Qui, presentiamo un metodo per la creazione di un sistema rapido in vitro che supporta la coltura tridimensionale e la successiva differenziazione luminale delle cellule epiteliali primarie della prostata.
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Articolo metodologico
Un sistema di coltura 3D Rapid Cartuccia filtro-based per la prostata primaria cellulare Differenziazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
le cellule riprogrammate condizionale (CRC) forniscono un metodo sostenibile per la coltura di cellule primarie e la capacità di sviluppare ampie "biobanche di vita" di pazienti derivate linee cellulari. Per molti tipi di cellule epiteliali, vari approcci tridimensionale (3D) di coltura sono stati descritti che supporta uno stato differenziato migliorata. Mentre CRC mantengono la loro lineage committment al tessuto dal quale sono isolati, non riescono ad esprimere molti dei marcatori di differenziazione associate al tessuto di origine quando coltivate in normali due condizioni dimensionali (2D) di coltura. Per migliorare l'applicazione della CRC paziente-derivato per la ricerca sul cancro alla prostata, un formato di cultura 3D è stato definito che consente una rapida luminale differenziazione cellulare (2 settimane in totale) in entrambe le cellule epiteliali della prostata normali e tumorali di derivazione. Qui, un formato basato su inserto del filtro è descritto per la coltura e differenziazione di entrambe le normali e maligni CRC prostata. A deDescrizione coda delle procedure richieste per la raccolta delle cellule e di elaborazione per la colorazione immunoistochimica e immunofluorescenza sono forniti. Collettivamente formato coltura 3D descritto, in combinazione con le linee CRC primari, fornisce un importante medio per evidenziare sistema modello produttività per la ricerca della prostata biospecimen-based.
Introduzione
L'identificazione e l'uso di terapie del cancro che sono personalizzati per gli individui sono un obiettivo primario nella ricerca sul cancro. Recentemente, sono stati sviluppati nuovi approcci che consentono una maggiore facilità nella creazione di colture cellulari primarie, fornendo potenzialmente modi sia di identificare e testare terapie personalizzate. Ad esempio, la prostata basata R-spondina approccio organoide 1 consente tridimensionale (3D) coltura di normali e metastatici cellule tumorali della prostata in una matrice extracellulare commerciale (ad esempio, Matrigel), mentre il metodo condizionale riprogrammazione d....
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Protocollo
1. Istituzione del Cell 3D cultura sistema di inserimento
- Posizionare inserti colture cellulari 2 policarbonato in un orientamento invertita (lato filtro verso l'alto) verso il basso in un piatto ben 6 (Figura 1A).
- Applicare uno strato sottile di 0,1% di gelatina in acqua al lato inferiore dell'inserto e lasciare asciugare (10-20 min) in una cappa di sicurezza biologica per mantenere la sterilità.
- Ripetere passaggio 1.2 altre due volte per un totale di 3 applicazioni di 0,1% di gelatina sugli inserti.
NOTA: Il rivestimento di gelatina aiuterà diffusione limite tra le camere. - Per raccogliere i CR....
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Risultati
Il sistema basato su inserto coltura cellulare è una procedura relativamente semplice e rapida per la produzione di colture 3D di CRC prostata che supporta la differenziazione delle cellule del lume. Uno schema del sistema è mostrato (Figura 1A) evidenziando l'applicazione del rivestimento di gelatina alla superficie inferiore della cartuccia filtrante. Gli inserti sono ribaltati solo per l'applicazione della gelatina. Nella Figura 1B i filtri so.......
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Discussione
linee cellulari primarie sono una piattaforma importante e in rapido sviluppo per la ricerca sul cancro. Il sistema di coltura 3D basato su inserto cultura sostiene la differenziazione della prostata CRC primari entro un lasso di tempo di due settimane. Il metodo del filtro CRC rappresenta un nuovo metodo di media produttività per la ricerca della prostata. Esistenti modelli del mouse PDX sono in termini di tempo ed estremamente costoso, e molti dei campioni PDX non possono essere coltivate in cultura, limitando la sper.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata sostenuta da T32 (CA 9686-18) e TL1 (TL1TR001431) premi post-dottorato borsa di formazione (LT), DOD PC140268 (CA), W81XWH-13-1-0327 (CA) TR000102-04 (CA), così come U01 PAR-12-095 (Kumar) e P30 CA051008-21 (Weiner). la fissazione del campione, sezionamento e colorazione è stata eseguita nel Lombardi Comprehensive Cancer Center e Istologia del tessuto Shared Resource. Ringraziamo Richard Schlegel per le discussioni utili. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Cancer Institute e il National Institutes of Health.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Inserti per colture Corning Costar Snapwell Corning | 3801 | ||
| Millicell Inserti per colture cellulari | Millipore | PIHP01250 | |
| Multiwell 6 pozzetti | Falcon | 353046 | |
| Gelatina 0,1% in acqua | Stemcell Technologies | 7903 | |
| Sterile Saftey Scapel 10 Blade | Integra Miltex | 4-510 | |
| Bisturi Standard Sterile 11 Lame | Integra Miltex | 4411 | |
| RIPA Tampone di Lisi ed Estrazione | Thermofisher Scientific | 89900 | |
| Fluoruro di Sodio | Fishcer Scientific | S299-100 | |
| Vanadato di Sodio | Fishcer Scientific | 13721-39-6 | |
| Ditiotreitolo | Sigma-Aldrich | 3483123 | |
| Cocktail di inibitori della proteasi (AEBSF, aprotinina, bestatina, E-64, lepeptina e pepstatina A) | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| 0,25% tripsina-EDTA (1x) | Thermofisher Scientific | 25200-056 | |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965-092 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Glutammina | Thermofisher Scientific | 25030081& nbsp; | |
| Penicillina Streptomicina | Thermofisher Scientific | 15140-122 | |
| F-12 Nutrienti Mix Media | Thermofisher Scientific | 11765054 | |
| Y-27632 dicloridrato Acido inibitore della roccia | Enzo | ALX-270-333-M025 | |
| Idrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| EGF | Thermofisher Scientific | PHG0315 | |
| Insulina | Thermofisher Scientific | 12585-014 | |
| Tossina colera | Sigma-Aldrich | C3012 | |
| Gentamicina | Thermofisher Scientific | 15710-064 | |
| Fungizone | Fisher Scientific | BP264550 | |
| Reagente Trizol | Invitrogen | 15596026 | |
| Histogel Specimen Processing Gel ( idrossietilagarosio (HEA)) | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Medicazione non aderente | Telfa | KDL2132Z | |
| Piatto per colture cellulari Sigma | SIAL0167 | ||
| HISTOSETTE II Cassette di elaborazione / inclusione dei tessuti | Crystalgen | CG-M492 |
Riferimenti
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. J Clin ....
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Ristampe e permessi
