La riprogrammazione di cellule condizionale Pediatric umana esofageo epiteliali per l'uso in ingegneria dei tessuti e la malattia Investigation

Summary

L'espansione del pediatrici cellule epiteliali umane esofagee che utilizzano riprogrammazione condizionale fornisce gli investigatori con una popolazione paziente-specifici di cellule che possono essere utilizzati per l'ingegneria costrutti esofagei per l'impianto autologo per il trattamento di difetti o lesioni e di fungere da serbatoio per test di screening terapeutici.

Abstract

Identificare ed espandere le cellule specifiche del paziente in coltura per l'uso nell'ingegneria tissutale e nell'indagine sulle malattie può essere molto impegnativo. L'utilizzo di vari tipi di cellule staminali per derivare tipi di cellule di interesse è spesso costoso, dispendioso in termini di tempo e altamente inefficiente. Inoltre, i tipi di cellule indesiderati devono essere rimossi prima di utilizzare questa fonte di cellule, il che richiede un'altra fase del processo. Al fine di ottenere un numero sufficiente di cellule epiteliali esofagee per ingegnerizzare il lume di un costrutto esofageo o per esaminare approcci terapeutici per il trattamento della malattia esofagea, le cellule epiteliali esofagee native devono essere espanse senza alterare la loro espressione genica o fenotipo. La riprogrammazione condizionale del tessuto epiteliale esofageo offre un approccio promettente all'espansione delle cellule epiteliali esofagee paziente-specifiche. Inoltre, queste cellule non hanno bisogno di essere ordinate o purificate e torneranno a uno stato epiteliale maturo dopo averle rimosse dalla coltura di riprogrammazione condizionale. Questa tecnica è stata descritta in molti studi di screening del cancro e consente l'espansione indefinita di queste cellule su più passaggi. La capacità di eseguire saggi di screening esofageo aiuterebbe a rivoluzionare il trattamento delle malattie esofagee pediatriche come l'esofagite eosinofila, identificando il meccanismo scatenante che causa i sintomi del paziente. Per quei pazienti che soffrono di difetti congeniti, malattie o lesioni dell'esofago, questa fonte cellulare potrebbe essere utilizzata come mezzo per seminare un costrutto sintetico per l'impianto per riparare o sostituire la regione interessata.

Introduction

ingegneria dei tessuti dell'esofago e esofagite eosinofila (EoE) sono stati al centro della ricerca in molti laboratori nel corso dell'ultimo decennio. Difetti congeniti, come atresia esofagea, si osservano in circa 1 su 4000 nati vivi, che si traduce nello sviluppo incompleto dell'esofago porta alla incapacità di mangiare ^1. L'incidenza e la prevalenza di EoE sono in aumento da quando l'identificazione del soggetto malattia nel 1993. L'incidenza di EoE varia 0,7-10 / 100.000 a persona-anno e la prevalenza variava 0,2-43 / 100.000 ^2. Un nuovo approccio chirurgico interessante per il trattamento a....

Protocol

biopsie esofagee sono stati ottenuti dopo il consenso informato è stato ottenuto dai genitori / tutori dei pazienti pediatrici e in conformità con la scheda di revisione istituzionale (IRB # 13-094).

1. sterilizzazione di strumenti e la gelatina Soluzione

1. forcipe autoclave, lame di rasoio e forbici prima di maneggiare il tessuto per evitare la contaminazione.
2. Per 200 ml di soluzione di gelatina 0,1%, unire 200 mL di acqua distillata con 0,2 g di gelatina. Autoclavare e fresco prima dell'uso.

2. Rivestimento Piastre Tissue Culture

1. Circa 2 h prima di isolare cellule, aggiungere abbastanza 0,....

Results

Una sintesi dei passaggi chiave nel isolare cellule epiteliali esofagee da biopsie di pazienti è riassunto nella figura 1. Le colonie di cellule epiteliali formeranno in circa 4-5 giorni e sarà circondato da cellule di alimentazione dei fibroblasti (Figura 2A). Poiché queste colonie si espandono che si fonderanno con altre colonie di formare colonie più grandi (Figura 2b). Una volta che le culture sono diventate confluenti 70%, devono es.......

Discussion

I passi più importanti al fine di isolare ed espandere cellule epiteliali dell'esofago da biopsie di pazienti sono: 1) adeguatamente dissociare biopsia del tessuto con la morte delle cellule minimo; 2) garantire inibitore ROCK viene aggiunto al mezzo di coltura cellulare ad ogni cambio medio; 3) Non utilizzare più cellule di alimentazione di quanto raccomandato; 4) mantenere una cultura asettica pulito; e 5) le cellule di passaggio appena prima di raggiungere confluenza.

A causa delle di.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primocin	InVivogen	ant-pm2
isopentano	Sigma Aldrich	277258-1L
gelatina da pelle suina	Sigma Aldrich	G1890-100G
DMEM	Thermofisher Scientific	11965092
Cryomold	TissueTek	4565
Cryomatrix OCT	Thermofisher Scientific
Provette coniche da 15 mL	Denville Scientific	C1017-p
Siero completo per cheratinociti Senza terreno	Thermofisher Scientific	10724011
Penicillina Streptomicina	Thermofisher Scientific	15140122
Glutamax	Thermofisher Scientific	35050061
Soluzione di insulina	Sigma Aldrich	I9278-5MLPeprotech
		AF-100-15
ROCK Inhibitor (Y-27632)	Fisher Scientific	125410
F-12 Medium	Thermofisher Scientific	11765054
Siero Fetale Bovino	Denville Scientific	FB5001
Dispase	Thermofisher Scientific 17105041
0,05% Tripsina-EDTA	Thermofisher Scientific	25300062
0,25% Tripsina-EDTA	Thermofisher Scientific 25200072
100 mm	Piatti Denville Scientific	T1110-20
Piastre da 150 mm	Denville Scientific	T1115
50 mL Coniche	Denville Scientific	C1062-9
Compresse saline tamponate con fosfato	Fisher Scientific	BP2944-100
Pipette da 5 ml	Fisher Scientific	1367811D
Pipette da 10 ml	Fisher Scientific	1367811E
Pipette da 25 ml	Fisher Scientific	1367811
9" Pipette Pasteur	Fisher Scientific	13-678-20D
Celle NIH 3T3 ATCC		CRL1658