Genome Editing e di differenziazione Regia di hPSCs per interrogare determinanti Lineage in Sviluppo Umano del pancreas

Summary

Protocolli per generare linee mutanti HPSC che utilizzano la piattaforma iCRISPR e di differenziare hPSCs in cellule beta-come il glucosio-reattiva sono descritti. La combinazione di tecnologia di editing genoma con differenziazione HPSC-diretto fornisce una piattaforma potente per l'analisi sistematica del ruolo dei determinanti lignaggio nello sviluppo umano e la progressione della malattia.

Abstract

Interrogazione funzione del gene in auto-rinnovamento o differenziazione delle cellule staminali umane pluripotenti (hPSCs) offre una valida piattaforma per comprendere lo sviluppo umano e la dissezione dei meccanismi della malattia in un piatto. Per sfruttare al meglio questo potenziale applicazione richiede strumenti di genoma-editing efficiente per generare mutanti HPSC nei geni associati alla malattia, così come in vitro protocolli di differenziazione HPSC per la produzione di tipi di cellule malattie rilevante che ricapitolano da vicino le loro controparti in vivo. Una piattaforma genoma-editing efficiente per hPSCs chiamato iCRISPR è stata sviluppata attraverso targeting TALEN-mediata di una cassetta di espressione Cas9 nel locus AAVS1. Qui, i protocolli per la generazione di linee inducibili Cas9 HPSC utilizzando cellule coltivate in un mezzo chimicamente definito e una condizione priva di alimentazione sono descritti. Le procedure dettagliate per l'utilizzo del sistema di iCRISPR per knockout gene o precise alterazioni genetiche in hPSCs, sia attraverso non-omologa end che unisce (NHEJ) o tramite precise alterazioni nucleotidiche utilizzando un modello di riparazione di omologia-diretto (HDR), rispettivamente, sono inclusi. Questi procedimenti tecnici sono descrizioni di progettazione, produzione, e trasfezione di RNA guida CRISPR (gRNAs); la misurazione del tasso di mutazione CRISPR mediante saggi T7E1 o RFLP; e la creazione e la validazione delle linee mutanti clonali. Infine, le procedure di cronaca per la differenziazione HPSC in cellule beta-pancreatiche come glucosio-reattiva imitando in vivo sviluppo embrionale del pancreas. Combinando la tecnologia iCRISPR con differenziazione HPSC diretto permette l'esame sistematico della funzione del gene per migliorare la nostra comprensione dei meccanismi di sviluppo e di malattia diabete pancreatico.

Introduction

Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) hanno la capacità di entrambi di auto-rinnovarsi e dare origine a tutti i derivati ​​delle tre linee germinali embrionali. Essi forniscono una risorsa preziosa per la terapia di sostituzione cellulare e modellazione malattia servendo come una piattaforma unica di ricapitolare processi cellulari in un contesto di sviluppo umano. Sono anche una fonte di cellule sperimentali per scalabili, analisi high-throughput. Tuttavia, il progresso è stato limitato a causa di due sfide principali: la mancanza di strumenti di modifica genetica efficienti e la difficoltà di ricapitolare le complesse fasi di sviluppo embrionale in un piatto di cultura.

La modificazione genetica è uno strumento indispensabile per studiare la funzione del gene nello sviluppo normale e la malattia. Tuttavia, mentre genica classica mira approcci tramite ricombinazione omologa hanno dimostrato di essere un potente strumento per analizzare la funzione del gene in topo cellule staminali embrionali (mESCs) ^1, questo approccioè stato estremamente inefficiente quando applicato hPSCs ^{2, 3.} La recente adesione vivace di programmabili, nucleasi site-specific dalla natura a uso di laboratorio, tra cui nucleasi dita di zinco (ZFNs), trascrizione attivatore come nucleasi effettrici (Talens) ei cluster regolarmente intervallati brevi ripetizioni palindromi (CRISPR) / CRISPR associata (CAS) sistemi ^4, significa che l'ingegneria del genoma è diventato un compito molto più facile in una vasta gamma di organismi e linee cellulari, tra cui in hPSCs. Questi strumenti di editing gene approfittare del fatto che nucleasi chimerici come l'endonucleasi Cas9 possono permettere tutta una serie di modificazioni genetiche inducendo rotture del doppio filamento (DSB) in punti precisi, innescando il meccanismo di riparazione del DNA endogeno per attivare o non omologa terminare l'adesione (NHEJ) o riparare omologia-diretto (HDR). Entrambi i meccanismi possono essere sfruttate per la manipolazione genetica inducendo either l'inserimento casuale e mutazioni per delezione (indels; via NHEJ), per creare frameshift mutazioni che annullano gli alleli del gene, o sostituzioni nucleotidiche precisi (via HDR), di ricapitolare le mutazioni del paziente per la modellazione malattia umana o per correggere una mutazione che causa la malattia per la terapia genica .

CRISPR / ingegneria del genoma Cas-mediata richiede due componenti: la costante di RNA-guida Cas9 endonucleasi necessaria per scissione del DNA e RNA variabile CRISPR (crRNA) e duplex trans-attivazione (tracrRNA) che specifica il riconoscimento DNA bersaglio. Il duplex crRNA / tracrRNA può essere sostituito con un unico chimerico guida RNA (gRNA), che sono stati trovati a lavorare in modo più efficiente ^{5, 6, 7.} Mentre il sistema / Cas9 CRISPR è stato adattato per gli organismi più sperimentali e linee cellulari, la consegna e l'espressione di Cas9 e gRNA varia in modo significativo e deve essere ulteriormente ottimizzato per achivigilia editing efficiente genoma in molti sistemi, tra cui hPSCs ^8. Una piattaforma efficiente genoma-editing, iCRISPR, è stata stabilita in hPSCs ^5. In questo sistema, un approccio TALEN-mediata è stato usato per indirizzare entrambi gli alleli del AAVS1 "transgene porto sicuro locus" in trans, un allele con transattivatore inverso tetraciclina controllata (M2rtTA) e l'altra con un elemento di risposta tetraciclina (TRE ) che guida l'espressione di Cas9 (iCas9) nei hPSCs. Nelle linee clonali stabiliti (iCas9 hPSCs), Cas9 è altamente espresso con il trattamento doxiciclina. Nel frattempo, grazie alle sue dimensioni ridotte (100 nt), gRNAs singoli o multipli possono essere facilmente trasportati in iCas9 hPSCs con alta efficienza e possono dirigere Cas9 per la scissione site-specific, consentendo efficiente interruzione gene NHEJ mediata, così come HDR-mediata precise modifiche nucleotide in presenza di brevi modelli di donatori di DNA a singolo filamento (ssDNA). Il sistema può essere iCRISPRutilizzato per generare con successo un pannello di linee HPSC malattia mimando con biallelica (omozigote o eterozigote composto) o eterozigoti mutazioni perdita-di-funzione in importanti geni dello sviluppo ^{5, 9.} Mentre un certo numero di gruppi hanno segnalato l'editing gene efficiente utilizzando CRISPR / Cas in hPSCs, il successo rimane limitata a un piccolo numero di laboratori tecnologicamente abili. La piattaforma iCRISPR offre una soluzione efficace e semplice per l'editing gene di routine da ricercatori di differenti livelli di abilità, ed è già stato utilizzato in una serie di studi pubblicati dal nostro gruppo e altri ^{9, 10, 11, 12.} Questo approccio è stato ulteriormente esteso a tacere inducibile basata sull'espressione di dCas9-KRAB ^13.

