Articolo metodologico

Valutare l'effetto delle sostanze chimiche ambientali su Honey Bee sviluppo dall'individuo alla colonia Livello

DOI:

10.3791/55296

⸱

1 aprile 2017

 ,  , 
1Department of Biotechnology and Animal Science, National Ilan University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui vi presentiamo un metodo per alimentare antiparassitario alimenti contaminati sia un individuo ape e una colonia alveare. La procedura valuta l'effetto dei pesticidi sulle singole api mellifere in vivo l'alimentazione della dieta larvale di base e anche la condizione naturale della colonia dell'alveare.

Abstract

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La presenza di pesticidi nell'ambiente dell'apicoltura è uno dei problemi più seri che influisce sulla vita di un'ape mellifera. I pesticidi possono essere riportati all'alveare dopo che le api si sono nutrite di fiori che sono stati spruzzati con pesticidi. Il cibo contaminato da pesticidi può essere scambiato tra le operaie, che poi nutrono le larve e quindi possono potenzialmente influenzare lo sviluppo delle api mellifere. Pertanto, i pesticidi residui nell'ambiente possono diventare un fattore dannoso cronico per le popolazioni di api mellifere e portare gradualmente al collasso delle colonie. Nel protocollo presentato, i metodi di alimentazione delle api mellifere sono descritti e applicati a una singola ape mellifera o a una colonia. Qui, il regolatore della crescita degli insetti (IGR) piriproxifene (PPN), che è ampiamente utilizzato per controllare gli insetti nocivi ed è dannoso per lo sviluppo delle larve e delle pupe delle api mellifere, viene utilizzato come pesticida. La procedura di presentazione può essere applicata ad altre sostanze chimiche potenzialmente dannose o agenti patogeni delle api per ulteriori studi.

Introduzione

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La presenza di pesticidi nell'ambiente è uno dei problemi più gravi che l'impatto della vita di un'ape 1, 2, 3. Diversi studi hanno dimostrato la presenza di residui di pesticidi comuni in colonie di api mellifere e prodotti delle api. A Taiwan, l'applicazione di pesticidi media era 11-12 kg / ha ogni anno (2005-2013). La quantità di pesticidi utilizzati a Taiwan è superiore a quella dei paesi dell'UE, ei paesi dell'America Latina 4, 5. In altre parole, l'ambiente all'apicoltura sta soffrendo gravi sollecitazioni di pesticidi, soprattutto a Taiwan e forse anche in altri paesi.

Il miele ape mellifera è uno dei principali impollinatori nei sistemi agricoli 6 e produce anche prodotti pregiati come miele. Tuttavia, le api sono manifestazioniEd a vari pesticidi e questi pesticidi può essere riportato al alveari dopo foraggiamento sui fiori che sono stati spruzzati con pesticidi quando si raccolgono nettare e polline 7, 8. Essi inoltre possono essere esposti ai pesticidi dagli apicoltori stessi che mirano a controllare i problemi dei parassiti all'interno delle arnie 9, 10, 11. Perché il miele delle api larve sono alimentati da api nutrici per il loro sviluppo, le larve, droni e perfino la regina può essere esposto a questi nettari pesticidi contaminati e polline 12. La tossicità dei vari pesticidi per le api deve essere affrontato 13.

Molti sforzi sono stati fatti per valutare le emissioni di residui di pesticidi ambientali. Yang et al. testato l'influenza del imidacloprid insetticidi neurotossici sullo sviluppo di miele delle api larve nelalveare e ha riferito che una dose sub-letali di imidacloprid ha provocato un comportamento associativo olfattiva delle api adulte 14. Inoltre, Urlacher et al. ha esaminato gli effetti sub-letali di una pesticidi organofosfati, clorpirifos, sulle prestazioni di apprendimento un miele di ape operaia in condizioni di laboratorio 15. Nel nostro studio precedente, abbiamo valutato l'impatto di un regolatore di crescita degli insetti (IGR), piriprossifen (PPN), su api da miele larvali 16.

