lesioni al fegato sono accompagnate da espansione di cellule progenitrici che rappresenta una popolazione cellulare eterogenea. Classificazione Novel di questo compartimento cellulare consente di distintivo più sottoinsiemi. Il metodo qui descritto illustra l'analisi citofluorimetrica ed elevato isolamento purezza vari sottogruppi che possono essere utilizzati per ulteriori analisi.
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Articolo metodologico
L'isolamento e arricchimento di fegato progenitrici sottoinsiemi identificati da un marcatore combinazione romanzo di superficie
In questo articolo
Sommario
Abstract
Durante lesioni croniche del fegato, cellule progenitrici espandono in un processo chiamato reazione duttulare, che comporta anche la comparsa di infiltrato cellulare infiammatorio e l'attivazione delle cellule epiteliali. La popolazione di cellule progenitrici durante tali reazioni infiammatorie è stato per lo più studiata utilizzando marcatori di superficie singoli, sia per l'analisi istologica o con tecniche di citometria a base di flusso. Tuttavia, nuovi marcatori di superficie identificati vari sottoinsiemi funzionalmente distinte all'interno del progenitore di fegato / stelo vano cella. Il metodo presentato qui descrive l'isolamento e il flusso dettagliata analisi di citometria di sottoinsiemi progenitrici utilizzando combinazioni marcatori romanzo di superficie. Inoltre, dimostra come i vari sottogruppi di cellule progenitrici possono essere isolati con metodi di elevata purezza con modalità automatizzate magnetico e FACS ordinamento-based. Importante, novel ed enzimatica semplificato dissociazione del fegato consente l'isolamento di queste popolazioni cellulari rare con un'alta redditivitàche è superiore rispetto ad altri metodi esistenti. Questo è particolarmente rilevante per studiare ulteriormente cellule progenitrici in vitro o per isolare l'RNA di alta qualità per analizzare il profilo di espressione genica.
Introduzione
la rigenerazione del fegato è principalmente associato con la capacità di auto-rinnovamento degli epatociti. Tuttavia, le lesioni croniche del fegato si verificano con l'attivazione delle cellule progenitrici e di espansione, che sono stati associati con la loro capacità di differenziarsi in epatociti e colangiociti 1, 2, 3, 4. Questo è particolarmente rilevante in quanto, durante lesioni croniche, epatociti proliferazione non è efficace. Nonostante diversi studi di tracciabilità genetica di targeting cellule progenitrici, il loro ruolo....
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Protocollo
Tutte le procedure sperimentali sono state condotte con l'approvazione dei comitati di etica e cura degli animali di Homburg University Medical Center.
1. Preparazione dei Materiali e tamponi
- Appena preparare tutti i buffer necessari per la digestione fegato utilizzando componenti sterili e una cappa laminare per evitare la contaminazione batterica.
- Preparare il tampone di raccolta (CB) mescolando 49,5 ml di terreno RPMI e 0,5 ml di siero bovino fetale (FBS, bassa endotossina, inattivati al calore) per ottenere una soluzione all'1% (v / v). Conservare la soluzione in ghiaccio fino a nuovo uso.
NOTA: C....
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Risultati
La procedura qui presentata per la digestione del fegato utilizzando una nuova miscela di enzimi risultati in una cella singola sospensione contenente parenchimali e le cellule epatiche non parenchimali (Figure 1 e 2a). Dopo l'ACK-lisi dei globuli rossi, il flusso diretto analisi di citometria di cella singola sospensione è possibile (figure 1 e 2). La strategia di gating comporta l'esclusione di doppietti e cell.......
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Discussione
Infiammazione del fegato e lesioni di diversa origine innescano processi rigenerativi del fegato che sono accompagnati da espansione di cellule progenitrici e l'attivazione 2, 3. Queste cellule progenitrici epatiche possiedono staminali caratteristiche cellulari e probabilmente svolgono un ruolo significativo nel meccanismo patogenetico di varie malattie del fegato.
