito di iniezione, il sangue non è stato rilevato nella vescichetta, e le celle non sono state osservate nel vitroso, dimostrando minimo trauma causato dall'iniezione. Inoltre, immagini OCT rappresentative delle iniezioni fallite anche erano inclusi per riferimento (Figura 2E e F).

Con l'uso di OCT come uno strumento di feedback, abbiamo ottimizzato l'angolo e la profondità di inserimento dell'ago dell'iniettore nel tessuto. Una volta ottimizzato, questo metodo ci ha permesso di raggiungere un tasso di successo di accesso subretinal 90,8% con solo il 5,7% chirurgico ha esito negativo, sulla base dei risultati di più di 300 iniezioni subretinal precedente eseguite nella nostra altri studi13 (tabella 1). Nel restante 3,5%, i PTOM non sono stati eseguiti per diversi motivi, tra cui occhi non in una posizione adeguata a causa di isoflurane anestesia-collegata occhio rotolamento17.

A 7 giorni dopo il trapianto, gli occhi di ratto operato enucleated, fisso e sezionati per l'analisi di immunohistological. Una cellula umana marcatore nucleare (ricristianizzati)18 e un marcatore (OTX2) di cellule RPE19 sono stati utilizzati per rilevare le cellule trapiantate. Figura 3 ha mostrato uno spesso strato di cellule RPE trapiantate nello spazio subretinal che, una settimana dopo l'iniezione, è stato macchiato positivamente con entrambi gli indicatori, confermando l'identità e la consegna di successo dei trapianti. Ad una settimana dopo l'iniezione, il gran numero di cellule, come mostrato in Figura 3, può rapidamente rifiutare di un piccolo numero più tardi a causa della risposta immunitaria ospite anche in immunosuppressed RCS ratti20. Tuttavia, come accennato in precedenza, strato del fotoricettore degenerato di occhi di topo RCS possa essere trovato per essere salvato per almeno 2 mesi dopo il trapianto con hRPESC-RPE13.

Figura 1 : Un'immagine di cellule di hRPESC-RPE 4 - settimana-vecchie P2 e una dimostrazione dell'angolo e la profondità che l'ago dell'iniettore utilizza durante l'iniezione. (A) un'immagine di contrasto di fase delle cellule di hRPESC-RPE P2 4 - settimana-vecchie usato per iniezione. Barra della scala = 100 µm. (B) uno schema che mostra la distanza di 600 µm tra il bordo del marcatore e la punta dell'ago dell'iniettore misurato da un Microscala. La graduazione minima di Microscala è 100 µm. (C) un cartone animato che mostra la sezione trasversale della struttura anatomica di un occhio di ratto e una vista laterale dell'angolo e la profondità che l'ago dell'iniettore si inserisce nella parete dell'occhio. L'asse pupillare dell'occhio del ratto è di 30 gradi rispetto al piano del tavolo e ago dell'iniettore è di 15 gradi rispetto alla superficie locale del bulbo oculare. (D) un cartone animato che mostra il punto di partenza del marcatore su ago dell'iniettore e la vista dall'alto dell'iniezione dove 500 µm di ago dell'iniettore è inserito nel tessuto e uno spazio di 100 µm è rimasto tra l'apertura del foro di iniezione e il bordo del marke r. la posizione del foro è di 1.200-1.500 µm posteriormente al limbus. La punta dell'ago è indicata sul suo lato, ma dovrebbe essere rivolto verso il basso durante l'iniezione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : Immagini di ottobre dell'occhio del ratto operato immediatamente dopo l'iniezione. (A) un'immagine OCT B-scan di un occhio operato da un sito di iniezione e di vescichetta subretinal senza emorragia intravitreale. (B) una OCT intensità proiezione (VIP) immagine di volume di una serie di B-scan che rappresenta l'immagine del fondo enface del sito di inoculo. Il sito di iniezione piccola è visibile nell'immagine VIP mostrando il trauma minimo. (C) un'immagine ingrandita di OCT di (A) mostrando le cellule trapiantate nello spazio subretinal con tutti gli strati retinici contrassegnato. Questa immagine ha dimostrato che le cellule trapiantate sono state situate nello spazio subretinal. (D) un'immagine OCT B-scan mostrando una vescichetta subretinal di dimensione media. (E) un'immagine OCT B-scan mostrando un'iniezione subretinal fallito con CS situato nello spazio intravitreale. (F) un'immagine OCT B-scan mostrando un'iniezione subretinal fallita con l'intera retina frugando attraverso al sito di iniezione. Scala bar = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : Macchiatura Immunohistological di retinale sezioni congelate dopo il trapianto di cellule RPE hRPESC. (A) indicatore nucleare di cella umano (ricristianizzati) che indica il rilevamento delle cellule RPE umane trapiantate di colorazione. (B, E) Contatore di nucleare di cellule macchiatura (4', 6-diamidino-2-phenylindole; DAPI) risultati degli strati retinici, il trapianto e strato RPE. Immagine risultante dalla fusione (C) un ricristianizzati e DAPI che indica che le cellule trapiantate hRPE sono situate nello spazio subretinal. La separazione tra il trapianto e il livello RPE è un artefatto di elaborazione associato con cryo-proteggere gli occhi RCS per sezioni congelate. (D) RPE macchiatura marcatore (OTX2) delle cellule delle cellule RPE umane trapiantate. (F) un'immagine unita di OTX2 e DAPI. Barra della scala = 20 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Una sintesi di subretinal iniezioni da dieci coorti sperimentale in ratti RCS.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.