Intracellulare colorazione e citometria a flusso per l&#39;identificazione dei linfociti sottoinsiemi all&#39;interno murino Aorta, rene e linfonodi in un modello di ipertensione

Fanny Laroumanie; Bethany L. Dale; Mohamed A. Saleh; Meena S. Madhur

doi:10.3791/55266

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Articolo metodologico

Intracellulare colorazione e citometria a flusso per l'identificazione dei linfociti sottoinsiemi all'interno murino Aorta, rene e linfonodi in un modello di ipertensione

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DOI:

10.3791/55266

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28 gennaio 2017

Fanny Laroumanie¹ , Bethany L. Dale² , Mohamed A. Saleh³ , Meena S. Madhur¹

¹Department of Medicine, Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt University Medical Center, ²Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University, ³Department of Pharmacology and Toxicology, Faculty of Pharmacy, Mansoura University

In questo articolo

Sommario

Questo articolo fornisce una metodologia dettagliata per identificare e quantificare i sottoinsiemi dei linfociti T funzionali presenti all'interno dei nodi del rene murino, aorta e linfatici mediante colorazione intracellulare e citometria a flusso. Il modello di angiotensina II ipertensione indotta è stato scelto per spiegare, passo-passo, le procedure ei principi fondamentali della citometria a flusso e colorazione intracellulare.

Abstract

È ormai noto che i linfociti T svolgono un ruolo critico nello sviluppo di diverse malattie cardiovascolari^1,2,3,4,5. Ad esempio, gli studi del nostro gruppo hanno dimostrato che l'ipertensione è associata a un eccessivo accumulo di cellule T nei vasi e nei reni durante lo sviluppo dell'ipertensione sperimentale⁶. Una volta in questi tessuti, le cellule T producono diverse citochine che influenzano sia la funzione vascolare che quella renale, portando a vasocostrizione e ritenzione di sodio e acqua^1,2. Per comprendere appieno come le cellule T causano malattie cardiovascolari e renali, è importante essere in grado di identificare e quantificare i sottogruppi specifici di cellule T presenti in questi tessuti. I sottogruppi di cellule T sono definiti da una combinazione di marcatori di superficie, le citochine che secernono e i fattori di trascrizione che esprimono. La complessità della popolazione di cellule T rende la citometria a flusso e la colorazione intracellulare una tecnica inestimabile per sezionare i fenotipi dei linfociti presenti nei tessuti. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per identificare i marcatori di superficie e intracellulari (citochine e fattori di trascrizione) nelle cellule T isolate da rene murino, aorta e linfonodi drenanti dell'aorta in un modello di ipertensione indotta da angiotensina II. Vengono descritte in dettaglio le seguenti fasi: isolamento dei tessuti, generazione delle sospensioni di singole cellule, stimolazione ex vivo, fissazione, permeabilizzazione e colorazione. Inoltre, vengono discussi diversi principi fondamentali delle analisi citofluorimetriche, tra cui la scelta dei controlli appropriati e le strategie di gating appropriate.

Introduzione

Recenti evidenze dimostra che il sistema immunitario adattativo, in particolare i linfociti T, giocano un ruolo fondamentale nello sviluppo di diverse malattie cardiovascolari ^1,2,3,4,5. Ad esempio, nel modello di angiotensina II ipertensione indotta, un accumulo di cellule T nei vasi e nei reni dei topi è stato descritto ^6. L'accumulo vascolare è prevalentemente nel avventizia e il grasso perivascolare. Nel rene, cellule T accumulano sia midollo e corteccia renale. A seconda di quale sottoinsieme è coinvolto, queste cellule T danno luogo a diverse citochine che possono influenzare la funzione vascolare e renale e portare allo sviluppo della....