In questo documento, presentiamo metodi per valutare gli effetti chimici sullo sviluppo delle api. Miele metodi di alimentazione ape sono stati descritti ed applicati sia singole api mellifere o ad una colonia. In un primo momento, abbiamo provato diverse concentrazioni di pesticidi contaminato dieta larvale di base (BLD) di larve nelle colonie per valutare l'impatto del pesticida sulle singole api mellifere in vivo. Si è quindi proceduto a simulare la Condit naturaliioni del pesticida utilizzando lo sciroppo di pesticidi contaminati all'interno di alveari. In questo metodo, PPN, che è ampiamente usato contro insetti parassiti 17 ed è dannoso per lo sviluppo di miele api larve e pupe 16, 18, 19, sarà un indicatore per rappresentare l'effetto negativo del pesticida nel campo.

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Protocollo

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1. preparativi

  1. Fare 1 L di 50% sciroppo di zucchero. Sciogliere 1 kg saccarosio in 1 L DDH 2 O.
  2. Preparare la soluzione piriprossifen (PPN) in BLD. Rendere 1,1 L di 10.000 ppm PPN soluzione madre e diluire 100 ml di soluzione PPN in 1 L sterilizzato DDH 2 O. Conservare a 4 ° C.
  3. Diluire la soluzione madre PPN a concentrazioni finali di 0,1, 1, 10 e 100 mg / kg (ppm) nella BLD per il seguente esperimento.
  4. Fare PPN-sciroppo (per il livello di colonia). Diluire il brodo PPN a concentrazioni finali di 10 e 100 ppm nel 50% sciroppo di zucchero per il seguente esperimento.
  5. Il miele delle api allevamento.
    Nota: Qui, la posizione sperimentale è l'apiario nazionale Ilan University (NIU), Yi-Lan City, Taiwan; (Coordinate GPS: N24.747278, E121.746200).
    1. Controllare miele ape (Apis mellifera L.) colonie settimanale per quantità di alimenti e mangimi con 1 litro di sciroppo di zucchero 50%, se necessario (l'area di memorizzazione miele è vuoto). Definire un sanocolonia 9 fotogrammi di pettini api in ogni colonia con una regina che le uova normalmente.
  6. Preparare 100 ml di dieta larvale di base (BLD). Sciogliere 6% D-glucosio, fruttosio 6% e 1% di estratto di lievito in acqua deionizzata distillata sterilizzata (DDH 2 O) e integra con il 50% gelatina reale. Conservare a 4 ° C, ma non per più di 3 giorni.
    Nota: Pre-caldo a 35 ° C prima dell'esperimento e consumare entro 3 giorni.

