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Articolo metodologico

Murino linfociti Etichettatura da

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DOI:

10.3791/55270

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29 aprile 2017

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1Werner Siemens Imaging Center, Department of Preclinical Imaging and Radiopharmacy, Eberhard Karls University Tübingen, 2Department of Dermatology, Eberhard Karls University Tübingen

In questo articolo

Sommario

Seguendo la preparazione di un anticorpo monoclonale 64 Cu-modificata legandosi ad un recettore delle cellule T transgenico murino, cellule T sono radiomarcato in vivo, analizzati per la vitalità, funzionalità, stabilità etichettatura e apoptosi e adoptively trasferite in topi con una cannula ipersensibilità di tipo ritardato reazione per l'imaging non invasiva mediante tomografia a emissione di positroni / tomografia computerizzata (PET / CT).

Abstract

Questo protocollo illustra la produzione di 64 Cu e il chelante coniugazione / radiomarcatura di un anticorpo monoclonale (mAb) seguita da coltura cellulare linfociti murino e recettori 64 Cu-anticorpo di targeting delle cellule. Valutazione in vitro del prodotto radiomarcato e non invasivo nel monitoraggio delle cellule in vivo in un modello animale di una via aerea di tipo ritardato reazione di ipersensibilità (DTHR) PET / TC sono descritti.

In particolare, viene mostrata la coniugazione di un mAb con il chelante acido 1,4,7,10-tetraazaciclododecan-1,4,7,10-tetraacetico (DOTA). Seguendo la produzione di radioattivo 64 Cu, radiomarcatura del DOTA-coniugato mAb è descritto. Successivamente, l'espansione di ovalbumina di pollo (Cova) CD4 + -specific interferone (IFN) -γ-producendo cellule T helper (cova-TH1) e la successiva radiomarcatura delle cellule cova-TH1 sono raffigurati. Varie tecniche in vitro sono presentati per valutare l'effetti di 64 Cu-radiomarcatura sulle cellule, quali la determinazione della vitalità cellulare mediante trypan blu, la colorazione per apoptosi con annessina V per citometria a flusso, e la valutazione della funzionalità da IFN-γ saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) . Inoltre, la determinazione della captazione radioattivo nelle cellule e la stabilità etichettatura sono descritte in dettaglio. Questo protocollo descrive inoltre come eseguire studi di tracciamento delle cellule in un modello animale di una DTHR delle vie aeree e, di conseguenza, l'induzione di cova indotta DHTR acuta delle vie aeree a / c topi BALB è incluso. Infine, un robusto workflow / CT PET inclusa l'acquisizione delle immagini, ricostruzione, e l'analisi è presentato.

L'approccio di targeting recettore 64Cu-anticorpo con successiva internalizzazione recettoriale fornisce alta specificità e stabilità, ridotta tossicità cellulare, e tassi di efflusso bassi rispetto ai comuni PET traccianti per l'etichettatura di cellule, ad esempio 64 Cubis -pyruvaldehyde (N4-methylthiosemicarbazone) (64 Cu-PTSM). Infine, il nostro approccio consente non invasivo in cellule inseguimento vivo mediante PET / TC con un ottimo rapporto segnale-sfondo per 48 h. Questo approccio sperimentale può essere trasferito a diversi modelli animali e tipi di cellule con recettori di membrana che sono internalizzati.

Introduzione

Inseguimento cella non invasiva è uno strumento versatile per monitorare la funzione cellulare, la migrazione e homing in vivo. Recenti studi di monitoraggio delle cellule mesenchimali si sono concentrati su 1, 2 o del midollo osseo di cellule staminali derivate 3 nel contesto della medicina rigenerativa, periferiche autologhe globuli bianchi a infiammazione o linfociti T in terapie cellulari adottivi contro il cancro 3, 4. La spiegazione dei siti di azione ei principi biologici sottostanti di terapie a base di cellule è di enorme importanza. I linfociti T citotossici CD8 +, geneticamente antigene recettore chimerico cellule T (CAR) o linfociti infiltranti il tumore (TIL) sono stati ampiamente considerato come il gold standard. Tuttavia, le cellule TH1 antigene-specifiche associati al tumore hanno dimostrato di essere un efficace opzione di trattamento alternativa 4, </ sup> 5, 6, 7.

Come attori chiave infiammazione, malattie autoimmuni organo-specifiche (ad esempio, l'artrite reumatoide o asma bronchiale), e le cellule di elevato interesse in immunoterapia del cancro, è importante caratterizzare la distribuzione e homing modelli temporali di cellule TH1. Invasiva imaging in vivo da PET presenta un metodo altamente sensibile quantitativa 8 per esaminare i modelli di migrazione cellulare, in vivo homing, ed i siti di azione delle cellule T e risposte durante l'infiammazione, allergie, infezioni o tumore rifiuto 9, 10, 11.