Insieme con il progresso nel genoma di modifica technologia, miglioramenti significativi sono stati raggiunti anche in HPSC manutenzione e la differenziazione diretto. Condizioni di coltura per hPSCs si sono evoluti da condizioni medie del mouse irradiato fibroblasti embrionali (IMEF) alimentatore-dipendenti a condizioni di libero-feeder sui componenti della matrice extracellulare definiti, e dalle formulazioni multimediali complessi di costituzione chimica definita ^14. Tali miglioramenti hanno ridotto la variabilità in hPSCs a causa di differenze da lotto a lotto di componenti di ricambio Imef preparazione e siero eliminazione diretta, e quindi fornire un ambiente più riproducibile per la differenziazione HPSC. Nel frattempo, una migliore conoscenza delle vie di segnalazione che regolano lo sviluppo embrionale umano, così come le scoperte di high-throughput screening di droga, hanno portato ad un miglioramento dei protocolli di differenziazione ^{15, 16, 17, 18.} Questi protocolli più strettamente imitano in vivo fasi di sviluppo e generare tipi di cellule che ricapitolano da vicino le loro controparti in vivo. Per HPSC differenziazione in lignaggio del pancreas, i protocolli iniziali imitato primi anni di sviluppo del pancreas relativamente bene, ma alla fine generato cellule beta polyhormonal che erano di fenotipi fetali immaturi e hanno risposto male alla stimolazione di glucosio. Recenti progressi ^{16, 17, 19, 20} hanno permesso per la generazione di cellule beta pancreatiche come glucosio-reattiva, che ci consentiranno di investigare eventi successivi, come la formazione e l'ulteriore maturazione delle cellule beta monohormonal.

Qui, abbiamo dettaglio l'applicazione delle linee genoma modificato per lo studio dello sviluppo del pancreas, combinando il sistema iCRISPR con la piattaforma HPSC basata in vitro la differenziazione verso pancr glucosio-reattivacellule beta-like eatic. Questo accoppiamento di potenti strumenti di editing del genoma con un miglioramento del protocollo di differenziazione HPSC non solo offre la velocità e la scala necessarie a soddisfare la crescente domanda per la convalida malattia causalità, ma consente anche di sofisticate manipolazioni genetiche per ulteriori indagini meccanicistici in controllo trascrizionale alla base dello sviluppo normale e la malattia ⁹ .

Protocol

Questo protocollo si basa sul nostro lavoro con le linee HPSC H1, HUES8, e Mel-1 nella condizione chimica definita e senza alimentatore (Si prega di vedere il materiale e attrezzature Tabella). Per le altre linee HPSC o hPSCs mantenute in differenti condizioni di coltura, si raccomanda un'ulteriore ottimizzazione.

1. HPSC Cultura nella Condizione chimica definita e senza alimentatore

1. Adattare la cultura HPSC su alimentatori Imef alla condizione senza alimentatore. Nei casi in cui le cellule congelate non sopravvivono bene quando recuperati direttamente in condizione senza alimentatore, recuperare le cellule in condizioni Imef prima e poi adattarsi alla condizione di senza alimentatore.
   NOTA: In generale, ci vogliono 2 passaggi per hPSCs coltivati ​​su alimentatori Imef essere adattata alla condizione senza alimentatore.
2. Cambiare la media ogni giorno e il passaggio dei hPSCs quando le cellule hanno raggiunto ~ 80% di confluenza. In generale, hPSCs passaggio a ~ 1: 6 - 1:15 rapporti ogni 4 - 6 giorni. Aggiungere 10 micron inibitore ROCK Y-27632 whit scongelamento o passaging le cellule.
3. Prima semina i hPSCs, piastre di coltura pre-coat con 5 mg / ml (1 ml / 10 cm ²⁾ troncato forma umana ricombinante di vitronectina (VTN) per almeno 1 ora a temperatura ambiente (RT). Inoltre, preparare completa terreno chimicamente definito aggiungendo integratore nel mezzo basale.
4. Rimuovere il terreno di coltura, lavare le cellule una volta con PBS senza Ca ^{2 +} e Mg ^2+, e trattare le cellule con 0,5 mM EDTA per ~ 2 - 5 min a RT.
5. Aspirare il EDTA prima che le colonie sono distaccato. Con delicato pipettaggio, disperdere le colonie HPSC in piccoli pezzi e risospendere le cellule in terreno completo.
6. Raccogliere le hPSCs dissociate e centrifugare le cellule a 200 xg per 5 min. Risospendere le hPSCs pellet nel mezzo completo e seminare le cellule su piastre VTN-rivestite.

2. Generazione di iCas9 HPSC Lines

1. Ordine e amplificare i seguenti plasmidi: AAVS1-TALEN-L, AAVS1-TAlen-R, AAVS1-Neo-M2rtTA e AAVS1-Puro-iCas9.
   NOTA: per evitare eventi di ricombinazione imprevisti, usare le cellule competenti Stbl3 ricombinazione-deficienti per la trasformazione e l'amplificazione dei plasmidi a 30 ° C.
2. In genere, la redazione del hPSCs in uno di 10 cm piatto (~ 1 x 10 ⁷ cellule se ~ 80% confluenti) per un esperimento di targeting.
   NOTA: Dal momento che l'elettroporazione di solito provoca significative morte cellulare e genica mediata TALEN targeting nel locus AAVS1 richiede la selezione antibiotica, un numero relativamente elevato di cellule hanno bisogno di essere testa di serie per identificare le cellule correttamente mirati. Ottimizzazione per le concentrazioni di farmaco è consigliato per ciascuna linea cellulare e ogni condizione di cultura.
3. Il giorno -1, (il giorno prima elettroporazione), aggiungere inibitore ROCK 10 micron durante il cambio dei media.
4. Il giorno 0, (il giorno di elettroporazione), preparare piatti VTN rivestite in anticipo.
5. Dissociare il hPSCs in singole cellule USIng 1x reagente di dissociazione (si prega di vedere il materiale e attrezzature Tabella). Brevemente, rimuovere il terreno di coltura, lavare le cellule una volta con PBS senza Ca ^{2 +} e Mg ^2+, e trattare le cellule con il reagente di dissociazione 1x a 37 ° C per ~ 3 min. Aspirare il reagente di dissociazione prima che le cellule hanno staccato. Con delicato pipettaggio, disperdere i hPSCs in una cella singola sospensione di 10,5 ml di terreno completo.
6. Prendere 0,5 ml di sospensione cellulare per contare il numero di cellule utilizzando un contatore di cellule automatizzato. Agglomerare le hPSCs a 200 xg per 5 min e risospendere le cellule in freddo (4 ° C) PBS a 12.5 x 10 ⁶ cellule / ml.
7. Aggiungere i plasmidi (vedi Tabella 1) in 800 ml HPSC sospensione (12,5 x 10 ⁶ cellule / ml) e mescolare bene. Trasferire il composto di un 0,4 cm elettroporazione cuvetta e tenere in ghiaccio per ~ 5 min.
8. L'elettroporazione di cellule utilizzando un sistema di elettroporazione a 250 V e 500 ìF il tempo OB costanteerved dopo l'elettroporazione è tipicamente 9 - 13 ms.
9. Dopo l'elettroporazione, trasferire le cellule in una provetta conica da 15 ml con 5 ml di terreno completo pre-riscaldato. Critico per il targeting di successo: Utilizzare hPSCs proliferanti sano e gestire le cellule molto delicatamente durante il trasferimento, risospensione e placcatura le cellule dopo l'elettroporazione.
10. Agglomerare le cellule a 200 xg per 5 min. Risospendere le cellule in 10 ml di mezzo completo con inibitore ROCK 10 pM e la piastra 1, 2,5, e 5 x 10 ⁶ cellule su ciascuno dei piatti tre VTN-rivestito, 10 cm; Questo assicura che almeno una delle piastre avranno colonie sufficienti a cella singola densità clonale per colonia raccolta.
11. Il giorno 1 (il giorno dopo l'elettroporazione), cambiare il medium.
12. Nei giorni 2-5, avviare la selezione neomicina quando le cellule sono ~ 60% confluenti. Cambiare la media giornaliera di 500 mg / ml G418 solfato; significativa la morte cellulare a causa di Selection è tipicamente osservata 2 giorni dopo la selezione G418.
13. Il giorno 6, cambiare il supporto senza selezione antibiotica.
14. Nei giorni 7-9, avviare la selezione puromicina. Cambiare la media giornaliera con 1 mg / ml puromicina dicloridrato; morte cellulare significativo deve essere osservato il giorno successivo.
15. Il giorno 10, iniziare a cambiare il medium quotidiana senza selezione antibiotica fino a quando le colonie monocellulari HPSC raggiungono 1 - 2 mm di diametro.
    NOTA: in genere, 50 colonie in un piatto di 10 cm sono osservate con 2,5 x 10 ⁶ hPSCs placcato il giorno 0.
16. Scegli 12 - 24 colonie sotto uno stereomicroscopio. Meccanicamente disaggregare le colonie HPSC in piccoli pezzi (~ 10 pezzi per colonia) utilizzando un ago 23-G (una punta di pipetta da 200 ml è anche bene) e trasferire le cellule direttamente nel VTN rivestite piastre da 24 pozzetti.
17. Cambiare la media giornaliera fino a quando le cellule diventano confluenti. Passaggio le cellule in ciascun pozzetto di piastre da 24 pozzetti inpozzetti duplicati di 6 pozzetti.
18. Quando le cellule diventano confluenti nelle 6 pozzetti, utilizzare uno bene per uno stock congelato e l'altro pure per l'estrazione del DNA genomico per un'ulteriore caratterizzazione.
19. Caratterizzare e validare le linee iCas9 stabiliti mediante PCR genotipizzazione, Southern blotting, RT-qPCR, cariotipo, e il dosaggio pluripotenza. Fare riferimento a Zhu et al. ²¹ per le procedure sperimentali dettagliate.

