Viene presentata una strategia per generare mutazioni nei geni istonici nella loro posizione endogena in Saccharomyces cerevisiae.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
In questo articolo
Sommario
Abstract
Descriviamo un sistema basato sulla PCR e sulla ricombinazione omologa per generare mutazioni mirate nei geni istonici in cellule di lievito in gemmazione. Gli alleli mutanti risultanti risiedono nei loro siti genomici endogeni e nessuna sequenza di DNA esogena rimane nel genoma dopo la procedura. Poiché nelle cellule di lievito aploidi ciascuna delle quattro proteine istoniche principali è codificata da due geni non allelici con frame di lettura aperti (ORF) altamente omologhi, indirizzare la mutagenesi specificamente a uno dei due geni che codificano una particolare proteina istonica può essere problematico. La strategia che descriviamo qui aggira questo problema utilizzando sequenze all'esterno, piuttosto che all'interno, dell'ORF dei geni bersaglio per la fase di ricombinazione omologa. Un'altra caratteristica di questo sistema è che le regioni del DNA che guidano i passaggi di ricombinazione omologa possono essere rese molto estese, aumentando così la probabilità di eventi di integrazione di successo. Queste caratteristiche rendono questa strategia particolarmente adatta per la mutagenesi genica degli istoni, ma può anche essere adattata per la mutagenesi di altri geni nel genoma del lievito.
Introduzione
I quattro proteine di base dell'istone H2A, H2B, H3, H4 e giocano un ruolo centrale nella compattazione, l'organizzazione e la funzione dei cromosomi eucariotiche. Due insiemi di ciascuna di tali istoni formano la ottamero istoni, un rocchetto molecolare che dirige l'avvolgimento ~ 147 paia di basi del DNA su se stessa, che si traduce nella formazione di un nucleosoma 1. I nucleosomi sono partecipanti attivi in una varietà di processi cromosomiche-based, come ad esempio la regolazione della trascrizione genica e la formazione di eucromatina e heterochromatin tra cromosomi, e come tali sono stati al centro di un'intensa rice....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
NOTA: La strategia sperimentale per mirata in situ mutagenesi gene istone comprende diversi passaggi (riassunti in Figura 1). Questi passaggi includono: (1) Sostituzione del gene bersaglio istone con il gene URA3, (2) Generazione e purificazione dei prodotti di PCR corrispondenti a due frammenti parzialmente sovrapposti del gene istone target usando primers della mutazione desiderata (s), (3 ) fusione PCR dei due frammenti parzialmente sovrapposti per ottenere pieni prodotti dimensione di PCR per l'integrazione, (4) Co-trasformazione dei prodotti di PCR a schermo intero e la spina dorsale plasmide, e la selezione per l'evide....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Descriviamo la generazione di un allele hht2 esprimere un istone H3 mutante proteina ospitare una sostituzione nella posizione 53 da un arginina ad acido glutammico (H3-R53E mutante) come un esempio rappresentativo della mirata strategia situ mutagenesi.
Abbiamo generato un ceppo in cui l'intera ORF di HHT2 è sostituito dal gene URA3 (vedi punto 1 del protocollo). Questo ceppo, .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
L'elevata omologia di sequenza tra due geni non alleliche che codificano ciascuno dei quattro proteine essenziali istoniche delle cellule S. cerevisiae aploidi possa rappresentare sfida per investigatori vogliano indirizzare specificamente uno dei due geni per mutagenesi. In precedenza descritto lievito metodologie di mutagenesi, compreso il Delitto Perfetto, genomica mutagenesi sito-specifica (SSG), e PCR-based metodi pezzi allele-free clonazione 5,
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo Reine Protacio per gli utili commenti durante la preparazione di questo manoscritto. Esprimiamo la nostra gratitudine alla National Science Foundation (sovvenzioni n. 1243680 e 1613754) e all'Hendrix College Odyssey Program per il sostegno finanziario.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1 kb Scala del DNA (standard del DNA) | New England BioLabs | N3232L | |