Clinicamente, 111 In ossina viene utilizzato per leucociti scintigrafia per la discriminazione di infiammazione e infezione 12, mentre 2-deossi-2- (18F) fluoro-D-glucosio (18 F-FDG) viene comunemente utilizzato per studi di localizzazione cellulare mediante PET 3, 13. Uno svantaggio principale di questo tracciante PET, tuttavia, è la breve emivita del radionuclide 18 F a 109,7 min e la bassa stabilità intracellulare che ostacola l'imaging in momenti successivi caricare trasferimento adottivo di cellule. A lungo termine studi in vivo inseguimento cellulare mediante PET, anche se instabile nelle cellule, 64 Cu-PTSM viene frequentemente usato per marcare le cellule non specifico 14, 15 con effetti dannosi minimizzati sulla vitalità delle cellule T e funzionamento 16.

Questo protocollo descrive un metodo per ridurre ulteriormente gli effetti svantaggiosi sulla vitalità delle cellule e la funzione utilizzando un recettore di cellule T (TCR) -specifica radiomarcato mAb. In primo luogo, la produzione del radioisotopo 64 Cu, la coniugazione del mAb KJ1-26 con the chelante DOTA, ed il successivo 64 Cu-radiomarcatura sono mostrati. In una seconda fase, l'isolamento e l'espansione delle cellule cova-TH1 di topi donatori DO11.10 e la radiomarcatura con 64 Cu-caricata DOTA-coniugato mAb KJ1-26 (64 Cu-DOTA-KJ1-26) sono descritte in dettaglio. La valutazione dei valori di assunzione e efflusso di radioattività con un calibratore di dosi e y-conteggio, rispettivamente, nonché la valutazione degli effetti di 64 Cu-radiomarcatura sulla vitalità cellulare mediante trypan blu e funzionalità con IFN-y ELISA sono rappresentati . Per non invasiva nel monitoraggio delle cellule in vivo, l'elicitazione di un modello murino di cova indotta acuta delle vie aeree e DTHR immagine acquisizione da PET / TC dopo trasferimento adottivo di cellule sono descritti.

Inoltre, questo approccio etichettatura può essere trasferito a diversi modelli di malattia, cellule T murine con differenti TCR o cellule generali di interesse con recettori di membrana o espressione markers sottostante membrana continua spola 17.

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Protocollo

Norme di sicurezza: Durante la manipolazione radioattività, memorizzare 64 Cu dietro mattoni piombo 2 pollici di spessore e utilizzando rispettivo schermatura per le navi munite attività. Utilizzare gli strumenti adeguati per gestire indirettamente fonti non schermati per evitare il contatto diretto della mano e ridurre al minimo l'esposizione a materiale radioattivo. Indossare sempre distintivi di monitoraggio dosimetria delle radiazioni e dispositivi di protezione individuale e verificare se stessi e l'area di lavoro per la contaminazione per affrontare immediatamente. Eliminare potenzialmente contaminati dispositivi di protezione individuale prima di lasciare la zona in cui viene utilizzato materiale radioattivo. Memorizzare l'intera rifiuti radioattivi dietro piombo schermatura fino alla radioattivo 64 Cu è decaduto (circa 10 dimezzamento = 127 h) prima di un adeguato smaltimento.

1. 64 Cu Produzione

NOTA: Il radioisotopo 64 Cu è prodotta tramite il 64 Ni (p, n) 64Cu reazione nucleare utilizzando un PETTciclotrone gara in base ad un protocollo modificato di McCarthy et al. 18.

  1. Per 64 produzione Cu, Ni irradiare 64, che è elettrolitico su una piastra di platino / iridio (90/10), di 30 uA per 6 h con un fascio di protoni di 12,4 MeV.
  2. Riscaldare il bersaglio platino / iridio a 100 ° C in una camera polietereterchetone dedicato (PEEK) e incubare in 2 mL di HCl concentrato per 20 min per sciogliere 64 Cu / Ni 64.
  3. Aggiungere un altro 1 ml di HCl concentrato e incubare per 10 min.
  4. Far evaporare HCl utilizzando un flusso di argon e raffreddare la camera a temperatura ambiente.
  5. Sciacquare la camera con 3 mL di 4% 0,2 M HCl e 96% di metanolo (v / v) e trasferire tale soluzione ad una colonna di scambio ionico che è stato pre-condizionata 4% 0,2 M HCl in metanolo per almeno 15 min. Il flusso passante può essere utilizzato per riciclare 64 Ni.
  6. Lavare il 64 Cu trattenuto nella colonna con 4% 0,2 M HCl in metanolo.
  7. Eluire 64 Cu 70% 1.3 M HCl / 30% isopropanolo (v / v) in una fiala di raccolta, evaporare la soluzione in un flusso di argon e lasciare che la fiala raffreddare a temperatura ambiente.
  8. Sciogliere 64 Cu in 140-210 ml di 0,1 M HCl.

2. Anticorpo coniugazione con DOTA e successivi 64 Cu-radiomarcatura

NOTA: Il chelante DOTA sarà collegato ai gruppi amminici funzionali del mAb da N-idrossisuccinimmide (NHS) estere chimica e il coniugato sarà successivamente radiomarcati con 64 Cu 19.

