Mutanti di delezione genica generati attraverso la ricombinazione omologa sono il gold standard per gli studi di funzione genica. Viene descritto il metodo OSCAR (costruzione di una fase di Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids) per una rapida generazione di costrutti di delezione. La trasformazione fungina mediata da Agrobacterium segue. Infine, viene presentato un metodo di conferma basato su PCR delle delezioni geniche nei trasformanti fungini.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Produzione rapida del taglio nei funghi via
In questo articolo
Sommario
Abstract
Precisa delezione dei geni di interesse, lasciando inalterata il resto del genoma, fornisce il prodotto ideale per determinare la funzione del particolare gene nell'organismo vivente. In questo protocollo viene descritto il metodo OSCAR di costruzione precisa e rapida del plasmide di delezione. OSCAR si basa sul sistema di clonazione in cui viene eseguita una singola reazione di ricombinasi contenente i fianchi 5 'e 3' amplificati PCR amplificati del gene di interesse e due plasmidi, pA-Hyg OSCAR (il vettore marcatore) e pOSCAR (l'assemblea vettore). La conferma del vettore di delezione correttamente assemblato viene eseguita mediante mapping di digestione di restrizione seguita da sequenziamento. Agrobacterium tumefaciens viene quindi usato per mediare l'introduzione del costrutto di delezione in spore fungine (denominato ATMT). Infine, viene descritto un dosaggio PCR per determinare se il complesso di delezione è integrato dalla ricombinazione omologa o non omologa, indicando la delezione genica oRispettivamente integrazione ectopica. Questo approccio è stato utilizzato con successo per la cancellazione di numerosi geni in Verticillium dahliae e in Fusarium verticillioides tra altre specie.
Introduzione
La dissezione genetica è una metodologia potente per determinare l'importanza funzionale di individui o combinazioni di geni. Un approccio standard per comprendere il ruolo di geni specifici è la produzione di mutanti singoli di gene inalterati in qualsiasi altro gene. L'approccio più potente e meno potenzialmente confondibile è la delezione completa e precisa di un fotogramma aperto di lettura (GOI ORF) di un interesse senza danno ad alcuna altra funzione genica.
Poiché gli approcci standard di ligation per la generazione del plasmide di eliminazione richiedono più fasi, il razionale per OSCAR 1 è quello d....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Primer Design per amplificazione PCR di geni
- Scaricare in una lima di elaborazione di testi la regione genomica del gene di interesse (GOI) incluso il frame open reading (ORF) e almeno 2 kb affiancando il gene da entrambi i lati da FungiDB o da un'altra risorsa genomica.
- Evidenziare l'ORF destinato alla cancellazione e all'avvio dell'etichetta e fermare i codoni.
- Identificare e evidenziare gli ORF adiacenti all'interno della sequenza scaricata.
- Utilizzare l'estremità 2 kb 5 'del GOI ORF e lo strumento di progettazione di primer (vedere Elenco materiali) per progettare la coppia di primer ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Il metodo OSCAR, in una sola reazione, genera un plasmide contenente i fianchi del gene target da eliminare che circonda la cassetta di marker selezionabile. La produzione di costruzioni di delezione utilizzando OSCAR è molto efficace. Il sistema può tuttavia produrre componenti costruttivi contenenti alcuni ma non tutti e tre i frammenti (i due fianchi del gene e il marker selectable). Generalmente, la maggior parte dei trasformatori di E. coli contengono il buon costrutto OSCA.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