2. In Vivo metodo di alimentazione

Nota: In vivo metodo di alimentazione è stato modificato da Hanley et al. 20

  1. Il miele delle api selezione larve e l'etichettatura.
    1. Inserire un escludi regina dividere 9 fotogrammi di una colonia sana in 4 frame e 5 fotogrammi limitando la regina alla sezione 4 telaio. Lasciare almeno un fotogramma vuoto nella sezione 4 telaio per la posa delle uova.
    2. Dopo la regina deporre le uova per 1 giorno, Controllare i telai per la comparsa di uova e mantenere le uova all'interno delle arnie per 72 ore (il 4 ° giorno) fino al 1 ° giorno di vita schiusa delle larve. Prendete una delle cornici contenenti 1-giorni di età le larve dei lavoratori (tratteggiata entro 24 ore) fuori dall'alveare di prova a mano e togliere i lavoratori api dal telaio con una spazzola ape.
    3. Coprire il telaio con un vetrino trasparente (Formato = lunghezza x larghezza x spessore = 29,7 millimetri x 21 mm x 0,1 mm) e inchiodare il vetrino trasparente sul bordo dei telai con puntine (Figura 1A).
    4. Per ogni trattamento, selezionate casualmente 50 una larva di un giorno (il 4 ° giorno) e contrassegnare ciascuna cella covata utilizzando pennarelli permanenti sul vetrino trasparente (Figure 1A e 1B).
      Nota: scrivere l'informazione di ogni trattamento sul telaio e scorrevole trasparente nonché utilizzando pennarelli permanenti per evitare la confusione tra diversi trattamenti. Rimuovere i vetrini segnalati e conservare per l'in vivo </ Em> alimentazione e osservazione.
  2. Nell'alimentazione vivo.
    1. Aggiungere diverse concentrazioni di PPN-BLD (0,1, 1, 10 e 100 ppm) a ciascuna cella covata marcato pipettando al giorno 1, 2 e 3 con 10 microlitri, 10 microlitri e 20 uL, rispettivamente, secondo la quantità di aspirazione del età larve. Aggiungere la stessa quantità di BLD (senza PPN) ad un gruppo di controllo. In tal modo, la dose totale di PPN-BLD in ogni cella covata etichettati accumula 4, 40, 400, e 4000 pg.
      NOTA: Riconoscere le celle di covata etichettati dai vetrini trasparenti segnalati e rimuovere i vetrini trasparenti selezionati dopo l'alimentazione. Utilizzare fresco BLD per l'alimentazione per prevenire la pulizia delle celle di covata dalle api operaie.
    2. Riportare i telai PPN-trattati nelle colonie originali per ulteriori osservazioni.
      NOTA: Ogni trattamento ha quattro ripete biologici in quattro colonie.
  3. L'osservazione delle larve trattate al giorno 7.
    1. Per osservare °larve e PPN-trattati, restituire le diapositive trasparenti etichettati ai telai per registrare la mortalità e tassi di tappatura nelle celle di covata etichettati.
  4. L'osservazione dei tassi di pupe e Eclosion trattati a giorno 13.
    1. Rimuovere la cera d'api di celle di covata innevate.
    2. Mettere le pinzette morbida capovolti nella cella di covata e serrare le pupe leggermente poi prendere pupe con delicatezza.
    3. Trasferire il pupe in piastre da 24 pozzetti di coltura tissutale con un doppio strato di tessuto di laboratorio sotto ogni pozzetto. Registrare il danno e la mortalità durante il trasferimento di pupa.
    4. Mantenere le piastre da 24 pozzetti di coltura tissutale in un incubatore a 34 ° C e 70% di umidità relativa fino emergere (circa 8 giorni).
    5. Osservare e registrare le pupe e api mellifere emerse.
  5. statistica
    1. Calcolare i dati registrati e presente come media ± SD
    2. Analizzare i dati utilizzando l'analisi della varianza (ANOVA) da SAS e utilizzare il test minima differenza significativa (LSD) per analizzare le differenze tra due mezzi diversi trattamenti. Definire statisticamente significativo come P -value <0.05. Lettere diverse nella stessa colonna della tabella mostrato un effetto significativo dall'analisi statistica.