  1. Regolare la concentrazione del KJ1-26-mAb a 8 mg / ml e diafiltrate 1 mL di soluzione di mAb contro 0,1 M Na 2 HPO 4 pH 7,5 trattata con 1,2 g / L di una resina a scambio ionico usando chelante un peso molecolare tagliato ( MWCO 30 kDa) unità filtro centrifugo. Applicare 3 successive fasi di lavaggio con 14 mL di tampone. Dopo l'ultimo lavaggio,concentrare la soluzione di nuovo per 1 ml. Quantificare la concentrazione di anticorpi da misure 280nm OD.
  2. Preparare una soluzione DOTA-NHS in ultrapura o acqua PCR-grade ad una concentrazione di 10 mg / mL immediatamente prima dell'uso. Lasciare che il flaconcino raggiunga la temperatura ambiente prima dell'apertura per evitare la formazione di condensa, e con attenzione rimuovere DOTA-NHS utilizzando una spatola di plastica. Aggiungere 216 ml di questa soluzione DOTA-NHS a 8 mg della soluzione diafiltrated KJ1-26-mAb, miscelare bene e incubare per 24 ore a 4 ° C su un agitatore caduta.
  3. Diafiltrate il DOTA-KJ1-26-mAb contro 0,25 M di acetato di ammonio, pH 7,0, trattata con 1,2 g / L di una resina a scambio ionico chelante, con un peso molecolare tagliare (MWCO 30 kDa) unità filtro centrifugo. Applicare 7 fasi di lavaggio. Concentrare il mAb ad un volume finale di 1 ml e di nuovo misurare la concentrazione di proteine mediante misurazioni 280nm OD.
  4. Prima radiomarcatura, cambiare il tampone di DOTA-KJ1-26-mAb di PBS mediante size-exccromatografia lusion utilizzando colonne di filtrazione di gel. Ciò elimina anche eventuali impurità piccole molecole.
  5. Preparare 100 MBq 64 CuCl 2 soluzione 10 mM HCl e regolare il pH a 6-7 con PBS 10x. Aggiungere 200 mg di DOTA-KJ1-26-mAb. Incubare per 60 minuti a 37 ° C.
  6. Per controllo di qualità, eseguire cromatografia su strato sottile con 0,1 M sodio citrato (pH 5) come fase mobile e analizzare mediante autoradiografia. Almeno il 90% dell'attività dovrebbe essere legato all'anticorpo e quindi essere rilevata nel punto di partenza. attività legato viene chelato con la fase mobile citrato-based e striature al fronte del solvente. Per un riferimento, si consiglia l'uso di 64 CuCl 2.

3. Pollo Ovoalbumina-specifica TH1 (Cova-TH1) isolamento delle cellule ed espansione

NOTA: La coltura di cellule TH1 è descritto secondo studi pubblicati in precedenza 16, 17.

