Mutanti di delezione genica generati attraverso la ricombinazione omologa sono il gold standard per gli studi di funzione genica. Viene descritto il metodo OSCAR (costruzione di una fase di Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids) per una rapida generazione di costrutti di delezione. La trasformazione fungina mediata da Agrobacterium segue. Infine, viene presentato un metodo di conferma basato su PCR delle delezioni geniche nei trasformanti fungini.
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Articolo metodologico
Produzione rapida del taglio nei funghi via
In questo articolo
Sommario
Abstract
Precisa delezione dei geni di interesse, lasciando inalterata il resto del genoma, fornisce il prodotto ideale per determinare la funzione del particolare gene nell'organismo vivente. In questo protocollo viene descritto il metodo OSCAR di costruzione precisa e rapida del plasmide di delezione. OSCAR si basa sul sistema di clonazione in cui viene eseguita una singola reazione di ricombinasi contenente i fianchi 5 'e 3' amplificati PCR amplificati del gene di interesse e due plasmidi, pA-Hyg OSCAR (il vettore marcatore) e pOSCAR (l'assemblea vettore). La conferma del vettore di delezione correttamente assemblato viene eseguita mediante mapping di digestione di restrizione seguita da sequenziamento. Agrobacterium tumefaciens viene quindi usato per mediare l'introduzione del costrutto di delezione in spore fungine (denominato ATMT). Infine, viene descritto un dosaggio PCR per determinare se il complesso di delezione è integrato dalla ricombinazione omologa o non omologa, indicando la delezione genica oRispettivamente integrazione ectopica. Questo approccio è stato utilizzato con successo per la cancellazione di numerosi geni in Verticillium dahliae e in Fusarium verticillioides tra altre specie.
Introduzione
La dissezione genetica è una metodologia potente per determinare l'importanza funzionale di individui o combinazioni di geni. Un approccio standard per comprendere il ruolo di geni specifici è la produzione di mutanti singoli di gene inalterati in qualsiasi altro gene. L'approccio più potente e meno potenzialmente confondibile è la delezione completa e precisa di un fotogramma aperto di lettura (GOI ORF) di un interesse senza danno ad alcuna altra funzione genica.
Poiché gli approcci standard di ligation per la generazione del plasmide di eliminazione richiedono più fasi, il razionale per OSCAR 1 è quello di produrre un approccio più rapido in vitro . La figura 1 illustra il processo di assemblaggio nell'approccio OSCAR. Il metodo descritto qui presenta il vantaggio di combinare la rapida costruzione di singoli vettori di delezione dei geni in una singola reazione multipartia in combinazione con la successiva transfo mediata da Agrobacterium tumefaciensRmation (ATMT). OSCAR è molto veloce e si confronta con altre strategie, come l'uso del gruppo Gibson nel lievito 2 . Il metodo OSCAR è stato utilizzato con successo con diverse specie di funghi Ascomycota. Queste specie includono : Fusarium verticillioides (inedito), Verticillium dahliae 3 , Setosphaeria turcica 4 , Metarhizium robertsii 5 , Fusarium oxysporum f. sp. Vasinfectum 6 , Pestalotiopsis microspora 7 , Colletotrichum higginsianum 8 e Dothistroma septosporum 9 e Sarocladium zeae (inedito) .
Questo protocollo fornisce istruzioni passo per passo per il metodo che include il disegno del primer, l'amplificazione del PCR a fianco, la reazione di OSCAR BP, la configurazione della struttura di delezione, la trasformazioneIone di Agrobacterium con il costrutto seguito dal trasferimento basato sul ATMT del costrutto di delezione nelle cellule fungine e infine differenziando i mutanti della delezione fungina da quelli con costrutti di delezione integrati ectopicamente.
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Protocollo
1. Primer Design per amplificazione PCR di geni
- Scaricare in una lima di elaborazione di testi la regione genomica del gene di interesse (GOI) incluso il frame open reading (ORF) e almeno 2 kb affiancando il gene da entrambi i lati da FungiDB o da un'altra risorsa genomica.
- Evidenziare l'ORF destinato alla cancellazione e all'avvio dell'etichetta e fermare i codoni.
- Identificare e evidenziare gli ORF adiacenti all'interno della sequenza scaricata.
- Utilizzare l'estremità 2 kb 5 'del GOI ORF e lo strumento di progettazione di primer (vedere Elenco materiali) per progettare la coppia di primer PCR O1 e O2 per generare un prodotto di dimensioni minime di 1 kb. Fare attenzione a non influenzare ORF adiacenti.
- Incollare il fianco 2 kb 5 'nella finestra "Sequence Entry". Fai clic su "Mostra parametri personalizzati". Immettere i seguenti parametri di progettazione personalizzati: primer TM 58 (min), 60 (opt) e 62 (max); Primer GC 40 (min), 50 (opt) e 60 (max); Formato primer 22 (min), 24 (opt) e 26(Max); Amplicon Dimensione 1250 (min), 1500 (opt) e 2000 (max).