L'eterogeneità delle cellule progenitrici epatiche è stato a.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Alexander von Humboldt Sofja Kovalevskaja premio per VLK.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| RPMI | Life Technologies | 21875-034 | |
| senza rosso fenolo DMEM | Life Technologies | 31053-028 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Collagenasi P | Sigma-Aldrich | 11249002001 | |
| DNAse-I | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dispase | Life Technologies | ||
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Sodio azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Preparare una soluzione madre all'1 |
| % 10% BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| autoMACS Soluzione di risciacquo | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | aggiungere lo 0,5% (v/v) BSA e conservare in ghiaccio |
| DMEM privo di rosso fenolo | Sigma-Aldrich | D1145 | |
| conteggio delle perle Bright | Life Technologies | C36950 | |
| PI | Miltenyi Biotec | 130-093-233 | |
| Reagente bloccante FcR | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| Microsfere anti-CD31 | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| Microsfere anti-CD45 | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Kit di rimozione delle cellule morte | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| Microsfere anti-biotina | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| CD64 BioLegend purificato | 139302 | Diluizione: 1:100 | |
| CD16/32 | BioLegend | purificato 101302 | Diluizione: 1:100 |
| CD45 APC/Cy7 | BioLegend | 103116 | Diluizione: 1:200, marcatura delle cellule ematopoietiche |
| CD31 Biotina | BioLegend 102504 | Diluizione: 1:200, marcatura delle cellule endoteliali | |
| ASGPR1 Bio-Techne purificato | AF2755-SP | Diluizione: 1:100, marcatura degli epatociti | |
| Podoplanina APC BioLegend | 127410 | Diluizione: 1:1.400, marchia le cellule progenie | |
| Podoplanina Biotina BioLegend | 127404 | Diluizione: 1:1.400 | |
| CD133 PE | Miltenyi Biotec | 130-102-210 | uso 3 &; L, marchia le cellule progenitrici |
| CD133 | Biotina | BioLegend 141206 | Diluizione: 1:100 |
| CD34 Biotina | eBioScience | 13-0341-81 | Diluizione: 1:100 |
| CD90.2 Pacific Blue | BioLegend | 140306 | Diluizione: 1:800 |
| CD157 PE | BioLegend | 140203 | Diluizione: 1:600 |
| EpCAM Brilliant Violet 421 | BioLegend | 118225 | Diluizione: 1:100 |
| Sca-1 Biotina | Miltenyi Biotec | 130-101-885 | uso 10 µ L |
| IgG2b del topo, κ PE | BioLegend | 400311 | |
| IgG1 di ratto PE | BioLegend | 400407 | |
| IgG2b di ratto, κ APC/Cy7 | BioLegend | 400624 | |
| IgG2a di ratto, κ Biotina | BioLegend | 400504 | |
| IgG2a di ratto, κ Brilliant Violet 421 | BioLegend | 400535 | |
| Criceto Siriano IgG APC | BioLegend | 402012 | |
| Criceto Siriano IgG Biotina | BioLegend | 402004 | |
| Normale Controllo IgG di Capra Purificato | Bio-Techne | AB-108-C | |
| Asino anti-Capra IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11055 | Diluizione: 1:800 |
| Streptavidina Alexa Fluor 405 | Life Technologies | S32351 | Diluizione: 1:400 |
| 100 &; m Rete filtrante | A. Hartenstein | PAS3 | |
| LS Colonna | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Separatore QuadroMACS | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Analizzatore MACSQuant 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| Separatore AutoMACS Pro | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FACS AriaTMIII | BD Biosciences | ||
| FACSDiva sofware | BD Biosciences | ||
| di lisi è incluso | |||
Riferimenti
- Dolle, L., et al. Successful isolation of liver progenitor cells by aldehyde dehydrogenase activity in naive mice. Hepatology. 55 (2), 540-552 (2012).
- Dolle, L., et al. The quest for liver progenitor cells: a practical point of view. J ....
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