  1. Isolare milza e dei linfonodi extraperitoneali (LNS) di topi DO11.10.
    1. Sacrifica il mouse secondo le norme federali. Disinfettare l'animale con il 70% di etanolo e fissare con nastro adesivo per la rimozione della milza e linfonodi. Eseguire un'incisione mediana e separare la cute dal peritoneo tirando lateralmente a ciascun sito.
    2. Individuare la cervicale, assiale, brachiale e LNs inguinali. Rimuovere con una pinza smussato e metterli in 1% siero di vitello fetale (FCS) / PBS.
    3. Aprire il peritoneo e individuare la milza. Separare la milza dal pancreas e del tessuto connettivo e posizionarlo in 1% tampone FCS / PBS. Per ulteriori indicazioni, vedi riferimenti 20,21.
  2. Tritare milza e linfonodi attraverso un filtro 40 micron in un 50 mL vite tubo cappuccio con lo stantuffo di una siringa. Risciacquare il filtro con 10 ml di 1% FCS / PBS-buffer.
  3. Centrifugare a 400 xg per 5 minuti e rimuovere il surnatante. Subsequently, effettuare la lisi degli eritrociti aggiungendo ammonio-cloruro di potassio (ACK) tampone di lisi (1,5 mL per donatore animale) per 5 min a temperatura ambiente. Aggiungere 8,5 ml di 1% FCS / PBS-tampone (per donatore animale).
  4. Centrifugare le cellule a 400 xg per 5 minuti e rimuovere il surnatante. Lavare le cellule in 10 ml di 1% FCS / PBS-tampone, centrifugare a 400 xg per 5 minuti e rimuovere il surnatante.
  5. Per la separazione cellulare magnetica, risospendere le cellule in 1% FCS / PBS-buffer e aggiungere CD4 + microsfere. Fare riferimento alle istruzioni del produttore per il volume di buffer e la quantità di CD4 + microsfere da usare.
  6. Incubare per 20 minuti a 4 ° C. Poi aggiungere 1% FCS / PBS-tampone fino a 50 mL, centrifugare le cellule a 400 xg per 5 min, e rimuovere il surnatante.
  7. Continuare con isolamento delle cellule T CD4 + usando colonne di separazione magnetica commerciali ed un rispettivo supporto magnetico secondo il protocollo del produttore. Regolare le cellule T CD4 + eluiti ad una concentration di 10 6 cellule / ml in Modified medio Dulbecco Eagle con 2,5% di penicillina / streptomicina, 1% tampone HEPES, acidi 10% FCS inattivato al calore, 1% MEM ammino, 1% sodio piruvato, e 0,2% 2-mercaptoetanolo e negozio li a 4 ° C.
  8. Raccogliere la scarica colonna in un tubo da 50 ml tappo a vite per preparare cellule presentanti l'antigene (APC). Centrifugare la colonna di scarico a 400 xg per 5 minuti e rimuovere il surnatante.
  9. Aggiungere 10 mg / ml di anti-CD4 (clone: ​​Gk1.5), 10 mg / ml di anti-CD8 (clone: ​​5367,2) e 10 mg del mouse / mL anti-rat-mAb (MAR18.5) e 1,5 mL complemento di coniglio. Incubare per 45 minuti a 37 ° C.
  10. Centrifugare le cellule a 400 xg per 5 minuti, rimuovere il surnatante e aggiungere 3 ml di mezzo. Irradiare l'APC su una fonte γ-ray o raggi x con 30 Gy in totale. Successivamente, regolare le APC ad una concentrazione di 5 x 10 6 cellule / ml.
  11. Aggiungere 100 ml di CD4 + T cellule e 100 l di APC su un 96 pozzetti plate insieme con 10 ug / mL cOVA 323-339-peptide, 10 ug / ml di anti-IL-4 mAb, 0.3 pM CPG1668-oligonucleotidi e 5 U / mL di IL-2.
  12. Aggiungere 50 U / mL di IL-2 ogni due giorni. Dopo 3 - 4 giorni, trasferire le cellule da piastre a 96 pozzetti a piastre da 24 pozzetti. Combinare 3-5 pozzi dalla piastra a 96 pozzetti in un pozzetto sulla piastra da 24 pozzetti. Aggiungere 100 U / ml di IL-2 contenente il mezzo in un rapporto 1: 1.
  13. Dopo altri 2-3 giorni, trasferire le cellule dalla piastra a 48 pozzetti a 175 cm 2 palloni di coltura cellulare (1 x 48 pozzetti per bombola). Riempire con il mezzo in un rapporto 1: 1. Aggiungere 50 U / mL di IL-2 ogni due giorni.
  14. Dividere le celle in base alla densità cellulare e aggiungere 50 U / ml di IL-2 ogni due giorni. In questo modo, coltura le cellule per altri 10 giorni.

4. cova-TH1 cellule radiomarcatura

NOTA: Il 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb sarà applicata a cellule cova-TH1 coltivate per consentire marcatura radioattiva intracellulare.

  1. Per Cova-TH1 cell radiomarcatura, disegnare 37 MBq della radiomarcato 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb in una siringa senza volume morto con un calibratore di dosi. Aggiungere 1 ml di soluzione salina per ottenere una soluzione di 37 MBq / mL.
  2. Sospendere cellule cova-TH1 in mezzo a 2 x 10 6 cellule / ml e aggiungere 0,5 ml della sospensione cellulare in ciascun pozzetto in una piastra a 48 pozzetti.
  3. Aggiungere 20 ml di preparate 37 MBq / ml 64 soluzione Cu-DOTA-KJ1-26-mAb a ciascun pozzetto della piastra a 48 pozzetti. Il rapporto finale per l'etichettatura è 0.7 MBq per 10 6 cellule in un volume di 520 microlitri. Incubare a 37 ° C e 7,5% di CO 2 a 30 min.
  4. Dopo l'incubazione, risospendere accuratamente le cellule in ciascun pozzetto e trasferire la sospensione cellulare dalla piastra a 48 pozzetti in un 50 mL vite provetta con tappo. Per ridurre al minimo la perdita di cellule, lavare ogni pozzetto con media pre-riscaldato.
  5. Centrifugare la sospensione cellulare cova-TH1 a 400 xg per 5 min scartare il surnatante e risospendere le cellule in 10 ml di PBS preriscaldata. Rimuovere un aliquot di sospensione cellulare per il conteggio delle cellule. Ripetere la fase di lavaggio.
  6. Contare le celle Cova-TH1 vitali in una diluizione appropriata con trypan colorazione blu.
  7. Regolare la concentrazione cellulare di 5 x 10 7 cellule / ml per intraperitoneale (ip) iniezione di 10 7 cellule in 200 microlitri di PBS.
  8. Ripetere i passaggi 4,3-4,5 per radiomarcato cellule cova-TH1 con quantità crescenti di attività, ad esempio, 1,4 MBq o 2,1 MBq per 10 6 cellule.
    1. Per radiomarcato le cellule con 1,4 MBq per 10 6 cellule, utilizzare 40 ml di 37 MBq / ml 64 soluzione Cu-DOTA-KJ1-26-mAb e 60 microlitri di radiomarcatura con 2,1 MBq per 10 6 cellule. Eseguire i passaggi 4,3-4,7 con 0,7 MBq, 1.4 MBq e 2.1 MBq 64 Cu-PTSM ma aumentare il tempo di etichettatura per 3 ore per le indagini comparative 17.
    2. Procedere al passaggio 5 per determinare la quantità ottimale di attività.