- Scegli il risultato che pone il primer inverso (O2) più vicino all'ORF. Cattura un colpo di schermo dei dosaggi e copia e incolla le sequenze primer nel documento di elaborazione di testi.
- Ripetere il processo per 3 'fianco per generare primer O3 e O4, questa volta scegliere il risultato che pone il primer avanzato (O3) più vicino all'ORF bersaglio.
- Aggiungere i siti appropriati di collegamento a 5 'estremità dei primer da 1 a 4 (vedi tabella 1 ).
- Inoltre progettare e ordinare primer specifici ORF da utilizzare per la conferma della cancellazione nella sezione 4 di seguito. I parametri devono essere identici a quelli descritti nel passaggio 1.4.1, ad eccezione dell'utilizzo Amplicon Size 500 (min), 750 (opt) e 1000 (max) regolazione per lunghezza di ORF, se necessario. Infine, per la conferma di ricombinanti omologhi, generare 5 'out e 3' out primers trovato appena fuori i fianchi all'interno del cromosoma. Questi primer "fuori" verranno usati conRispettivamente hygR (210) e hygF (850) ( Fig. 2 ).
- Primer di ordine.
2. Produzione di costruzioni OSCAR
- Utilizzando una Taq ad alta fedeltà , eseguire due reazioni, ciascuna per i fianchi 5 'e 3', utilizzando primer (100 μM) O1 e O2 in una reazione e primer O3 e O4 nel secondo. La miscela di reazione contiene le seguenti: 29,5 μL di acqua distillata sterile (SDW), 5 μL di 10 volte LA PCR tampone, 8 μL di 2,5 mM dNTP mix, 5 μL di 25 mM MgCl2, 1 μl di template (50 ng / La fedeltà Taq , 0,5 μL di Primer O1 e 0,5 μL di Primer O2 per il fianco 5 '(o 0,5 μL di Primer O3 e 0,5 μL di Primer O4 per il fianco 3') Utilizzare le condizioni di reazione sono le seguenti: 94 ° C per 1 min, poi 30 cicli di 94 ° C per 30 s, 60 ° C per 30 s, 72 ° C per 2 minuti, poi passaggi finali di 72 ° C per 5 minuti e poi mantenersi indefinitamente a 10 ° C.
- Esegui 0.8%Agarosio 1x TAE (40 mM Tris acetato pH 8,3, 1 mM EDTA) elettroforesi per circa 125 Vh in un apparato minigel standard per determinare la dimensione del prodotto e la concentrazione relativa. Inserire il gel con macchia non etidica secondo le istruzioni del produttore. Visualizzare su un illuminatore UV.
- Se i prodotti a fianco 5 'e 3' sono in concentrazione approssimativamente pari, li combinano e usano un kit di colonna di affinità (o precipitazione PEG 90 μL prodotti combinati PCR, 240 μl TE buffer pH 7,5, 160 μl 30% polietilenglicole PEG8000 30 mM MgCl 2 ) per co-purificare i prodotti PCR secondo il protocollo del produttore. Se non sono di uguale concentrazione, combinare tutti i prodotti a bassa concentrazione con una stima uguale di prodotto della reazione di resa più elevata.
- Utilizzare uno spettrofotometro per misurare la concentrazione del DNA purificato.
- Effettuare la reazione di BP mescolando quanto segue: 1 μL di 60 ng / μL pOSCAR, 2 μL di 60 ng /ΜL pA-Hyg-OSCAR, 1 μL di 60 ng / μL fianchi combinati, 1 μL di clonasi. Incubare per 16 ore a 25 ° C. Terminare la reazione aggiungendo 0,5 μl di proteinasi K e incubare per 10 minuti a 37 ° C.
- Trasformare alta competenza E. Coli . Entrambe le cellule competenti disponibili in commercio e le cellule competenti fatte in casa DH5α CaCl2 sono state utilizzate con successo come destinatari come descritto dalle istruzioni del produttore. Piastra a basso contenuto di sodio (0,5 g / L NaCl) LB contenente 100 μg / mL di spectinomycin (Spec).
- Identificare la struttura corretta eseguendo minipreps di DNA 10 delle colonie generate sopra. Eseguire la doppia digestione con Hin dIII e Kpn I come segue: pipetta 5 μL di DNA, 2 U di ciascun enzima, 2 μl di 10x buffer appropriato con SDW a un volume totale di 20 μL. Questo rilascia l'inserto (circa 4,5 kb con i fianchi del gene 1,5 kb) dal vettore ( circa 7 kb) e taglia tutti i siti inFianchi che possono dare dimensioni predefinibili delle bande.
