Recenti scoperte suggeriscono che i motori flagellari batterici percepiscono una varietà di segnali ambientali e si rimodellano in risposta. I saggi a microsfere qui discussi dovrebbero aiutare a spiegare il ruolo del rimodellamento nell'adattamento cellulare ai fattori di stress ambientale.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Caratterizzazione biofisica delle funzioni flagellare a motore
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il ruolo dei motori flagellari nella motilità batterica e nella chemiotassi è ben compreso. Recenti scoperte suggeriscono che i motori flagellari sono in grado di rimodellarsi in risposta a una varietà di stimoli ambientali e sono tra i fattori scatenanti della colonizzazione superficiale e delle infezioni. I meccanismi precisi con cui i motori rimodellano e promuovono l'adattamento cellulare dipendono probabilmente dagli attributi motori chiave. La tecnica di tracciamento delle microsfere basata su fotomoltiplicatore qui presentata consente un'accurata caratterizzazione biofisica delle funzioni motorie, compresi gli adattamenti delle velocità dei motori e della dinamica degli interruttori. Questo approccio offre il vantaggio del tracciamento in tempo reale e la capacità di sondare il comportamento motorio per periodi prolungati. I protocolli discussi possono essere facilmente estesi allo studio dei motori flagellari in una varietà di specie batteriche.
Introduzione
I motori flagellare consentono alle cellule di nuotare ruotando filamenti extracellulari elicoidali. La quantità di coppia del motore può generare per una data lunghezza del flagello (cioè, il carico viscoso) determina le velocità di nuoto. D'altro canto, la capacità di cambiare la direzione di rotazione controlla migrazione delle cellule in risposta ad agenti chimici, un processo noto come chemiotassi. Chemiotassi e la motilità di essere fattori di virulenza 1-3, motori flagellare sono stati ben caratterizzati nel corso degli anni 4. Prove di montaggio ora suggerisce che il motore funge mechanosensor - rileva meccanicamente la presenza di substrati solidi 5,6. Questa capacità aiuta probabilmente a scatenare la colonizzazione della superficie e le infezioni 5,7. Di conseguenza, i meccanismi per cui il motore individua automaticamente superfici e iniziati segnalazione sono di importanza 8,9.
Il motore flagellare può essere facilmente studiato da legare il flagellum ad un substrato e osservando la rotazione cellulare. Tale tethering è stato raggiunto prima da Silverman e Simon, che lavorava con un mutante polyhook in E. coli e ganci fissati con successo per substrati di vetro con anticorpi anti-gancio 10. Il test legato celle consentito ai ricercatori di studiare le risposte del motore interruttore ad una varietà di stimoli chimici. Ad esempio, Segall e collaboratori stimolati chimicamente le cellule in collegamento, con l'ausilio di pipette iontoforesi. I cambiamenti corrispondenti pregiudizi CW (la frazione dei motori tempo di rotazione in senso orario, CW) ha permesso loro di misurare le cinetiche di adattamento della rete chemiotassi 11,12. Mentre il test delle cellule legato è stato efficace nello studio delle risposte degli interruttori, è stato solo in grado di offrire intuizioni meccanica del motore su una gamma limitata di carichi viscosi 13. Per superare questo problema, Ryu e collaboratori impastoiati sferiche, sfere di lattice a filamento stub su cellule attaccate alle superfici. Le perle sono statipoi monitorati tramite interferometria back-focale con trappole ottiche deboli 14. Lavorando con perline di diverse dimensioni, i ricercatori possono studiare il motore su una gamma più ampia di carichi. Questo test è stato poi migliorato da Yuan e Berg, che ha sviluppato una tecnica di tallone-tracking fotomoltiplicatore a base combinata con illuminazione laser in campo scuro. Il loro metodo attivato il monitoraggio di nanobeads frenati d'oro che erano così piccola (~ 60 nm) che le resistenze viscose esterni sono stati inferiori rispetto alle resistenze viscose interne a rotazione 15,16. Ciò ha portato alle misure delle velocità massime ottenibili in E. coli (~ 300 Hz). In V. alginolyticus, simili saggi di perline attivate misure dei tassi di filatura a carichi intermedi viscosi (~ 700 Hz) 17. Consentendo misurazioni di risposte motorie sull'intera gamma possibile di carichi viscosi (da zero-carico quasi stallo), le perline-saggi fornito un importante strumento biofisico per comprendere il tprocesso orque generazione 18,19.