3. Generazione di HPSC Mutant Lines Utilizzo del sistema iCRISPR

1. Generazione di linee knockout HPSC
   1. progettazione e produzione gRNA
      1. Scegli regioni obiettivo nel gene di interesse per massimizzare la possibilità di interrompere la funzione della proteina wild-type. Per i geni ben annotati-, scegliere una regione bersaglio monte di un dominio funzionale essenziale. In alternativa, gRNAs progettazione di indirizzare una regione a valle del codone di inizio. Scegli almeno 2 diversiRegioni per un gene di interesse.
      2. gRNAs progettazione utilizzando lo strumento di progettazione CRISPR online (http://crispr.mit.edu). Per ogni regione di destinazione, di progettazione 3 gRNAs con un basso potenziale off-obiettivi e utilizzare quello con la più alta efficienza per la generazione di mira clonale linea mutante ^22.
         NOTA: Al fine di raggiungere l'efficienza editing alta genoma, si raccomanda di fornire gRNA come oligonucleotidi RNA anziché come plasmide DNA a causa della maggiore efficienza di trasfezione di piccoli RNA rispetto ai plasmidi di esperienza passata.
      3. Order 120 nucleotidi (nt) oligos DNA contenenti la sequenza del promotore T7, la variabile sequenza di riconoscimento 20-nt crRNA (N) ₂₀ (non comprendono la sequenza PAM), e la costante sequenza di guida chimerico. Diluire gli oligonucleotidi a 100 micron soluzione madre in DDH ₂ O e preparare 250 nm come soluzione di lavoro.
         NOTA: TAATACGACTCACTATAGGG (N) ₂₀ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT
      4. PCR-amplificare i oligos utilizzando i primer T7F e TracrR (vedi tabella 2) per produrre il modello a doppio filamento del DNA (dsDNA) per gRNA vitro trascrizione in (IVT). Usare 50 ml di miscela di reazione PCR (vedi tabella 3) e le condizioni del ciclo di PCR (vedi tabella 4).
      5. Utilizzare un kit T7 trascrizione ad alto rendimento per la trascrizione in vitro gRNA con il modello PCR-amplificato in 20 microlitri, in vitro gRNA trascrizione mix (vedi tabella 5) secondo le istruzioni del produttore. Purificare i prodotti gRNA utilizzando il kit di trascrizione clean-up secondo le istruzioni del produttore.
      6. Eluire gRNAs seguendo il protocollo di purificazione high-throughput secondo le istruzioni del produttore (in genere ~ 50 - 100 mcg) in 100 ml di tampone di eluizione. Regolare la concentrazione a 320 ng / ml (10 micron), quando possibile e conservare a -80 &# 176; C fino al momento dell'uso.
   2. PCR e Sanger progettazione sequenziamento Primer
      1. Progettare e validare primer PCR che amplificano la regione di destinazione, con dimensioni che vanno da prodotti tipicamente ~ 500 - 1.000 bp.
      2. Progettazione Sanger primer di sequenziamento vincolanti internamente per i prodotti di PCR per consentire sequenziamento diretto dei prodotti di PCR senza purificazione.
   3. gRNA trasfezione in iCas9 hPSCs
      1. Il giorno -1, il trattamento di cellule iCas9 con 2 mg / ml doxiciclina 24 ore prima gRNA trasfezione.
      2. Il giorno 0 di gRNA trasfezione, preparare piatti VTN rivestite in anticipo.
      3. Separa celle iCas9 in singole cellule utilizzando 1x reagente di dissociazione, come descritto al punto 2.5.
      4. Agglomerare le hPSCs a 200 xg per 5 min e risospendere le cellule a ~ 0,5 x 10 ⁶ cellule / ml in terreno completo addizionato con 2 mg / ml doxiciclina e inibitore ROCK 10 pM.
      5. Piatto 0,5 ml di cellule risospese in singoli pozzetti di piastre da 24 pozzetti. Preparare pozzi addizionali per servire controlli non transfettate.
      6. Per ogni gRNA, effettuare le seguenti miscele di trasfezione: Mix A, 50 ml di riduzione media di siero + 1 ml di gRNA (10 micron); Mix B, 50 ml di riduzione media di siero + 3 ml di reagente di trasfezione.
      7. Combinare Mix A e B per fare 100 microlitri miscela. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 50 ml di miscela di cellule nei pozzetti duplicati delle piastre da 24 pozzetti e mescolare bene.
      8. Il giorno 1, effettuare una seconda trasfezione se necessario, per aumentare ulteriormente l'efficienza di targeting. In caso contrario, cambiare il mezzo senza doxiciclina.
      9. Nei giorni 2 - 3, cambiare il supporto quotidiano.
      10. Il giorno 4, estrarre il DNA genomico da un pozzetto di ogni cella di controllo trasfettate e non transfettate utilizzando un kit di estrazione del DNA. Regolare la concentrazione di 50 ng / μL.
      11. PCR-amplificare le regioni obiettivo fiancheggianti le sequenze di targeting gRNA e stimare l'efficienza di modifica utilizzando T7 endonucleasi I digestione (T7EI) o il dosaggio della lunghezza dei frammenti di restrizione polimorfismo (RFLP), come descritto in precedenza ^5.
   4. saggio T7EI
      1. PCR-amplificare la regione di destinazione utilizzando i primer disegnati e validati nella fase 3.1.
      2. Preparare le miscele (vedi Tabella 6) ed eseguire denaturazione del DNA e l'ibridazione dei prodotti di PCR utilizzando condizioni indicate nella tabella 7.
         NOTA: In base alla nostra esperienza, non è generalmente necessario per purificare i prodotti di PCR per il saggio T7EI quando si utilizza la nostra condizione PCR. Tuttavia, la purificazione potrebbe essere utile in altre condizioni.
      3. Eseguire digestione T7EI a 37 ° C per 30 min con 10 ml di denaturato e ibridato prodotto di PCR e 0,2 ml (2 U) di T7E1 (10 U / mL).
      4. resolvall'e i campioni di PCR T7E1-digeriti mediante elettroforesi su gel. Utilizzare ImageJ per determinare le intensità relative banda di taglio e DNA uncut. Calcolare la frequenza indel utilizzando la formula: (1 - (√ (1- (b + c)) / (a + b + c))) x 100, dove a è l'intensità del prodotto digerito PCR e B e C sono le intensità dei prodotti T7E1-spaccati.
   5. saggio RFLP