5. In Vitro Valutazione dell'effetto del radiomarcato sulle Cellule Cova-TH1

NOTA: La caratterizzazione delle influenze di radiomarcatura sulle cellule TH1 avviene tramite saggio di esclusione del trypan blue per la vitalità, IFN-y ELISA per valutare la funzionalità e PE-annessina V colorazione per l'induzione di apoptosi 16, 17. Determinazione della captazione intracellulare e l'efflusso di radioattività è anche descritto di seguito. Come paragone, le cellule 64 Cu-PTSM marcato cova-TH1 possono anche essere utilizzati.

  1. Effetto sulla vitalità da trypan blu
    1. Regolare almeno 18 x 10 6 cellule cova-TH1 radiomarcati con 0,7 MBq / 10 6 cellule, 1,4 MBq / 10 6 cellule e 2,1 MBq / 10 6 cellule rispettivamente ad una concentrazione di 2 x 10 6 cellule / ml ed eseguire operazioni 5.1. 2-5.1.7 per ogni dose di attività. Utilizzare non radioactigià KJ1-26-mAb etichettato cellule cova-TH1 e cellule cova-TH1 non etichettati come controlli.
    2. Pipettare 1 mL di soluzione di cellule in 9 pozzetti di una piastra da 24 pozzetti.
    3. Raccogliere il contenuto di 3 pozzi in 3 separati 15 mL vite provette con tappo, 3 ore dopo radiomarcatura iniziale.
    4. Sciacquare i pozzetti ora vuote con media pre-riscaldato per minimizzare la perdita di cellule e aggiungere il mezzo di rispettivi 15 mL vite provette con tappo dal punto 5.1.3.
    5. Centrifugare le provette da 15 ml a 400 xg per 5 min e risospendere il pellet cellulare risultante in 1 ml di terreno di pre-riscaldato.
    6. Contare le cellule sia vitali e morti in blu tripan separatamente per ciascun tubo 15 ml e calcolare la percentuale di cellule vitali.
    7. Ripetere i punti 5.1.3-5.1.6 24 e 48 ore dopo 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb radiomarcatura.
  2. Effetti sulla funzionalità determinati da ELISA IFN-g
    NOTA: Per valutare l'effetto del 64 Cu-DOTA-KJ1 26-mAb radiomarcato on productio IFN-γn come marcatore di funzionalità, eseguire un ELISA IFN-γ da un fornitore commerciale e si riferiscono riferimento 17 per ulteriori dettagli.
    1. Disperdere 10 5 cellule vitali in 100 ml di mezzo in una piastra con 96 pozzetti, 3 ore dopo 64 Cu-DOTA-KJ1-26 radiomarcatura delle cellule cova-TH1 con 0.7, 1.4 MBq MBq o 2.1 MBq. Utilizzare, non radioattivi o 64 Cu-PTSM-etichettati cellule cova-TH1 non etichettati KJ1-26-mAb-etichettati come controlli.
    2. Stimolare la produzione di IFN-γ in 10 5 cellule cova-TH1 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marcato con 100 microlitri di media con 10 ug / ml di peptide cova, 5 U / mL di IL-2 e 5x10 5 cellule APC in 100 ml di terreno per 24 ore a 37 ° C e 7,5% di CO 2. Ulteriori controlli possono essere le altre condizioni senza l'aggiunta del peptide cova.
    3. Analizzare il surnatante tramite ELISA secondo le istruzioni del produttore.
    4. Ripetere il punto 5.2.2. a 5.2.3. a 24 e 48 ore dopo la procedura di etichettatura.
  3. Induzione di apoptosi determinato mediante PE-annessina V colorazione per citometria a flusso
    NOTA: Per determinare l'induzione dell'apoptosi da radiomarcato 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb, utilizzare un kit disponibile in commercio per citometria a flusso e preparare campioni di cellule secondo le istruzioni del produttore prima colorazione con Annessina V per fosfatidilserina esposizione sulla membrana cellulare .
    1. A 3, 24 e 48 ore dopo 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb radiomarcatura delle cellule cova-TH1, triplicato macchia con almeno 10 6 cellule cova-TH1 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marcati con il kit annessina V in base alle istruzioni del produttore e analizzare entro la prossima ora. Utilizzare non radioattivi KJ1-26-mAb-marcati, 64 celle cova-TH1 non etichettati Cu-PTSM-etichettate come controlli. Si prega di fare riferimento al riferimento 17 per ulteriori dettagli.
  4. Assorbimento e efflusso
    NOTA: L'assorbimento del 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb nelle cellule viene misurata in un calibratore di dose e l'efflusso di radioattività è misurata in un saggio di γ-conteggio 0, 5, 24, e 48 ore dopo la radiomarcatura.
    1. Preparare dieci tubi γ-conteggio ciascuna per 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-etichettati cellule cova-TH1, corrisponde al surnatante e la fase di lavaggio.
    2. Trasferimento 10 6 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marcato cellule cova-TH1 in 1 ml di terreno in ciascuna delle provette dieci γ-conteggio direttamente dopo la radiomarcatura. Per ciascuno dei punti di tempo 5, 24 e 48 h dopo la radiomarcatura, mantenere almeno 10 7 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-etichettati cellule cova-TH1 in terreno su piastre da 24 pozzetti di coltura cellulare in un incubatore a 37 ° C e 7,5% di CO 2.
    3. Centrifugare le provette γ-conteggio a 400 xg per 5 minuti e trasferire il surnatante in dieci nuovi tubi γ-conteggio.
    4. Lavare le cellule una volta in 1 ml di mezzo per rimuovere la frazione libera di 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb und raccogliere il surnatante in dieci nuovi tubi γ-conteggio.
    5. Aggiungi 1 ml nuovo mezzo alle cellule Cova-TH1 e determinare il valore di assorbimento iniziale in un calibratore di dose. I tubi possono anche essere memorizzati in un incubatore a 37 ° C e il 7,5% di CO 2.
    6. Ripetere i passaggi da 5.4.2 a 5.4.5, dopo 5, 24 e 48 ore e misurare tutti i tubi in un γ-counter secondo il protocollo del produttore. Per correggere decadimento radioattivo e per l'analisi quantitativa, usare uno standard con una dose definita di radioattività.