Recentemente, abbiamo modificato il dosaggio Yuan-Berg per includere pinzette ottiche che ci hanno permesso di applicare stimoli meccanici precisi per singoli motori 6. Usando questa tecnica, abbiamo dimostrato che la forza-generatori che ruotano il motore sono meccanosensori dinamici - si rimodellare in risposta ai cambiamenti di carichi viscosi. È possibile che tale load sensing innesca differenziazione cellulare nei batteri brulicanti, sebbene i meccanismi rimangono poco chiari. E 'anche probabile che i motori flagellare in altre specie sono anche meccanosensibili 20, anche se la prova diretta è carente. Qui, si discute l'approccio fotomoltiplicatore-based (PMT) per il monitoraggio della rotazione delle sfere di lattice impastoiati ai filamenti flagellari 15. Rispetto al monitoraggio con telecamere ultraveloci, il fotomoltiplicatore-setup è vantaggioso perché è relativamente semplice per tenere traccia delle singole perle in tempo reale e più a lungo durazioni. E 'particolarmente utile quando si studia a lungo tempo rimodellamento in complessi a motore flagellare a causa di stimoli ambientali 21. Anche se abbiamo protocolli dettaglio specifico per E. coli, che possono essere facilmente adattati per lo studio di motori flagellare in altre specie.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Preparazione delle cellule
- Grow culture durante la notte del ceppo desiderato portando il appiccicoso flic allele 15,22 a triptone Broth (TB, 1% Peptone, 0.5% NaCl) seguita da inoculo in diluizione 1: 100 in 10 ml TB fresco. Crescere la coltura a 33 ° C in un incubatore shaker fino OD 600 = 0.5.
- Agglomerare le cellule a 1500 xg per 5 - 7 min e ri-disperdere il pellet vigorosamente in 10 mL di tampone di filtro sterilizzato motilità (MB; 10 mM tampone fosfato: 0,05-0,06 M NaCl, 10 -4 M EDTA, 1 mM metionina, pH 7,0).
- Ripetere il punto 1.2 altre due volte e ri-disperdere il pellet finale in 1 ml MB.
- Tosare la sospensione passando avanti e indietro ~ 75 volte tra due siringhe con 21 a 23 adattatori calibro connesso con un tubo in polietilene (7 - 12 cm di lunghezza, diametro 0,58 mm interno). Limitare il tempo totale di taglio a 30 - 45 s.
- Centrifugare le cellule tranciate a 1.500 xg per 5-7 minuti e ri-disperdere lapellet in 100 - 500 ml di MB.
2. Far scorrere Preparazione
- Preparare una camera di imaging da sandwich due nastri adesivi doppia faccia tra una copertura antiscivolo e un vetrino da microscopio. Per i saggi di chemiotassi, impiegare qualsiasi camera di microfluidica che consente lo scambio di MB e stimolanti chimici.
- Aggiungere 0,01% soluzione di poli-L-lisina nella camera e dopo 5 min risciacquare delicatamente le superfici con MB (80 - 100 l).
- Aggiungere 40 ml di sospensione cellulare nella camera e consentire un tempo sufficiente per il fissaggio alla superficie di vetro (7 - 8 min). Defluire cellule scollate aggiungendo 100 microlitri MB su un lato della camera, mentre traspirante la soluzione con un filtro di carta dal lato opposto.
- Aggiungere 10 - 15 ml di perle di lattice nella camera e consentire le perle tempo sufficiente per risolvere e allegare alle cellule (7-8 min). Lavare delicatamente con 100 ml di MB, come descritto al punto 2.3, per rimuovere scollarsi perline. Utilizzare un intervallo di bead-SIzes per gli esperimenti così a lungo come un buon contrasto è disponibile.