      NOTA: Nel caso in cui un sito di restrizione è nelle immediate vicinanze (<5 bp) per un sito di taglio Cas9 (3 bp 5 'della sequenza PAM), un saggio RFLP può essere effettuata per quantificare la frequenza indel.
      1. Utilizzare gli stessi prodotti di PCR come descritto al punto 3.1.4.1.
      2. Digerire il prodotto di PCR con un enzima di restrizione che contiene un sito di restrizione in prossimità del sito di clivaggio Cas9.
      3. Risolvere i campioni di PCR digeriti mediante elettroforesi su gel. Utilizzare ImageJ per determinare le intensità relative banda di taglio e DNA uncut. Calcolare il indelfrequenza mediante la formula: a / (a + b + c) x 100, dove a è l'intensità del prodotto digerito PCR e B e C sono le intensità dei prodotti digeriti.
   6. Istituzione di linee mutanti clonali
      NOTA: la modifica del genoma in hPSCs utilizzando il sistema iCRISPR con gRNA trasfezione è altamente efficiente, e non è necessaria alcuna selezione antibiotica. Per stabilire linee clonali, è necessario seminare cellule ad una densità relativamente bassa per assicurare la formazione di colonie singola cellula-derivati.
      1. Identificare gRNAs con la più alta efficienza di modifica (utilizzando il T7EI o saggio RFLP) e con una buona sopravvivenza delle cellule. Utilizzare il relativo duplicato bene per clonale stabilimento linea mutante.
      2. Dissociare il hPSCs in una cella singola sospensione utilizzando 1x reagente di dissociazione, come descritto al punto 2.5. Replate 500, 1.000, 2.000 e cellule su ciascuno dei piatti a tre VTN-rivestito, 10 cm.
      3. Modificare l'u medio giornalieroino il unicellulare colonie raggiungono ~ 2 mm di diametro.
      4. Raccogliere 24 - 48 colonie per ogni gRNA, a seconda stima di puntare efficienza dal T7EI e / o dosaggio RFLP. Meccanicamente disaggregare ogni colonia in piccoli pezzi (~ 10 pezzi per colonia) utilizzando un ago 23-G (una punta di pipetta da 200 ml è anche bene) e replate le cellule in duplicato VTN rivestite, 96 pozzetti. Utilizzare una piastra per l'estrazione del DNA genomico e Sanger sequenziamento e l'altra piastra per un'ulteriore espansione.
      5. Quando le cellule in piastre a 96 pozzetti sono diventate confluenti, estrarre il DNA genomico (senza estrazione con fenolo / cloroformio) utilizzando un protocollo semplice, come illustrato di seguito.
      6. Rimuovere il supporto e lavare le cellule una volta con PBS senza Ca ²⁺ e Mg ^2+. Aggiungere 50 ml di tampone di lisi (5 ml di proteinasi K (10 mg / ml), 5 ml di tampone PCR 10x, e 40 ml di DDH ₂ O) per ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti. Sigillare la piastra con una pellicola adesiva e incubate una notte a 55 ° C.
      7. Il giorno successivo, trasferire i lisati cellulari in un 96-pozzetti PCR e incubare per 10 minuti a 99 ° C in un termociclatore per inattivare il proteinasi K.
      8. PCR-amplificare la regione di destinazione utilizzando gli stessi primer come per il T7EI o saggio RFLP, utilizzando 1 ml di lisato cellulare come modello.
      9. Usare 1 ml di prodotto di PCR per il sequenziamento Sanger con un primer vincolante internamente al prodotto di PCR.
      10. Amplificare i cloni con mutazioni frameshift INDEL per scorte congelate. Inoltre, amplificare un paio di wild-type cloni dallo stesso esperimento di targeting per servire linee di controllo come isogenic per ulteriori esperimenti.
2. Generazione di linee mutanti con precise alterazioni nucleotidiche
   NOTA: Rispetto ai mutanti knockout generate da non omologhe fine di entrare (NHEJ), precisa nucleotide alterazione può essere raggiunto attraverso l'omologia-diretto di riparazione (HDR) in presenza di DNA repair modelli. Tali precise alterazioni nucleotidiche permettono la generazione di mutazioni specifiche del paziente in wild-type hPSCs e per la correzione di mutazioni nel iPSCs derivati ​​da pazienti.
   1. Progettazione di ssDNA come un modello HDR
      1. Progettare e produrre 2 - 3 gRNAs in prossimità di una mutazione specifica per il paziente, come descritto al punto 3.1.1.
      2. Progettare un DNA a singolo filamento (ssDNA) contenente la mutazione specifica per paziente affiancato da ~ 40 - 80 nt di omologia su ogni lato come un modello HDR.
      3. Per ridurre il taglio aggiuntivo dopo la riparazione corretta, introdurre una mutazione silente al modello ssDNA nella regione all'interno della sequenza di riconoscimento gRNA e in prossimità alla sequenza PAM o nella sequenza PAM stesso, se possibile.
      4. Se possibile, progettare la mutazione silente di introdurre un nuovo sito di restrizione digestione così in modo che possa essere utilizzato per stimare l'efficienza riparazione utilizzando il saggio RFLP.
   2. GRNA / ssDNA co-trasfezione e la creazione di linee clonali
      1. Eseguire la co-trasfezione di gRNA / ssDNA in cellule iCas9, come descritto nel passaggio 3.1.3, con miscele di trasfezione A e B. Per ogni gRNA e controllo non transfettate, trasfezione delle cellule in pozzetti duplicati di piastre da 24 pozzetti. Mix A: 50 ml di riduzione media di siero + 1 ml di gRNA (10 micron) + 2 ml di ssDNA (10 micron). Mix B: 50 ml di riduzione media di siero + 3 ml di reagente di trasfezione.
      2. Dopo la trasfezione, estrarre il DNA genomico da un pozzetto di ogni cella di controllo trasfettate e non trasfettate e stimare l'efficienza riparazione utilizzando il T7EI e / o dosaggio RFLP.
      3. Identificare la miscela gRNA / ssDNA con la massima efficienza di riparazione e di buona sopravvivenza delle cellule. Utilizzare il relativo duplicato bene per clonale stabilimento linea mutante.
      4. Raccogliere 48 - 96 colonie, secondo la stima dell'efficienza di targeting dal T7EI e / o RFLP assAy. In generale, l'efficienza della mutazione HDR-mediata è inferiore knockout mutazione e quindi più colonie devono essere prelevati.
      5. Sequenza, espandere, e convalidare le linee clonali, come descritto al punto 3.1.6.