La costruzione di una fase di Agrobacterium -ready-plasmids-ready-plasmid (OSCAR) è stata impiegata con successo con un numero sempre crescente di funghi Ascomycota. Il metodo dovrebbe anche essere facilmente applicabile al Basidiomycota e alle specie di altri phyla fungine (con opportuni promotori che guidano i geni marcatori selectable), assumendo la trasformazione mediata da Agrobacterium e la ricombinazione omologa. Varianti di contrassegno aggiuntivi sono stati generati per diversificare le scelte.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano i seguenti studenti universitari e scuole superiori per il loro lavoro per generare mutanti OSCAR nei verticillioidi di Fusarium : Anjellica Miller, Athar Naseer, Xiu Lin, Katelyn Woodburry, Chelsea Patterson, Kathleen Robertson, Krystina Bradley, Ashton Rogers, Alexis McKensie, Manny Hernandez Cookie, Jake Goodman, Sampriti De, Oge Okoye, Alyssa Beckstead, Garrett Hibbs, Nick Goldstein, Caroline Twum, Ashley Crepsac, Jeff Delong, Christian King, Gi Jeong, Maria Belding, Christy Burre, Chris Benson, Louis Stokes, Hannah Itell, Jane Hulse, Jasim Mohammed, James Loggins, Kelli Russell, Gre'Nisha Jones, Kristin Sheaffer, Mariam Hammad....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| FungiDB | Database/ http://fungidb.org/fungidb/ | ||
| IDT PrimerQuest | IDT | Primer design online software/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index | |
| Microsoft Word | Manipolazione di file di sequenza | ||
| Basso Na LB Spec 100 medio | E. coli selezione del trasformante, composizione: 1% triptone, 0,05% NaCl, 0,5% estratto di lievito, 1,5% agar se per terreno solido | ||
| co-coltivazione | Induzione della trasformazione ATMT (Riferimento 12) | ||
| Aspergillus terreno minimo con igromicina | Selezione di trasformanti fungini | ||
| Terreno PDA | Acumedia | 7149A | Provette |
| inclinate a spora singolaPDA-Hyg-Kan medio | Isolamento fungino ransformante, PDA contenente 150 μ g/mL di igromicina B e 100 μ g/mL Kanamicina | ||
| Perle di vetro | Genlantis | C400100 | Spalmatura di piastre |
| Filtri nitrocellulosici (47 mm) | Fisher | 09-719-555 | Co-coltura per ATMT |
| Varie provette | preparazioni multiple | ||
| piastre di Petri (varie) | Coltura di batteri e funghi | ||
| pA-Hyg OSCAR | Addgene | 29640 | Vettore marcatore selezionabile |
| pOSCAR | Addgene | 29639 | Vettore di assemblaggio |
| DH5α One Shot Competent E. coli cells | Life Technologies | 12297-016 | BP reazione trasformazione |
| ccdB sopravvivenza cellule di E. coli | Life Technologies | A10460 | Manutenzione di pOSCAR |
| trasferimento in legno | Striature di colonie | ||
| Stuzzicadenti | Prelievo di colonie | ||
| Microcentrifuga | Pellettatura di batteri, ecc. | ||
| Centrifuga | Raccolta di spore fungine | ||
| Microscopio | Singolo isolamento delle spore | ||
| cellulare automatizzato Calcolo della | sospensione delle spore | ||
| Microscopio | Emocitometro Conteggio delle cellule | ||
| Kit di purificazione QIAquick PCR | Qiagen | 28104 | PCR gene flank produict purificazione |
| TaKaRa LA Taq | Takara Bio USA | RR002A | Hi Fidelity taq polimerasi per la generazione del fianco OSCAR |
| Igromicina B | InvivoGen | ant-hg-5 | |
| Spectinomycin | Sigma | 22189-32-8 | |
| Cefotaxime | TCI America | C2224 | |
| Kanamicina | 11815032 | ||
| Moxalactam | Sigma-Aldrich | 43963 | |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | Post colorazione gel di agarosio |
| Qiagen QIAquick PCR Purification Kit (Cat. n. 28104) | |||
| (OneShot_ Mach1TM T1R o One Shot_ OmniMAX & trade; 2 T1R di Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | C862003 | |
| Gateway BP Clonase II Miscela di enzimi | Thermo Fisher Scientific | 11789020 | Utilizzato per assemblare il costrutto di delezione in pOSAR |
Riferimenti
- Paz, Z., García-Pedrajas, M. D., Andrews, D. L., Klosterman, S. J., Baeza-Montañez, L., Gold, S. E. One step construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids (OSCAR), an efficient and robust tool for ATMT based gene deletion construction in fungi. Fungal Genet Biol. 48 (7), 677-684 (2011).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