- Sequenza 11 selezioni i cloni che mostrano un appropriato pattern di bande.
3. Agrobacterium tumefaciens trasformazione mediata (ATMT) dei funghi
- Trasformare il ceppo Agrobacterium tumefaciens AGL1 con il construct del delezione OSCAR 12 .
- Trasformare il fungo con AGL1 contenente il plasmide di delezione GOI OSCAR. A tale scopo procedere come segue:
- Preparare una sospensione spore fungina con acqua sterile a 2 x 10 6 spore / ml. Quantificare le spore su un emocitometro o un contatore di cellule automatiche. Mettere 500 μL di questo in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml. Questa impostazione è per 4 piastre di trasformazione.
- Utilizzare un ciclo sterile sterile azzurro per aggiungere un gobetto facilmente visibile (dovrebbe coprire circa il 20% del diametro del ciclo) del plasmide di delezione contenente AGL1 da un substrato LB-Spec 100 di 2-3 giorni (vedi MElenco delle composizioni per la composizione) contenenti piatti e mescolare nella sospensione dello spore. Vortex fino a quando le cellule batteriche sono ben disperse ( circa 5 minuti di media velocità).
- Pipettare 100 μl della sospensione conidia-Agro al centro di un filtro a membrana di cellulosa posto su ciascuno dei quattro piatti da 6 cm di Petri contenenti il mezzo di coltura 12 .
- Spalmare la sospensione con le perline di vetro sterili (circa 4) per coprire tutta la superficie del filtro a membrana. In alternativa, spalmare la sospensione usando uno strumento tradizionale di spargimento. Lasciare che il filtro della membrana si asciughi in una cappa per circa 10 minuti, avvolgere con film paraffina. Ripetere i passaggi 3.2.2 e 3.2.3 per impostare più trasformazioni.
- Incubare la piastra per 2 giorni a temperatura ambiente, invertita.
- Trasferire il filtro a membrana in 6 centimetri di selezione di Aspergillus 12 piastre contenenti hygromycin B (Hyg) 150 μg / mL, 200 mg di cefotaxime e 100 μg / mLmoxalactam. Incubare a temperatura ambiente per 5-7 giorni prima di isolare le colonie igroscopiche.
- Con gli stuzzicadenti sterili, trasferire i trasformanti putativi su 6 cm di piastre di patata di Dextrose Agar (PDA) contenenti 150 μg / mL Hyg, 100 μg / mL kanamicina.
4. Identificazione mutante deletione mediante PCR
- Estrarre il DNA per PCR dai trasformanti mediante termolisi 13 .
- Una volta che i trasformanti formano colonie sul PDA dalla fase 3.2.7, utilizzare uno stuzzicadenti sterile per trasferire una piccola quantità (2 mm x 2 mm) di micelle o di cellule di lievito dalla colonia in 100 μl di soluzione di lisi (50 mM di sodio fosfato, pH 7,4, 1 mM EDTA, 5% glicerolo) in un tubo di microcentrifuga.
- Incubare la miscela a 85-90 ° C per 20-30 min. Conservare l'estratto grezzo contenente DNA genomico a -20 ° C fino all'uso nel passaggio 4.2.
- Effettuare 4 reazioni PCR per trasformante, ognuna da dLa recombinazione omologa dei fianchi 5 'e 3' rispettivamente, uno per il marcatore selectable (hygromycin fosfotransferasi in questo caso) e uno per il GOI ORF.
NOTA: generalmente utilizziamo Taq a bassa fedeltà a basso costo per queste reazioni. Le condizioni di reazione sono quelle descritte nel punto 2.1 precedenti e contengono SDW 20 μL, 10 volte Taq buffer 2,5 μL, dNTPS (10 mM) 0,5 μL, Taq 14 casalingo, 0,5 μL, Primer A (100 μM) 0,5 μL, Primer B (100 μM ) 0,5 μL, Template 0,5 μL. Possono essere utilizzati altrettanto bene gli stock di primer di concentrazione inferiori (10 μM). - Eseguire un gel agarosio ( ad esempio 0,8%) dei prodotti PCR. I mutanti di Deletione produrranno la banda Hyg ma non un prodotto ORF. Gli integratori ectopici mostreranno entrambe le bande. Il tipo Wild produce solo la banda ORF.
- Memorizzare permanentemente mutanti di cancellazione (e un trasformante ectopico o due per i controlli) per un uso futuro.
NOTA: 15% di glicerolo è usato per sHa strappato i nostri ceppi a lungo termine a -80 ° C.
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Risultati
Il metodo OSCAR, in una sola reazione, genera un plasmide contenente i fianchi del gene target da eliminare che circonda la cassetta di marker selezionabile. La produzione di costruzioni di delezione utilizzando OSCAR è molto efficace. Il sistema può tuttavia produrre componenti costruttivi contenenti alcuni ma non tutti e tre i frammenti (i due fianchi del gene e il marker selectable). Generalmente, la maggior parte dei trasformatori di E. coli contengono il buon costrutto OSCA...