4. In Vitro HPSC differenziazione in cellule beta pancreatiche glucosio-reattiva

NOTA: In vitro la differenziazione dei mutanti HPSC in tipi di cellule malattie rilevanti fornisce una piattaforma per la modellazione della malattia in un piatto. Il protocollo che segue si concentra sulla differenziazione in vitro di hPSCs in cellule pancreatiche beta glucosio-responsive per studi di sviluppo e diabetici pancreatici ^{9, 16, 17.}

1. HPSC differenziazione in endoderma definitivo
   1. Mantenere mutanti HPSC e linee di controllo wild-type nella condizione chimica definita e alimentatore-Free, come descrittod al punto 1.
   2. Per preparare i hPSCs per la differenziazione, dissociare i hPSCs utilizzando 1x reagente di dissociazione e li disperdono in cella singola sospensione in terreno completo.
   3. Agglomerare le cellule a 200 xg per 5 min e risospendere le cellule in terreno completo con inibitore ROCK 10 pM. Contare il numero di cellulare e seminare le cellule a ~ 1.4 x 10 ⁵ cellule / cm ² su lastre VTN-rivestite.
   4. Modificare il medium 24 ore dopo la semina.
   5. Il giorno 0, avviare la differenziazione dopo 48 ore, quando le cellule hanno raggiunto ~ 80% di confluenza.
      NOTA: per ottenere un'elevata efficienza di differenziazione del pancreas, ottimizzando la densità di semina e il livello di confluenza in 48 ore è consigliato per ogni singola linea.
   6. Aspirare il mezzo di HPSC e lavare le cellule una volta con PBS senza Ca ²⁺ e Mg ^2+.
   7. Cambiare il supporto alla differenziazione giorno 0 (D0) di media.
   8. Nei giorni 1 - 2, cambiare il differentiation media giornaliera, secondo le ricette in tabella 8.
   9. Il giorno 3, esaminare i marcatori endoderma definitivo Sox17, Foxa2 e CXCR4 di colorazione immunofluorescenza e citometria a flusso di analisi.
2. Differenziazione endoderma definitivo in progenitore del pancreas
   1. Nei giorni 3 - 9, continua differenziazione endoderma definitivo verso il lineage pancreatica cambiando il mezzo giornaliera, secondo le ricette in Tabella 9.
   2. Il 7 Giorno, esaminare agli inizi del progenitore del pancreas (PP1) marcatore PDX1 mediante colorazione immunofluorescenza e citometria a flusso di analisi.
   3. Il giorno 10, esaminare il seguito progenitore del pancreas (PP2) marcatori PDX1 e NKX6.1. Nel frattempo, preparare per trasferire le cellule PP2 all'interfaccia aria-liquido per un'ulteriore differenziazione in cellule endocrine del pancreas.
3. Endocrino del pancreas differisconoziazione nell'interfaccia aria-liquido
   1. Trattare le cellule PP2 con inibitore ROCK 10 micron 4 ore prima di dissociazione.
   2. Rimuovere il supporto e lavare le cellule una volta con PBS senza Ca ²⁺ e Mg ^2+.
   3. Aggiungere 2 ml di reagente di dissociazione 1x alle cellule PP2 in una 10-cm piatto e incubare a 37 ° C per 2 - 3 min.
   4. Aspirare il reagente di dissociazione prima che le cellule hanno staccato. Aggiungere 10 ml di media Blar e disperdere le cellule PP2 in singole cellule pipettando gentilmente su e giù.
   5. Raccogliere la cella singola sospensione. Contare il numero di cellule e pellet a 200 xg per 5 min.
   6. Risospendere il pellet di cellule a ~ 0,5 x 10 ⁵ cellule / ml di media differenziazione in S5 e spot 5 - 10 ml di cellule per posto su un filtro inserto transwell. Mettere 10 - 15 punti in un 6-ben inserire e ~ 100 punti in 10 cm inserto.
   7. Aggiungere mezzo S5 al fondo di ogni inserto transwell, ~ 1,5 mL per inserti 6 pozzetti e ~ 8 mL fo inserti 10 cm.
   8. Cambiare la media giornaliera con le ricette di cui alla tabella 10.
   9. Esaminare pancreas endocrino marcatori PDX1, NKX6.1 NEUROD1, NKX2.2, insulina, glucagone e il giorno 34 dalla colorazione di immunofluorescenza e citometria a flusso di analisi ^17.
   10. Esaminare HPSC di derivazione funzione delle cellule β-like, con tenore di glucosio-stimolata la secrezione di insulina (GSIS) ^{16, 17.}

Results

HPSC chimica definita e senza alimentatore Cultura adattamento e manutenzione

hPSCs coltivate su alimentatori Imef possono essere rapidamente adattati alle piastre VTN rivestite in condizione di cultura libera-alimentatore. Lo stesso rapporto scissione come normale cultura alimentatore Imef può essere utilizzato durante l'adattamento. La figura 1A mostra morfologie tipiche di hPSCs su alimentatori Imef a medio KSR-based e su una superficie VTN rivestita in mezzo privo di alimentatore. La figura 1B mostra una variazione morfologica tipica e la crescita di colonie HPSC durante il primo passaggio di adattamento (4 giorni). Le cellule possono essere ulteriormente diversi passaggi o congelati per esperimenti futuri. Effettuare 2 - 3 passaggi della cultura adattamento prima di iniziare gli esperimenti di differenziazione. Karyotyping è consigliato anche dopo l'adattamento, anche se non abbiamo osservato anomalie del cariotipo durante la fase di adattamento.

"Fo: together.within-page keep-=" 1 "> AAVS1 Generazione di iCas9 HPSC linee attraverso TALEN mediata targeting

Come illustrato in precedenza, hPSCs sono stati elettroporate con un paio di AAVS1 plasmidi Talen e Cas9 e M2rtTA plasmidi ^5. Figura 2A e B mostra dettagliata di vettore donatore mira design e l'intera procedura per generare iCas9 HPSC linee clonali. Dopo la selezione antibiotica, cloni singola cella-derivati che espongono dimensioni adeguate e morfologia tipica HPSC erano pronti per essere raccolti (10 - 12 giorni dopo l'elettroporazione, Figura 2C). Di solito ~ 50% dei cloni siano correttamente mirati, senza integrazioni casuali, come verificato tamponando Southern (Figura 2D) ^5. integrazione a caso potrebbe causare espressione che perde di Cas9 in assenza di trattamento doxiciclina.

Efficiente Genetic MODIFICA in hPSCs utilizzando la piattaforma iCRISPR

In stabilito iCas9 hPSCs, Cas9 si esprime con il trattamento doxiciclina e guidato al suo luogo di destinazione dalle gRNAs trasfettate, dove si genera DSB. In assenza di un modello di riparazione, la riparazione del DNA attraverso NHEJ genera indels, che spesso si traducono in interruzioni gene o knockout. In presenza di un modello di riparazione (ad esempio, un donatore ssDNA), HDR può essere impiegato per precise alterazioni genetiche, quali la generazione di una specifica mutazione-paziente in un wild-type HPSC sfondo o correggere una variante genetica malattia associata nel paziente- iPSCs derivati (Figura 3a). Ci vuole ~ 1 mese a generare linee mutanti clonali utilizzando il sistema iCRISPR. Dopo l'induzione iCas9 e gRNA trasfezione, T7EI e / o RFLP saggi sono stati usati per valutare l'efficienza di taglio Cas9, e le cellule transfettate sono state seminate in seguito come singole cellule in piastre da 10 cm a bassa densità (~ 500 - 2, 000cellule piatto / 10-cm). 10 - 12 giorni dopo, cloni monocellulari-derivati sono stati collocati in pozzetti di una piastra a 96 pozzetti per estendere e caratterizzazione (cioè, la genotipizzazione e Western blotting) (Figura 3B). Dal momento che il knockout gene iCRISPR-mediata è altamente efficiente, nessun processo di selezione è coinvolto, e di solito 20 - 50% mutanti bialleliche può essere facilmente raggiunto (Figura 3C) ^5. Per alterazioni genetiche efficienti e precisi, gRNAs sono co-trasfettate con un donatore di ssDNA portando l'alterazione sequenza specifica (per un piccolo ma preciso cambio di sequenza del genoma). Spesso, per impedire la ri-taglio in alleli modificati, si raccomanda di includere una mutazione silente in prossimità o nella sequenza PAM (Figura 3D). Con questo sistema, ~ 10% dei cloni trasportano modifica genoma HDR-mediata desiderato senza alterazioni supplementari in entrambi gli alleli, sono raggiunti (Figure 3E). La rapida e precise modificazione del genoma HPSC utilizzando la piattaforma iCRISPR ci permette di effettuare in modo rapido ed efficiente le linee HPSC che servono come modelli per lo studio dello sviluppo umano e della malattia.

Differenziazione efficiente di hPSCs verso le cellule beta-come il glucosio-reattiva

I recenti progressi nella HPSC differenziazione del pancreas ha permesso lo sviluppo di protocolli che ricapitolano da vicino lo sviluppo embrionale del pancreas. HPSCs indifferenziate prima differenziati in endoderma definitivo, poi in PDX1 + primi progenitori pancreatici (PP1) e successive cellule progenitrici del pancreas (PP2) PDX1 + NKX6.1 +, e, infine, in glucosio-reattiva cellule ^{16, 17, 19 β-like, 20 , 23, 24.} questi ProtoCOLS sono stati ulteriormente ottimizzati per generare in modo affidabile le cellule beta-come il glucosio-reattiva ⁹ PDX1 + NKX6.1 + progenitori pancreatici e. La figura 4A mostra i supplementi chimica dettagliata utilizzati in ogni fase di differenziazione. Solitamente, ~ 80% di confluenza 2 giorni dopo il fasciame cellula iniziale è ideale per iniziare la differenziazione di HUES8 hPSCs (Figura 4B). Prova diverse densità di semina diversi è altamente raccomandato per scoprire la condizione ottimale per ciascuna linea cellulare specifica. Di solito almeno il 75% Foxa2 + SOX17 cellule + presso il DE palco e il 40% PDX1 + cellule NKX6.1 + in fase PP2 possono essere raggiunti (Figura 4C). Nella fase S5, la presenza di una forma aura simile intorno l'aggregato di cellule è un indicatore per la buona sopravvivenza delle cellule, che è importante per un'ulteriore differenziazione a cellule ß-like CPEP + glucosio-responsive NKX6.1 + (Figura 4D ). Questo protocollo è utile per studiare pancreatica umana d viluppo e la malattia in un piatto.