3. Monitoraggio Bead
- Posizionare il campione su un palco microscopio e la scansione della superficie per perline attaccate ai motori. Utilizzare un obiettivo 40X fase per fare osservazioni anche se la microscopia di fase non è necessario. In alternativa, utilizzare l'imaging in campo chiaro fino a quando un sufficiente contrasto è mantenuto per distinguere chiaramente una perlina luminoso su uno sfondo scuro.
- Una volta selezionato un tallone, spostare la fase lateralmente per posizionare il tallone in un angolo predeterminato, come mostrato in Figura 1B. perline posizione alla stessa corner per garantire che il senso di rotazione del tallone è correttamente noto. Il tallone traiettoria ideale è approssimativamente circolare, ma ellittica traiettorie sono ricevibili.
- Mantenere la frequenza di campionamento superiore al doppio della frequenza di rotazione del motore per evitare errori associati aliasing. In questo lavoro, utilizzare un motore che ruotava a50 Hz e il campione a frequenze che erano 10 volte superiore (500 Hz), per ottenere un segnale liscia.
Analisi 4. I dati
- Centro e scalare le tensioni di uscita PMT e corretta ellitticità nelle traiettorie con trasformazioni affini, se necessario 23. Utilizzare l'analisi di potenza spettro per determinare i tassi di rotazione 17.
- Determinare angoli polari, θ (t) = atan (y (t) / x (t)). Determinare le variazioni di velocità del motore e la commutazione nel tempo calcolando ω
14. - Impiegare un filtro mediano per lisciare i dati di velocità del motore. Una finestra di filtro più di due giri completi si raccomanda 23,24.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
La configurazione fotomoltiplicatore è mostrato nella Figura 1A. È importante che i PMT hanno alte sensibilità nel range di lunghezze d'onda sparse dalle perline di interesse. Le PMT impiegati qui operano nelle gamme visibile e vicino infrarosso, e sono stati in grado di rilevare la luce diffusa dalla perle illuminate da una sorgente di luce alogena. Le condizioni di luce ottimali e tensioni di alimentazione variano da una configurazione all'altra. Per la configu...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Al fine di facilitare tethered tallone-tracking e stima corretta del motore coppie, le seguenti informazioni dovrebbe essere rivisto. Quando si eseguono queste misure con cellule flagellate, tosatura è un passaggio fondamentale. Shearing riduce la flagellar filamento ad un semplice stub, garantendo così che il carico sul motore viscosa è prevalentemente dovuta al tallone e può essere stimato entro l'errore 10% 16. Shearing migliora anche la possibilità di trovare le traiettorie circolari con eccentricità ...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Howard Berg per il dono del microscopio/fotomoltiplicatori a tracciamento delle perle e la Texas A&M Engineering Experiment Station per i fondi.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione di poli-L-lisina (0,1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| Microsfere Polybeads | Polysciences, Inc. | 7307 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| 1 mL Luer Slip Tip Siringa | Exel Int. | 26048 | http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php |
| Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23 gauge | Becton, Dickinson and Company | 427565 | http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp |
| Tubo in polietilene | Harvard Apparatus | 59-8325 | http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html |
| fotomoltiplicatore Tubi | Hamamatsu | R7400U-20 | Gamma di risposta spettrale da 300 a 920 nm, lunghezza d'onda di picco 630 nm, tempo di risposta di 0,78 ns http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html |
| 3 fessure di precisione da 1 mm | Edmund Optics | NT39-908 | 2 fessure montate ad angolo retto l'una rispetto all'altra su tubi fotomoltiplicatori |
| Oscilloscopio | Tektronix | TBS 1032B | Sono accettabili marche alternative. Oscilloscopio Digitale, Serie TBS 1000B, 2 Analogici, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope |
| Filtro LP/HP a 8 poli | Krohn-Hite | 3384 | Sono accettabili marche alternative. Si consiglia una gamma di frequenza da 0,1 Hz a 200 kHz. http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf |
| Microscopio Optiphot | Nikon | NA | È possibile utilizzare qualsiasi microscopio a fase verticale o invertita. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754 |
| 50:50 (R:T) Beamsplitter a cubo | ThorLabs | BS013 |
Riferimenti
- Emody, L., Kerenyi, M., Nagy, G. Virulence factors of uropathogenic Echerichia coli. Int J Antimicrob. Ag. 22, 29-33 (2003).