6. OVA indotta acuta Airway DTHR

NOTA: La dinamica migratori e sulle caratteristiche di homing di cellule radiomarcata cova-TH1 adoptively trasferito ed al sito di infiammazione verrà visualizzata e quantificata in un modello animale di cova indotta vie aeree-DTHR 16, 17.

  1. Iniettare 8 settimane di età topi BALB / c IP con una miscela di 150 ml aluminum gel / 50 microlitri cova soluzione (10 mg in 50 microlitri di PBS) per immunizzare topi.
  2. Due settimane dopo l'immunizzazione, anestetizzare i topi con 100 mg / kg di ketamina e 5 mg / kg xylazina mediante iniezione ip. Mettere i topi sperimentali sulle loro spalle e pipettare lentamente 100 mg Cova sciolto in 50 microlitri di PBS nelle narici degli animali. Gli animali saranno inalare il goccia a goccia soluzione.
  3. Ripetere dopo 24 ore. Per più forti induzioni vie aeree DTHR, ripetere nuovamente dopo 48 ore.
  4. Per analizzare la migrazione specifica delle cellule cova-TH1 trasferiti, indurre vie aeree-DTHR con tacchino o fagiano-OVA come controllo. Pertanto, ripetere i passaggi 6.1-6.3 utilizzando il rispettivo OVA-proteina.

7. In Vivo Imaging Utilizzando PET / CT

NOTA: imaging in vivo di 64 cellule cova-TH1 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-etichettati in cova-DTHR topi malati e controllo littermates dimostra l'homing specifico e la midinamica grazione delle cellule cova-TH1. Pertanto, acquisire scansioni PET statici e anatomiche TC sequenzialmente alberino trasferimento adottivo di cellule 3, 24 e 48 ore.

  1. Subito dopo radiomarcatura, regolare le Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-etichettati cellule cova-TH1 64 a 5 x 10 7 cellule / ml per iniezione ip di 10 7 cellule in 200 microlitri.
  2. Utilizzando una siringa da 1 ml e un ago da 30 gauge, disegnare 200 microlitri della sospensione cellulare cova-TH1 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marcato e iniettano le cellule IP nel animali cova-DTHR-malate tra il 4 ° e 5 ° capezzolo. Per determinare la quantità totale di radioattività iniettata, misurare la siringa in un calibratore di dosi prima e dopo l'iniezione.
  3. Anestetizzare i topi, 10 minuti prima del tempo di assorbimento desiderata, con 1,5% isoflurano in 100% di ossigeno (portata: 0,7 L / min) nel contenitore anestesia temperatura controllata.
  4. Nel frattempo, per facilitare la co-registrazionedi immagini PET e CT durante l'analisi dell'immagine, fissare capillari di vetro contenenti 64 soluzione Cu-DOTA-KJ1-26-mAb o libera soluzione 64 CuCl 2 sotto il letto del mouse.
    1. Pertanto, preparare una soluzione di 0,37 MBq / mL e riempire capillari di vetro con un volume di 10 ml con questa soluzione. Poiché i segnali radioattività derivati ​​dalle cellule sono intrinsecamente debole, non utilizzare quantità elevate di attività per assicurarsi che i marcatori non interferiscano con i segnali derivati ​​dalle cellule nei topi.
  5. Dopo aver raggiunto la tolleranza chirurgica, come indicato dalla perdita del riflesso pedale ritiro degli arti posteriori, trasferire il mouse per un piccolo animale base compatibile-CT PET-e dotato di un sistema di tubi adatti per mantenere l'anestesia.
  6. Immobilizzare il mouse sul piccolo letto animale con tamponi di cotone e nastro chirurgico. Applicare una pomata oculare per evitare l'essiccamento degli occhi.
  7. Trasferire il letto del mouse allo scanner PET, centrare il campo visivo con un focus sui polmoni e acquisire una PET statico 20 min con una finestra di energia di 350-650 keV.
  8. Trasferire il letto del mouse allo scanner CT. Via esploratore vista, centrare il campo di vista sui polmoni. Acquisire un'immagine planare CT con 360 proiezioni durante una rotazione di 360 ° in modo "step e scatta" con un tempo di esposizione di 350 ms e categorizzazione fattore 4.