Figura 1. HPSC chimicamente definite e manutenzione senza alimentatore e cultura adattamento da IMEF alimentatori. (A) Immagini rappresentative della hPSCs coltivati su alimentatore Imef o VTN il giorno 4, pronto per essere diviso. (B) tipica morfologia hPSCs durante il primo passaggio di adattamento nella cultura senza alimentatore da un alimentatore IMEF. Giorno 4 hPSCs coltivate su alimentatori Imef sono stati divisi e placcato su piastre VTN rivestite in media chimicamente definita con inibitore ROCK. Il rapporto di divisione è uguale al consueto rapporto di divisione per la coltura in condizioni di alimentazione IMEF. Il mezzo è stato cambiato ogni giorno senza inibitore ROCK. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 2. Generazione di iCas9 HPSC Lines. (A) Targeting strategia per la generazione di linee iCas9 HPSC. Puro-Cas9 donatore e Neo-M2rtTA donatore stati presi di mira nel locus AAVS1 umana da una coppia di AAVS1 Talens. (B) Schema di tutto il processo di targeting, compresi elettroporazione, selezione antibiotica, colonia raccolta e l'espansione e caratterizzazione linea cellulare. (C) Rappresentante clone di cella singola pronto per essere raccolto a circa 10 - 12 giorni dopo l'elettroporazione. (D) esempi Southern blot per identificare i cloni correttamente mirati senza l'integrazione supplementare di due plasmidi donatori. cloni corrette sono evidenziati in rosso. (A) e (D) sono stati adattati da Reference 5, con il permesso.ig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. efficiente modificazione genetica hPSCs utilizzando il sistema iCRISPR. Schemi (A) per la generazione di mutanti knockout gene o precisa modificazione genetica utilizzando il sistema iCRISPR. (B) Procedura di targeting e l'istituzione linea clonale. Efficienza knockout (C) Gene attraverso NHEJ in hPSCs ^9. (D) Progettazione di un ssDNA portando una specifica modifica nucleotide. P, in rosso: paziente-specifica mutazione; X, in verde: la mutazione silente. (E) L'efficienza della modifica nucleotide preciso HDR-mediata. Una precisa mutazione R456C (causata da un nucleotide specifico C> T mutazione) nel locus GATA6 stato introdotto utilizzando il sistema iCRISPR.(Fare riferimento a Riferimento 5 per informazioni più dettagliate). (C) e (E) sono stati adattati da riferimento 9 e di riferimento 5, rispettivamente, con i permessi. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Diretto HPSC differenziazione in cellule beta-pancreatiche come glucosio-reattiva. (A) Schema del protocollo dettagliato di differenziazione, con sostanze chimiche integrate in ogni fase di differenziazione. vie di segnalazione che vengono attivati ​​o inibiti durante la differenziazione sono evidenziate in verde o rosso, rispettivamente. CHIR: inibitore GSK3; fattore di crescita differenziazione 8 o miostatina, un membro della famiglia di proteine ​​TGF-beta;: GDF8 HH: Istrice; DE: endoderma definitivo; PP1:PDX1 + presto progenitore del pancreas; PP2: PDX1 + NKX6.1 + tardi progenitore del pancreas. (B) confluenza tipica (70 - 80%) di hPSCs 48 ore dopo la semina quando è pronto per la differenziazione iniziazione. (C) le immagini di immunofluorescenza colorazione rappresentative che mostrano la differenziazione di successo al endoderma definitivo (DE) fase (Foxa2 e SOX17 co-colorazione), del pancreas fase progenitore (PP2: PDX1 e NKX6.1 co-colorazione), e glucosio-reattiva β- come stadio di cellule (NKX6.1 e C-peptide co-colorazione). In generale, per ottenere più del 10% NKX6.1 + cellule CPEP + in fase di cellule β-like, almeno il 75% Foxa2 + Sox17 + cellule DE e il 40% PDX1 + cellule NKX6.1 + PP2 sono tenuti presso le corrispondenti fasi. (D) La morfologia tipica di un aggregato di cellule nella fase S5 su un filtro a membrana inserto nella cultura interfaccia aria-liquido. Le cellule sopravvissute sono migrati al centro dell'aggregato (in scuro) e lasciato una struttura aura simile sul bordo. (A (D) sono stati adattati da riferimento 9 con le autorizzazioni. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

plasmidi	Quantità
AAVS1-TALEN-L	5 mcg
AAVS1-TALEN-R	5 mcg
AAVS1-Puro-iCas9	40 mcg
AAVS1-Neo-M2rtTA	40 mcg

Tabella 1

Primer	Sequenza
T7F	TAATACGACTCACTATAGGG
TracrR	AAAAGCACCGACTCGGTGCC

Tavolo 2

Tabella 3

Componente	Quantità
DDH 2 O	35.5 ml
tampone di reazione 5x PCR	10 microlitri
miscela dNTP (25 mM)	0,5 ml
T7F (10 micron)	1,25 ml
TracrR (10 micron)	1,25 ml
T7-gRNA modello IVT (250 nm)	1 ml
DNA polimerasi	0,5 ml
mix complessivo di reazione PCR	50 microlitri

Condizioni di ciclismo PCR
numero di cicli	Denaturare	temprare	Estendere
1	94 ° C, 2 min
2-31	94 ° C, 20 s	60 ° C, 20 s	72 ° C, 1 min
32			72 ° C, 2 min

Tabella 4

Componente
T7 ATP	2 microlitri
T7 CTP	2 microlitri
T7 GTP	2 microlitri
T7 UTP	2 microlitri
tampone T7 10x	2 microlitri
mix enzima T7	2 microlitri
PCR modello amplificato	8 ml
Totale in vitro gRNA mix di trascrizione	20 microlitri
Incubare a 37 ° C per 6 ore a notte

Tabella 5

Componente	Importo (ml)
Non purificato prodotto PCR	8
Buffer 2 10x	2
L'acqua distillata (DH 2 O)	10

Tabella 6

Denaturazione del DNA e ibridazione condizioni di ciclismo
Temperatura	Durata	condizioni Thermocycler
95 ° C	10 minuti
85 ° C	1 minuto	Rampa a 85 ° C a 2 ° C / s
75 ° C	1 minuto	Rampa a 75 ° C a 0.3 ° C / s
65 ° C	1 minuto	Rampa a 65 ° C a 0.3 ° C / s
55 ° C	1 minuto	Rampa a 55 ° C a 0.3 ° C / s
45 ° C	1 minuto	Rampa a 45 ° C a 0.3 ° C / s
35 ° C	1 minuto	Rampa a 35 ° C a 0.3 ° C / s
25 ° C	1 minuto	Rampa a 25 ° C a 0.3 ° C / s
4 ° C	tenere

Tabella 7

Palcoscenico	Giorno	media	Supplemento
S1	d0	S1	GDF8 100 ng / mL	CHIR-99021 3 micron
	d1	S1	GDF8 100 ng / mL	CHIR-99021 0,3 micron
	d2	S1	GDF8 100 ng / mL
S1 supporti: MCDB 131 + 1x supplemento di L-glutammina + 0,5% BSA + 1,5 g / L NaHCO 3 + 10 mM glucosio

Tabella 8

Palcoscenico	Giorno	media	Supplemento
S2	D3-D4	S1	LAA 0.25 mM	FGF7 50 ng / mL	IWP-2 2,5 micron
S3	d5-d6	S3	LAA 0.25 mM	FGF7 50 ng / mL	SANT-1 0.25 micron	RA 1 pM	LDN 100 nM	TPB 200 nm	ITS-X 1: 200
S4	D7-D9	S3	LAA 0.25 mM	FGF7 2 ng / mL	SANT-1 0.25 micron	RA 0,1 micron	LDN 200 nm	TPB 100 nM	ITS-X 1: 200	IWP-2 2,5 micron
S3 supporti: MCDB 131 + 1x supplemento di L-glutammina + 2% BSA + 2,5 g / L NaHCO 3 + 10 mM glucosio

