Recenti scoperte suggeriscono che i motori flagellari batterici percepiscono una varietà di segnali ambientali e si rimodellano in risposta. I saggi a microsfere qui discussi dovrebbero aiutare a spiegare il ruolo del rimodellamento nell'adattamento cellulare ai fattori di stress ambientale.
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Articolo metodologico
Caratterizzazione biofisica delle funzioni flagellare a motore
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il ruolo dei motori flagellari nella motilità batterica e nella chemiotassi è ben compreso. Recenti scoperte suggeriscono che i motori flagellari sono in grado di rimodellarsi in risposta a una varietà di stimoli ambientali e sono tra i fattori scatenanti della colonizzazione superficiale e delle infezioni. I meccanismi precisi con cui i motori rimodellano e promuovono l'adattamento cellulare dipendono probabilmente dagli attributi motori chiave. La tecnica di tracciamento delle microsfere basata su fotomoltiplicatore qui presentata consente un'accurata caratterizzazione biofisica delle funzioni motorie, compresi gli adattamenti delle velocità dei motori e della dinamica degli interruttori. Questo approccio offre il vantaggio del tracciamento in tempo reale e la capacità di sondare il comportamento motorio per periodi prolungati. I protocolli discussi possono essere facilmente estesi allo studio dei motori flagellari in una varietà di specie batteriche.
Introduzione
I motori flagellare consentono alle cellule di nuotare ruotando filamenti extracellulari elicoidali. La quantità di coppia del motore può generare per una data lunghezza del flagello (cioè, il carico viscoso) determina le velocità di nuoto. D'altro canto, la capacità di cambiare la direzione di rotazione controlla migrazione delle cellule in risposta ad agenti chimici, un processo noto come chemiotassi. Chemiotassi e la motilità di essere fattori di virulenza 1-3, motori flagellare sono stati ben caratterizzati nel corso degli anni 4. Prove di montaggio ora suggerisce che il motore funge mechanosensor - rileva meccanicamente la pres....
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Protocollo
1. Preparazione delle cellule
- Grow culture durante la notte del ceppo desiderato portando il appiccicoso flic allele 15,22 a triptone Broth (TB, 1% Peptone, 0.5% NaCl) seguita da inoculo in diluizione 1: 100 in 10 ml TB fresco. Crescere la coltura a 33 ° C in un incubatore shaker fino OD 600 = 0.5.
- Agglomerare le cellule a 1500 xg per 5 - 7 min e ri-disperdere il pellet vigorosamente in 10 mL di tampone di filtro sterilizzato motilità (MB; 10 mM tampone fosfato: 0,05-0,06 M NaCl, 10 -4 M EDTA, 1 mM metionina, pH 7,0).
- Ripetere il punto 1.2 altre due volte e ri-disperdere il pellet finale in 1 ml....
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Risultati
La configurazione fotomoltiplicatore è mostrato nella Figura 1A. È importante che i PMT hanno alte sensibilità nel range di lunghezze d'onda sparse dalle perline di interesse. Le PMT impiegati qui operano nelle gamme visibile e vicino infrarosso, e sono stati in grado di rilevare la luce diffusa dalla perle illuminate da una sorgente di luce alogena. Le condizioni di luce ottimali e tensioni di alimentazione variano da una configurazione all'altra. Per la configu.......
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Discussione
Al fine di facilitare tethered tallone-tracking e stima corretta del motore coppie, le seguenti informazioni dovrebbe essere rivisto. Quando si eseguono queste misure con cellule flagellate, tosatura è un passaggio fondamentale. Shearing riduce la flagellar filamento ad un semplice stub, garantendo così che il carico sul motore viscosa è prevalentemente dovuta al tallone e può essere stimato entro l'errore 10% 16. Shearing migliora anche la possibilità di trovare le traiettorie circolari con eccentricità .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Howard Berg per il dono del microscopio/fotomoltiplicatori a tracciamento delle perle e la Texas A&M Engineering Experiment Station per i fondi.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione di poli-L-lisina (0,1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| Microsfere Polybeads | Polysciences, Inc. | 7307 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| 1 mL Luer Slip Tip Siringa | Exel Int. | 26048 | http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php |
| Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23 gauge | Becton, Dickinson and Company | 427565 | http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp |
| Tubo in polietilene | Harvard Apparatus | 59-8325 | http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html |
| fotomoltiplicatore Tubi | Hamamatsu | R7400U-20 | Gamma di risposta spettrale da 300 a 920 nm, lunghezza d'onda di picco 630 nm, tempo di risposta di 0,78 ns http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html |
| 3 fessure di precisione da 1 mm | Edmund Optics | NT39-908 | 2 fessure montate ad angolo retto l'una rispetto all'altra su tubi fotomoltiplicatori |
| Oscilloscopio | Tektronix | TBS 1032B | Sono accettabili marche alternative. Oscilloscopio Digitale, Serie TBS 1000B, 2 Analogici, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope |
| Filtro LP/HP a 8 poli | Krohn-Hite | 3384 | Sono accettabili marche alternative. Si consiglia una gamma di frequenza da 0,1 Hz a 200 kHz. http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf |
| Microscopio Optiphot | Nikon | NA | È possibile utilizzare qualsiasi microscopio a fase verticale o invertita. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754 |
| 50:50 (R:T) Beamsplitter a cubo | ThorLabs | BS013 |
Riferimenti
- Emody, L., Kerenyi, M., Nagy, G. Virulence factors of uropathogenic Echerichia coli. Int J Antimicrob. Ag. 22, 29-33 (2003).
- Lane, M. C., et al. Role of motility in the colonization of uropathogenic Escherichia coli in the urinary tract. Infect Immun<....
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Ristampe e permessi
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