Analisi 8. Immagine

  1. Ricostruire i dati in modalità elenco PET applicando algoritmo iterativo 2D statistica ordinata sottoinsieme aspettativa massimizzazione (OSEM) e TC in un'immagine 3D con dimensioni pixel di 75 micron.
  2. Per un'immagine co-registrazione in un apposito software di analisi di immagine (ad esempio Inveon ricerca del posto di lavoro o Pmod), utilizzare lo strumento di co-registrazione automatica. Se ciò non riesce, utilizzare i capillari di vetro sotto il letto del mouse come guida di co-registrare le immagini PET e CT ricostruiti spazialmente in direzione assiale, coronale e sagittale.
  3. Correggere le immagini PETper decadimento radioattivo utilizzando la legge decadimento radioattivo e il primo tempo del radionuclide 64 Cu 12,7 h. Per immagine normalizzazione, scegliere un'immagine (A) come riferimento e regolare l'intensità della visualizzazione delle immagini nel rispettivo software di analisi dell'immagine.
    1. Utilizzando i valori appena impostati per l'immagine di riferimento (A), l'attività iniettata (A) e la dose iniettata per le altre immagini (X), normalizzare le altre immagini utilizzando la seguente equazione: (attività iniettata (X) / attività iniettata ( A)) x valori di intensità (A).
  4. Disegnare volumi 3D di interesse (VOI) sul segnale PET normalizzato dei LNS polmonari e perithymic.
  5. Determinare la dose iniettata percentuale per cm 3 (% ID / cm 3) mediante la seguente equazione: (media attività VOI / attività complessiva nel topo) x 100. Per ulteriori orientamenti relativi analisi dell'immagine, vedere i riferimenti 22, 23.

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Risultati

Figura 1 riassume l'etichettatura di cellule cova-TH1 con il 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb e il disegno sperimentale per l'in vitro ed in vivo contemplati in questo protocollo.

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Figura 1: 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb etichettatura Process & Experimental Design. (A) Rappr...

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Discussione

Questo protocollo presenta un metodo affidabile e facile da radiomarcato stabilmente cellule per il monitoraggio in vivo mediante PET. Utilizzando questo metodo, le cellule cova-TH1, isolate ed espanse in vitro da donatore topi, potrebbe essere radiomarcato con 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb e il loro homing è stato rintracciato alle LNs polmonari e perithymic come siti di presentazione Cova in un cova indotta DTHR vie respiratorie acute.