Tabella 9

Palcoscenico	Giorno	media	Supplemento
S5	D10-D12	S5	T3 1 micron	ALK5i II 10 micron	Sant-1 0.25 micron	RA 0.05 micron	LDN 100 nM	ITS-X 1: 200	ZnSO4 10 micron	Eparina 10 mg / ml
S6	D19 d13-	S5	T3 1 micron	ALK5i II 10 micron	GSiXX 100 nM		LDN 100 nM	ITS-X 1: 200	ZnSO4 10 micron	Eparina 10 mg / ml
S7	D33 d20-	S5	T3 1 micron	ALK5i II 10 micron	N-cis 1mM	Trolox 10 pM	R428 2 micron	ZnSO4 10 micron	Eparina 10 mg / ml
S5 supporti: Blar + 1x L-glutammina supplemento + 2% BSA + 1,5 g / L NaHCO 3 + 20 mM glucosio

ITS-X 1: 200

Tabella 10

Discussion

Considerazioni Tempo per la generazione di mutanti Lines

Anche se gli approcci più recenti basati su sistemi / Cas CRISPR per la modifica del genoma hanno portato a il targeting di successo, una piattaforma più efficace e universale sarebbe preferibile per i più grandi scala analisi della funzione del gene. La piattaforma iCRISPR offre un metodo rapido ed efficace per introdurre mutazioni a qualsiasi gene di interesse ^{5, 9.} In primo luogo, il metodo di sintesi gRNA basato sulla PCR consente la produzione di centinaia di gRNAs in formato disposte in un giorno senza le fasi di clonazione in termini di tempo. In secondo luogo, con l'espressione Cas9 doxiciclina-inducibile in iCas9 hPSCs, il passo che coinvolge gRNA trasfezione richiede solo una minima quantità di lavoro, e, quindi, più gRNA esperimenti di targeting può essere condotta contemporaneamente. In terzo luogo, a causa della elevata Targeting efficienze ottenibili con il nostro sistema, l'analisi di ~ 24 - 48 colonie per gRNA transfettate dovrebbero essere sufficient stabilire monoallelic multiplo e linee mutanti biallelici per un singolo gene, anche se efficienze variano a seconda del locus bersaglio. Dal momento che è possibile per un individuo addestrato per raccogliere meccanicamente 384 colonie (lastre 4 x 96 pozzetti) in una sola seduta, che dovrebbe prendere ~ 4 ore sotto un microscopio da dissezione, un individuo addestrato può essere previsto per generare linee mutanti che interessano 12 geni all'interno 12 mesi. La generazione di mutanti snella HPSC in poco tempo permette l'analisi sistematica di una serie di fattori di trascrizione e / o componenti percorso di segnalazione che interagiscono tra di loro, che regolano il processo di sviluppo ^9. Inoltre, il targeting efficiente gene multiplex apre anche la porta ad indagare le interazioni genetiche sottostanti tratti umani complessi.

Generazione di Precise modifiche genetiche

La derivazione di iPSCs-paziente specifici da facilmente accessibile tipo di cellule somatiche s e la differenziazione in tipi di cellule malattie rilevanti forniscono una grande opportunità per la validazione funzionale delle mutazioni associate alla malattia. Tuttavia, a causa della notevole variabilità genetica tra individui, confronti diretti tra iPSCs da pazienti e da donatori sani potrebbero non consentire di distinguere fenotipi di malattia da effetti di sfondo. Pertanto, è necessario generare iPSCs controllo isogeni correggendo la malattia mutazione torna alla sequenza wild-type o di introdurre mutazioni specifiche del paziente in una wild-type HPSC sfondo, come proposto da altri ^{25, 26.} Oltre a (nulli) mutazioni perdita di funzione, si può ora analizzare con maggiore precisione i meccanismi della malattia attraverso l'introduzione di un paziente-specifici alterazioni di sequenza nel locus endogeno hPSCs, tra cui il paziente hypermorphic, hypomorphic, neomorphic, o dominante negativo mutazioni.

S copi "> modifica genetica Precise impiega HDR per la riparazione DSB in presenza di un modello di riparazione. Dal momento che è molto meno efficiente di riparazione del DNA NHEJ-mediata, un plasmide donatore contenente la specifica mutazione-paziente, una cassetta selezione dei farmaci, e braccia omologia è stato precedentemente utilizzato come modello di riparazione ^2. Dopo la selezione della droga e la verifica della specifica mutazione-paziente, un secondo passo è generalmente necessario per rimuovere la cassetta di selezione della droga. Mentre i più diffusi sistemi di Cre-loxP e FLP-FRT lasciano dietro sequenza residua nel locus endogena, l'uso di piggyBac trasposone ha permesso la rimozione senza saldatura della cassetta di selezione droga ^27. Più recentemente, i modelli ssDNA brevi hanno anche dimostrato di sostenere HDR efficiente con endonucleasi di DNA ingegnerizzati ^28. Rispetto ad un plasmide donatore , ssDNA può essere sintetizzato direttamente aggira quindi il passo clonazione tempo. Qui, deve essereen dimostrato che, mediante co-trasfezione gRNA e un modello ssDNA per indurre riparazione omologia-diretto, iCRISPR può essere utilizzato per introdurre modifiche nucleotidiche specifiche con alta efficienza. Questo è fondamentale non solo per sezionare il ruolo dei nucleotidi essenziali all'interno proteine ​​domini funzionali, ma anche per modellare malattia mutazioni umane e potenzialmente correggere queste mutazioni malattia-associato, per intervento terapeutico. A causa del gran numero di suscettibilità loci che sono ciascuno associato a più varianti di sequenza, modellando malattie complesse e multigenici come diabete è stata una sfida per i genetisti. Come la piattaforma iCRISPR è permissivo per la rapida generazione di una serie allelica o per il targeting canalizzabile gene, può facilitare la ricerca di più loci associata a malattia, singolarmente o in combinazione con sfondi isogenici.

Targeting efficienze ed effetti fuori bersaglio

abbiamo trovato una buona correlazione tra la T7E1 e risultati del test RFLP e il numero di linee mutanti identificati mediante sequenziamento. Questo sottolinea l'importanza di eseguire questi test in parallelo con la creazione di linee clonali. Mentre le efficienze di targeting ottenuti possono variare a seconda delle loci genomici, nella maggior parte degli esperimenti singolo gene targeting, 20 - 60% dei cloni sono stati trovati con entrambi gli alleli mutati (compresi in-frame e frameshift mutazioni) ^9. Nei casi in cui è stata eseguita multiplex gene targeting, triple cloni mutanti bialleliche con il 5-10% di efficienza sono stati ottenuti ^5. ssDNA mediata HDR di diversi geni sono stati anche eseguiti per ottenere precise alterazioni genetiche, con le efficienze di ottenere omozigote knock-in cloni che vanno da 1 - 10% ^5. Lavorare con CRISPR / Cas in hPSCs, eventuali mutazioni nei potenziali siti off-bersaglio che non condividono la stessa sequenza bersaglio gRNA devono ancora essere rilevatalass = "xref"> ^{5, 9, 12.} Whole-sequenziamento del genoma eseguito in un recente studio ha anche omesso di individuare sostanziali mutazioni fuori bersaglio nelle linee clonali HPSC generata utilizzando CRISPR / Cas ^29. Tuttavia, per ridurre al minimo qualsiasi potenziale effetto di confondimento fenotipi introdotte da mutazioni nei siti ad effetto fuori bersaglio, si consiglia di generare linee mutanti indipendenti utilizzando almeno due gRNAs indipendenti di targeting sequenze diverse all'interno dello stesso gene. fenotipi simili osservati in più linee generati utilizzando diverse gRNAs potrebbe principalmente escludere la possibilità che il fenotipo proviene da un effetto centra la porta.