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Discussione
La costruzione di una fase di Agrobacterium -ready-plasmids-ready-plasmid (OSCAR) è stata impiegata con successo con un numero sempre crescente di funghi Ascomycota. Il metodo dovrebbe anche essere facilmente applicabile al Basidiomycota e alle specie di altri phyla fungine (con opportuni promotori che guidano i geni marcatori selectable), assumendo la trasformazione mediata da Agrobacterium e la ricombinazione omologa. Varianti di contrassegno aggiuntivi sono stati generati per diversificare le scelte...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano i seguenti studenti universitari e scuole superiori per il loro lavoro per generare mutanti OSCAR nei verticillioidi di Fusarium : Anjellica Miller, Athar Naseer, Xiu Lin, Katelyn Woodburry, Chelsea Patterson, Kathleen Robertson, Krystina Bradley, Ashton Rogers, Alexis McKensie, Manny Hernandez Cookie, Jake Goodman, Sampriti De, Oge Okoye, Alyssa Beckstead, Garrett Hibbs, Nick Goldstein, Caroline Twum, Ashley Crepsac, Jeff Delong, Christian King, Gi Jeong, Maria Belding, Christy Burre, Chris Benson, Louis Stokes, Hannah Itell, Jane Hulse, Jasim Mohammed, James Loggins, Kelli Russell, Gre'Nisha Jones, Kristin Sheaffer, Mariam Hammady, Ava Wilson, Katrina Bazemore, Toney Harper, Karlin McGhee, Mohmed Momin, Rima Momin , Thi Ngoc Le e Angel Pham.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| FungiDB | Database/ http://fungidb.org/fungidb/ | ||
| IDT PrimerQuest | IDT | Primer design online software/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index | |
| Microsoft Word | Manipolazione di file di sequenza | ||
| Basso Na LB Spec 100 medio | E. coli selezione del trasformante, composizione: 1% triptone, 0,05% NaCl, 0,5% estratto di lievito, 1,5% agar se per terreno solido | ||
| co-coltivazione | Induzione della trasformazione ATMT (Riferimento 12) | ||
| Aspergillus terreno minimo con igromicina | Selezione di trasformanti fungini | ||
| Terreno PDA | Acumedia | 7149A | Provette |
| inclinate a spora singolaPDA-Hyg-Kan medio | Isolamento fungino ransformante, PDA contenente 150 μ g/mL di igromicina B e 100 μ g/mL Kanamicina | ||
| Perle di vetro | Genlantis | C400100 | Spalmatura di piastre |
| Filtri nitrocellulosici (47 mm) | Fisher | 09-719-555 | Co-coltura per ATMT |
| Varie provette | preparazioni multiple | ||
| piastre di Petri (varie) | Coltura di batteri e funghi | ||
| pA-Hyg OSCAR | Addgene | 29640 | Vettore marcatore selezionabile |
| pOSCAR | Addgene | 29639 | Vettore di assemblaggio |
| DH5α One Shot Competent E. coli cells | Life Technologies | 12297-016 | BP reazione trasformazione |
| ccdB sopravvivenza cellule di E. coli | Life Technologies | A10460 | Manutenzione di pOSCAR |
| trasferimento in legno | Striature di colonie | ||
| Stuzzicadenti | Prelievo di colonie | ||
| Microcentrifuga | Pellettatura di batteri, ecc. | ||
| Centrifuga | Raccolta di spore fungine | ||
| Microscopio | Singolo isolamento delle spore | ||
| cellulare automatizzato Calcolo della | sospensione delle spore | ||
| Microscopio | Emocitometro Conteggio delle cellule | ||
| Kit di purificazione QIAquick PCR | Qiagen | 28104 | PCR gene flank produict purificazione |
| TaKaRa LA Taq | Takara Bio USA | RR002A | Hi Fidelity taq polimerasi per la generazione del fianco OSCAR |
| Igromicina B | InvivoGen | ant-hg-5 | |
| Spectinomycin | Sigma | 22189-32-8 | |
| Cefotaxime | TCI America | C2224 | |
| Kanamicina | 11815032 | ||
| Moxalactam | Sigma-Aldrich | 43963 | |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | Post colorazione gel di agarosio |
| Qiagen QIAquick PCR Purification Kit (Cat. n. 28104) | |||
| (OneShot_ Mach1TM T1R o One Shot_ OmniMAX & trade; 2 T1R di Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | C862003 | |
| Gateway BP Clonase II Miscela di enzimi | Thermo Fisher Scientific | 11789020 | Utilizzato per assemblare il costrutto di delezione in pOSAR |
Riferimenti
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