La modifica del mAb con il chelan...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano il Dr. Julia Mannheim, Walter Ehrlichmann, Ramona Stumm, Funda Cay, Daniel Bukala, Maren Harant così come Natalie Altmeyer per il sostegno durante gli esperimenti e analisi dei dati. Questo lavoro è stato supportato dal Werner Siemens-Fondazione, la DFG attraverso lo SFB685 (progetto B6) e Fortune (2309-0-0).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
HCl, SuprapurMerck, Darmstadt, Germania1.0031864Cu produzione
Metanolo, SuprapurMerck, Darmstadt, Germania1.0600764Cu produzione
Isopropanolo, SuprapurMerck, Darmstadt, Germania1.0104<sup>64Cu produzione
Pt/Ir (90/10) piastraÖ gussaCustom made64Cu
produzione Camera in PEEKWKLCustom made64Cu produzione
64NiChemotrade64Cu
produzione Polygram SIL G/UV 254 piastraMacherey-Nagel80502164Cu
produzione Scambio ionico colonnaBioRadAG1-X8<sup>64Cu
produzione Sistema target a stato solido per PETtraceWKLcostum made64Cu production
64Cu work-up moduloWKLcostum made64Cu
produzione Calibratore di doseCapintecCRC-25R
PETtrace ciclotroneGeneral Electric Medical Systems
DOTA-NHSMacrocyclicsB-280Coniugazione DOGA
Anticorpo anti-cOVA-TCR (KJ1-26)Isolato da coltura cellulare di ibridomaConiugazione DOTA
Na2HPO4Sigma-Aldrich71633Coniugazione DOTA
H+ Chelex 100Sigma-AldrichC7901Coniugazione DOGA
Unità filtrante Amicon Ultra-15Merck MilliporeUFC910008Coniugazione DOTA
Acqua ultrapura RotipuranCarl RothHN68.3Coniugazione DOGA
Acetato di ammonioSigma-Aldrich32301Coniugazione DOTA
PBSUniversità di TubingaConiugazione DOTA
Micro Bio-spin Colonna P-6Laboratori Bio-Rad 7326221Coniugazione DOTA
Citrato di sodioSigma-Aldrich71497Ciclone di coniugazione DOGA
Plus PhosphorImager Perkin-ElmerL2250116coniugazione DOTA
DMEMMerck Millipore102568ingrediente per il terreno delle cellule T.
FCSMerck MilliporeS0115/1004Bingrediente per terreno a cellule T 
Piruvato di sodioMerck MilliporeL0473ingrediente per terreno di cellule T
Aminoacidi MEMMerck MilliporeK0293ingrediente per il terreno delle cellule T
HEPES Merck MilliporeL 1613ingrediente per terreno a cellule T
  Penicillina/StreptomicinaMerck MilliporeA2212ingrediente per il terreno delle cellule T 
0,05 mM 2-β-mercaptoetanoloSigma-AldrichM3148ingrediente per terreno di coltura a cellule T 
DO11.10 topiallevamento internoColtura cellulare TH1
DPBSGibco14190144Coltura cellulare TH1
Filtro cellulare 40 &; m Corning352340Coltura cellulare TH1
ACK Lysing BufferLonza10-548EColtura cellulare TH1
CD4 MicroBeads, topoMiltenyi Biotech130-097-145Coltura cellulare TH1
Separatore QuadroMACSMiltenyi Biotech130-090-976Coltura cellulare TH1
Colonna LSMiltenyi Biotech130-042-401Coltura
anticorpo anti-CD4 (Gk1.5)Isolato da coltura cellulare di ibridomaColtura cellulare TH1
anticorpo anti-CD8 (5367.2)Isolato da coltura cellulare di ibridomaColtura cellulare TH1
Anticorpo anti-ratto (MAR18.5)Isolato da coltura cellulare di ibridomaColtura cellulare TH1
Complemento di coniglio MAtebu-BioCL3221Coltura cellulare TH1
Anti-IL-4 anticorpo (11B11)Isolato da coltura cellulare di ibridomaColtura cellulare TH1
cOVA 323-339-peptide EMC-micro-collezioniOrdine personalizzatoColtura cellulare TH1
CPG1668-oligonucleotidiEurofins MWG Operone OrdinepersonalizzatoColtura cellulare TH1
IL-2Novartis65483-116-07Coltura cellulare TH1
Piastre a 96 pozzettiGreiner 655180Piastre per colture cellulari TH1
24 pozzettiGreiner 662160Pallone per colture cellulari TH1
Greiner 660175per colture cellulari TH1
Greiner 677 180etichettatura cellulare
Gammacell 1000Best Theratronicsvia inchiesta 
Gulmay RT225Gulmayvia inchiesta 
Trypan bluMerck MilliporeL6323in vitro valutazione
Mouse IFN-γ ELISABD Biosciences558258in vitro
valutazione PE Annexin V Kit di rilevamento dell'apoptosiBD BiosciencesValutazione 559763in vitro
Provetta 5 mLSarstedt55.476<em>in vitro Valutazione
Provette a fondo tondo BD Biosciences352008in vitro valutazione
Wizard γ-counterPerkin-Elmer2480-0010in vitro valutazione
ELISA Reader MultiscanEXThermo Fisher Scientific51118177in vitro
MicroscopioLeicavia inchiesta Valutazione in vitro
BD LSRII Inchiesta BD Biosciencesviain vitrovalutazione
BALB/c topiCharles River028in vivo traffico cellulare
Gel di alluminioServa Elettroforesi12261.01in vivo traffico cellulare
XilazinaBayer HealthCareOrdinato via Ospedale universitarioin vivo traffico cellulare
KetamineRatiopharmOrdinato via Ospedale universitarioin vivo traffico cellulare
IsofluraneCP-PharmaOrdinato via Ospedale universitarioin vivo traffico cellulare
Ago da 30 GBD Biosciences304000in vivo traffico cellulare
SiringaBD Biosciences11612491in vivo traffico cellulare
Capillari 10 &; LVWR612-2439
Scanner PET InveonSiemens Healthineersnon più disponibilein vivo traffico cellulare, aziende alternative: Bruker, Mediso 
Scanner Inveon SPECT/CTSiemens Healthineersnon più disponibilein vivo traffico cellulare
Inveon Research WorkplaceSiemens Healthineers, software alternativo: Pmod
cellulare TH1a Piastre a 48 pozzetti Analisi delle immagini

Riferimenti

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