Alimentatore-dipendente contro la cultura indipendente e targeting

I metodi tradizionali per la cultura HPSC coinvolgono il loro mantenimento e l'espansione su cellule feeder in supporti contenenti siero o sostituzione siero che include prod animaledotti, come albumina di siero bovino. cellule di alimentazione, siero, siero di sostituzione, e l'albumina contengono tutti complessi, componenti non definiti e mostrano una notevole variabilità dei lotti. L'adattamento alla condizione-alimentatore libero e chimica definita riduce in modo significativo gli sforzi per HPSC manutenzione e, soprattutto, aumenta la consistenza degli esperimenti di differenziazione. Allo stato attuale, ci sono pochi studi che descrivono le procedure di modifica del genoma su hPSCs coltivate in condizioni di coltura completamente definite ^30. Abbiamo trovato maggiore CRISPR mira efficienza quando gRNA trasfezione e la deposizione clonale sono stati eseguiti in condizioni di assenza di alimentazione rispetto alle condizioni di coltura di alimentazione-dipendente. Noi crediamo che questo sia dovuto ad un aumento della sopravvivenza delle cellule dopo la trasfezione e semina cella singola per la formazione di colonie. Inoltre, cellule di alimentazione sono stati precedentemente dimostrato di sequestrare reagenti di trasfezione, riducendo così l'efficienza di trasfezione.

combinandoEditing Genome con differenziazione Regia

Precedente protocolli di differenziazione hanno prodotto solo una piccola frazione di cellule insulino-positive, la maggior parte dei quali erano polyhormonal e assomigliava cellule endocrine fetali ^23. I recenti progressi ha permesso la differenziazione di hPSCs in cellule più mature glucosio-responsive beta-come ^{16, 17, 19, 20.} Siamo in grado di routine ottenere cellule endoderma definitivo almeno il 75%, il 40% Pdx1 + NKX6.1 + progenitrici del pancreas, e circa il 20% NKX6.1 + CPEP + cellule beta-come il glucosio-reattiva utilizzando HUES8 hPSCs ^9. In combinazione con il sistema di editing genoma iCRISPR, questo più robusto protocollo di differenziazione ha facilitato l'analisi dei fattori di trascrizione che sono cruciali per il progenitore e endocrini pancreatici fasi di differenziazione del pancreas. Questo renderàE 'possibile, in studi futuri, per esaminare un gran numero di geni-malattia candidato per la validazione funzionale e di indagine sui meccanismi che sono alla base del diabete ^9.

Applicazioni o Direzioni future

Il nostro sistema di iCRISPR può facilitare la generazione di modifiche genomiche più complessi, come ad esempio la creazione di alleli giornalista attraverso gene targeting utilizzando lunga donatori modelli di DNA tag proteine di codifica o giornalisti fluorescenti ¹² HDR-mediata. Abbiamo dimostrato che, a causa della elevata CRISPR di targeting efficienze raggiunte nel sistema, questo processo può essere eseguito in hPSCs, senza la necessità di selezionare ulteriori farmaci ^12. Inoltre, gene multiplex mira può essere utilizzato per studiare le interazioni genetiche sottostante malattia umana complessa, come indicato nel nostro studio recente, che a nostro avviso è il primo esempio di tale lavoro ^31. iCRISPR può essere utilizzato anche per capire il controllo normativo gene con la creazione di delezioni sia in RNA non codificanti del gene o in regioni regolatorie, come i promotori e stimolatori. Per generare in modo efficiente mutanti normativi utilizzando iCRISPR, gRNAs possono essere progettati per interrompere il sito di legame di una proteina di legame al DNA, compreso ma non limitato alla macchina di trascrizione basale o un fattore di trascrizione tessuto-specifica. ssDNA HDR modello mediata può essere utilizzato anche a mutare specifici siti di legame alle proteine. Infine, prevediamo che un'ulteriore ottimizzazione consentirebbe l'utilizzo della piattaforma iCRISPR in hPSCs per alte analisi genetiche di throughput di fenotipi pluripotenza o fenotipi di malattia in combinazione con un protocollo vitro differenziazione. Questi studi iCRISPR mediata possono consentire la più rapida identificazione dei candidati geni associati alla malattia e gli studi della loro rilevanza funzionale.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Terreno chimicamente definito (E8)	Thermo Fisher Scientific	A1517001	Terreno basale Essential 8 e integratore Essential 8 inclusi
Forma umana ricombinante tronca di vitronectina	Thermo Fisher Scientific	A14700
Inibitore ROCK Y-27632	Selleck Chemicals	S1049
Reagente di dissociazione (enzima TrypLE Select)	Thermo Fisher Scientific	12563029	1x, privo di origine animale, enzima ricombinante
G418 Solfato	Thermo Fisher Scientific	10131035	Geneticin Antibiotico selettivo
Puromicina dicloridrato	Sigma-Aldrich	P8833	Puromicina Antibiotico selettivo
DNA polimerasi (Herculase II Fusion)	Agilent Technologies	600679	Kit PCR
MEGAshortscript T7 Trascrizione kit	Thermo Fisher Scientific	AM1354
Kit di pulizia della trascrizione MEGAclear	Thermo Fisher Scientific	AM1908
Idlato di doxiciclina	Sigma-Aldrich	D9891
Opti-MEM medium	Thermo Fisher Scientific	31985062	Siero ridotto
Medium Lipofectamina RNAiMAX Reagente di trasfezione	Thermo Fisher Scientific
DNeasy Blood & Kit di tessuti	QIAGEN	69504	Kit di estrazione del DNA genomico
Proteinasi K	Roche	3115879001
MCDB 131 medium	Thermo Fisher Scientific	10372-019
BLAR medium	Thermo Fisher Scientific		Realizzato su misura con una formulazione pubblicata (Rezania et al., 2014)
Integratore di L-glutammina (GlutaMAX)	Thermo Fisher Scientific	35050061
NaHCO3	Thermo Fisher Scientific	144-55-8
Glucosio	Sigma-Aldrich	G8769
BSA	LAMPIRE Biological Laboratories	7500855	Senza acidi grassi
GDF8	PeproTech	120-00
CHIR-99021	Stemgent	04-0004	Inibitore GSK-3
Acido L-ascorbico	Sigma-Aldrich	A4544	Vitamina C
FGF7	R& D Systems	251-KG
SANT1	Tocris Bioscience	1974	Inibitore del riccio
RA	Sigma-Aldrich	R2625	Acido retinoico
LDN	Stemgent	04-0019	Inibitore BMP
IWP-2	Tocris Bioscience	3533	Antagonista Wnt
ITS-X	Thermo Fisher Scientific	51500-056
TPB	EMD Millipore	565740-1MG	Attivatore PKC
3,3',5-Triiodo-L-tironina (T3)	Sigma-Aldrich	T6397
ALK5i II	Enzo Life Sciences	ALX-270-445	ALK5 inibitore II
ZnSO4	Sigma-Aldrich	Z0251
Eparina	Sigma-Aldrich	H3149
GSiXX	EMD Millipore	565789	Inibitore della gamma secretasi XX, inibitore della segnalazione NOTCH
N-Cys (N-acetil cisteina)	Sigma-Aldrich	A9165
Trolox	EMD Millipore	648471	analogo della vitamina E
R428	Selleck Chemicals	S2841	recettore AXL tirosin-chinasi inibitore
24 mm Transwell con inserto	Corning Life Sciences	3414
Gene Pulser Xcell Electroporation System	Bio-Rad	1652660
0,4 cm Cuvette per elettroporazione	Bio-Rad	1652081
AAVS1-TALEN-L	Addgene	59025
AAVS1-TALEN-R	Addgene	59026
AAVS1-Neo-M2rtTA	Addgene	60843
AAVS1-Puro-iCas9	Addgene	58409
T7 Endonucleasi I	NEB	M0302L
Tampone 2	NEB	B7002S	NEBuffer 2
Oligonucleotide lungo	Eton Bioscience o IDT
SOX17 anticorpo	R & D Systems	AF1924	1:500
FOXA2 anticorpo	Millipore	07-633	1:100
CXCR4-APC anticorpo	R& D Systems	FAB170A	1:25
PDX1 anticorpo	R& D Systems	AF2419	1:500
NKX6.1 anticorpo	DSHB	F55A12	1:500
NKX2.2 anticorpo	DSHB	74.5A5	1:100
NEUROD1 anticorpo	Santa Cruz Biotechnology	sc-1084	1:100
Anticorpo insulina	Dako	A0564	1:2.000
Anticorpo peptide	C DSHB	GN-ID4-c	1:2.000
Anticorpo glucagone	Sigma-Aldrich	G2654	1:1.000