| Agarosio | Sigma | A5093-100G | |
| Acido borico | Sigma | B0394-500G | |
| Miscela dNTP (10 mM ciascuno) | ThermoFisher Scientific | R0192 | |
| Soluzione EDTA (0,5 M, pH 8,0) | AmericanoBio | AB00502-01000 | |
| Etanolo (200 Proof) | Fisher Scientific | 16-100-824 | |
| Acido etilendiamminotetraacetico sale disodico diidrato (EDTA) | Sigma | E4884-500G | |
| Acetato di litio diidrato | Sigma | L6883-250G | |
| MyCycler Termociclatore | BioRad | 170-9703 | |
| Poli(glicole etilenico) (PEG) | Sigma | P3640-1KG | |
| PrimeSTAR HS DNA POLIMERASI (DNA polimerasi ad alta fedeltà) e 5x tampone | Fisher Scientific | 50-443-960 | |
| Soluzione di DNA di sperma di salmone | ThermoFisher Scientific | 15632-011 | |
| Sigma 7-9 (base Tris, in polvere) | Sigma | T1378-1KG | |
| Acetato di sodio triidrato | Sigma | 236500-500G | |
| Supra Sieve GPG Agarosio (agarosio a bassa temperatura di metling) | AmericanBio | AB00985-00100 | |
| Taq Polimerasi e 10x tampone | New England BioLabs | M0273X | |
| Stuzzicadenti | Fisher Scientific | S67859 | |
| Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | AmericanBio | AB14043-01000 | |
| A-D(+)-Glucosio | Fisher Scientific AC170080025 | per terreni di lievito | |
| Agar | Fisher Scientific | DF0140-01-0 | per terreni di lievito |
| Peptone | Fisher Scientific | DF0118-07-2 | per YPD medio |
| Estratto di lievito | Fisher Scientific | DF0127-17-9 | per YPD medio |
| acido 4-aminobenzoico | Sigma | A9878-100G | per completo minimo dropout medio |
| Adenina | Sigma | A8626-100G | per un mezzo di caduta minimo completo |
| Glicina cloridrato | Sigma | G2879-100G | per un mezzo di caduta minimo completo |
| L-Alanina | Sigma | A7627-100G | per un mezzo di caduta minimo completo |
| L-Arginina monocloridrato | Sigma | A5131-100G | per un mezzo di caduta minimo completo |
| L-asparagina monoidrato | Sigma | A8381-100G | per un mezzo di caduta minimo completo |
| Acido L-aspartico sale sodico monoidrato | Sigma | A6683-100G | per un mezzo di caduta minimo completo. |
| L-cisteina cloridrato monoidrato | Sigma | C7880-100G | per un mezzo di caduta minimo completo |
| Acido L-glutammico cloridrato | Sigma | G2128-100G | per un mezzo di caduta minimo completo |
| L-Glutammina | Sigma | G3126-100G | per un mezzo di caduta minimo completo |
| L-istidina monocloridrato monoidrato | Sigma | H8125-100G | per un mezzo di caduta minimo completo |
| L-Isoleucina | Sigma | I2752-100G | per un mezzo di caduta minimo completo |
| L-Leucina | Sigma | L8000-100G | per un mezzo di caduta minimo completo |
| L-lisina monocloridrato | Sigma | L5626-100G | per un mezzo di caduta minimo completo. |
| L-Metionina | Sigma | M9625-100G | per un mezzo di caduta minimo completo |
| L-Fenilalanina | Sigma | P2126-100G | per un mezzo di caduta minimo completo |
| L-Proline | Sigma | P0380-100G | per un mezzo di caduta minimo completo |
| L-Serine | Sigma S4500-100G | per un mezzo di caduta minimo completo | |
| L-treonina | Sigma | T8625-100G | per un mezzo di caduta minimo completo |
| L-Triptofano | Sigma | T0254-100G | per un mezzo di caduta minimo completo |
| L-Tirosina | Sigma | T3754-100G | per un mezzo di caduta minimo completo |
| L-Valina | Sigma | V0500-100G | per un mezzo di caduta minimo completo |
| myo-Inositol | Sigma | I5125-100G | per un mezzo di caduta minimo completo |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | per un mezzo di caduta minimo completo |
| Solfato di ammonio | Fisher Scientific | A702-500 | per un mezzo di caduta minimo completo |
| Lievito a base di azoto | Fisher Scientific | DF0919-07-3 | per un mezzo di caduta minimo completo |
| Acido 5-fluoroorotico (5-FOA) | AmericanoBio | AB04067-00005 | per 5-FOA terreno |
Riferimenti
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Campos, E. I., Reinberg, D. Histones: annotating chromatin. Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).
- Rand....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