- Lane, M. C., et al. Role of motility in the colonization of uropathogenic Escherichia coli in the urinary tract. Infect Immun. 73 (11), 7644-7656 (2005).
- Kao, C. Y., et al. The complex interplay among bacterial motility and virulence factors in different Escherichia coli infections. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (12), 2157-2162 (2014).
- Berg, H. C. The rotary motor of bacterial flagella. Annu Rev Biochem. 72, 19-54 (2003).
- McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. Flagellar Dynamometer Controls Swarmer Cell Differentiation of V. parahaemolyticus. Cell. 54 (3), 345-351 (1988).
- Lele, P. P., Hosu, B. G., Berg, H. C. Dynamics of mechanosensing in the bacterial flagellar motor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11839-11844 (2013).
- Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Mol Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).
- Belas, R. Biofilms, flagella, and mechanosensing of surfaces by bacteria. Trends Microbiol. 22 (9), 517-527 (2014).
- Silverman, M., Simon, M. Flagellar rotation and the mechanism of bacterial motility. Nature. 249, 73-74 (1974).
- Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C. Adaptation Kinetics in Bacterial Chemotaxis. J Bacteriol. 154 (1), 312-323 (1983).
- Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 8987-8991 (1986).
- Blair, D. F., Berg, H. C. Restoration of torque in defective flagellar motors. Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).
- Ryu, W. S., Berry, R. M., Berg, H. C. Torque-generating units of the flagellar motor of Escherchia coli have a high duty ratio. Nature. 403, 444-447 (2000).
- Yuan, J., Berg, H. C. Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1182-1185 (2008).
- Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. Switching of the bacterial flagellar motor near zero load. J Mol Biol. 390 (3), 394-400 (2009).
- Sowa, Y., Hotta, H., Homma, M., Ishijima, A. Torque-speed Relationship of the Na+-driven Flagellar Motor of Vibrio alginolyticus. J Mol Biol. 327 (5), 1043-1051 (2003).
- Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1260-1265 (2006).
- Meacci, G., Tu, Y. Dynamics of the bacterial flagellar motor with multiple stators. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3746-3751 (2009).
- Lele, P. P., Roland, T., Shrivastava, A., Chen, Y. H., Berg, H. C. The flagellar motor of Caulobacter crescentus generates more torque when a cell swims backwards. Nat Phys. 12 (2), 175-178 (2016).
- Lele, P. P., Shrivastava, A., Roland, T., Berg, H. C. Response thresholds in bacterial chemotaxis. Sci Adv. 1 (9), e1500299(2015).
- Berg, H. C., Turner, L. Torque Generated by the Flagellar Motor of Escherichia coli. Biophys J. 65, 2201-2216 (1993).
- Bai, F., et al. Conformational Spread as a Mechanism for Cooperativity in the Bacterial Flagellar Switch. Science. 327, 685-689 (2010).
- Reid, S. W., et al. The maximum number of torque-generating units in the flagellar motor of Escherichia coli is at least 11. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8066-8071 (2006).
- Chen, X., Berg, H. C. Torque-Speed Relationship of the Flagellar Rotary Motor of Escherichia coli. Biophys J. 78, 1036-1041 (2000).
- Turner, L., Caplan, S. R., Berg, H. C. Temperature-induced switching of the bacterial flagellar motor. Biophys J. 71, 2227-2233 (1996).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
Tag
Tracciamento di sferette tramite fotomoltiplicatoremotilit battericaanalisi della velocit del motorecaratterizzazione della dinamica di commutazionetracciamento del motore in tempo realetecnica di ancoraggio di sferettestudi sul rimodellamento del motorericerca in meccanobiologiabiofisica dei motori molecolari