3. Tossicità dei PPN a Colony Livello nella Beehive

  1. Impostare i gruppi di api.
    1. Inserire un escludi regina verticalmente dividere 9 fotogrammi di una colonia sana in 4 fotogrammi (parte A) e 5 fotogrammi (parte B), limitando la regina alla sezione 4 telaio. Lasciare almeno un fotogramma vuoto nella sezione 4-struttura per la deposizione delle uova.
      Nota: In altre escludi-regina del sulla parte superiore della parte della regina per evitare che la regina di muoversi tra le parti.
    2. Dopo la regina deporre le uova per 1 giorno, controllare i telai per la comparsa di uova. Prendere i fotogrammi appropriati contenenti uova fuori dalla parte A a mano e togliere i lavoratori apidal telaio con una spazzola ape.
    3. Coprire il telaio con scivolo trasparente e inchiodare il vetrino trasparente al bordo del telaio con puntine.
    4. Selezionare casualmente 100 celle di covata contenenti uova e contrassegnare ciascuna cella covata utilizzando pennarello indelebile sul vetrino trasparente. Assegnare queste celle di covata 100 come gruppo 1. scrivere le informazioni di ciascun trattamento sul telaio e scorrevole trasparente con pennarello indelebile per evitare la confusione tra diversi trattamenti.
    5. Riportare la cornice etichettati per parte A per 3 giorni e poi trasferire la regina parte B per deporre le uova.
    6. Dopo 1 giorno, controllare i fotogrammi di parte B, scegliere una cornice adeguata ed etichetta 100 celle di covata contenenti uova come descritto al punto 3.1.4. Assegnare queste celle di covata 100 come gruppo 2.
    7. Riportare la cornice etichettati per parte B per 3 giorni e poi trasferire la regina alla parte A per deporre le uova.
    8. Ripetere lo scambio regina tra le parti A e B 6 volte di più e assegnare gruppi numericamente,rispettivamente (Figura 2). Ci dovrebbe essere totale di 9 gruppi.
  2. T miele reat colonia di api con PPN sciroppo di zucchero al giorno 13 (Figura 2).
    1. Aggiungere 1 L 50% PPN sciroppo di zucchero contenenti 10 o 100 ppm in una cassa di alimentazione ape plastica (L x L x H = 20 cm x 30 cm x 3,5 cm) e mettere la scatola in cima delle cornici nelle colonie sperimentali.
      Nota: Gruppo 1 non riceve il PPN a 13 giorni, come le celle di covata sono stati sigillati.
    2. Alimentare il gruppo di controllo con 1 L 50% di sciroppo di zucchero (senza PPN) come descritto al punto 2.2.
  3. Conta 1 giorno di età larve e record come il tasso di schiusa dell'uovo di 100 cellule marcate covata per ciascun gruppo a giorno 5 (Figura 2). Miele api uova di solito prendere 3 giorni per schiudersi in 0 giorni larve; quindi, controllare e etichettare 100 uova-contenenti celle di covata al giorno 1 e contare il numero di 1 giorno di età larve per ogni gruppo di giorno 5 per ottenere la percentuale di schiusa tasso.
  4. CMONTAGGIO DEL celle di covata ricoperti e registrare come il tasso massimo larvale di 100 cellule marcate covata per ciascun gruppo a giorno 11 (Figura 2). 6 a 7 celle di covata larvale di un giorno saranno ricoperti con cera d'api da parte dei lavoratori ape per le larve pupating.
  5. Osservare pupe maturazione e registrare il tasso sfarfallamento di 100 cellule marcate covata per ciascun gruppo a giorno 17 (Figura 2).
    1. Rimuovere la cera d'api di celle di covata capped e prendere pupe con morbidi pinzetta a punta delicatamente. Trasferire il pupe in un piastre di coltura tissutale a 24 pozzetti con un doppio strato di tessuto di laboratorio sotto ogni pozzetto.
    2. Mantenere le piastre da 24 pozzetti di coltura tissutale in un incubatore a 34 ° C e 70% di umidità relativa fino emersione.
    3. Osservare e registrare le pupe ed emerse le api per ogni gruppo fino Gruppo 9 (49 giorni sperimentali).
      Nota: Ogni trattamento ha quattro ripete biologici.
  6. statistica
    1. Calcolare i dati registrati e presenti come mediaSD ±.
    2. Analizzare le differenze significative tra coppie di trattamenti (per esempio 0 ppm / 10 ppm, 10 ppm / 100 ppm e 0 ppm / 100 ppm) in ogni gruppo utilizzando t-test a due code di Student. Definire come statisticamente significativo se P -value <0.05.

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Risultati

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Per la prova sul campo miele ape, una regina era limitato alla sezione 4-struttura per la deposizione delle uova. Questa fase potrebbe aumentare la densità covata in un frame e facilitare osservazioni successive. Ogni trattamento è stato etichettato, e lo sviluppo delle api stato chiaramente osservato attraverso un vetrino trasparente. In vivo alimentazione di PPN-BLD al miele api larve dell'alveare è stata eseguita per valutare con precisione l'influenza della PPN sullo svilupp...

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Discussione

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Il metodo di deposizione delle uova queen-limitata e il metodo queen-scambio sono passaggi critici per la creazione di gruppi di api per le prove sul campo all'interno di questo protocollo. Il metodo regina limitata ovodeposizione permette la sincronizzazione del ciclo di vita delle api. Di conseguenza, i ricercatori possono selezionare 1 giorno-vecchio larve della stessa età per il trattamento con diverse dosi di pesticidi. Per il metodo francese, lo scambio, la regina è stato scambiato tra la parte A (4 fotogrammi...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Questa ricerca è stata sostenuta da Grant 105AS-13.2.3-BQ-B1 dal Bureau of animali e piante di ispezione sanitaria e la quarantena, il Consiglio per l'Agricoltura, Executive Yuan e Grant 103-2313-B-197-002-MY3 dal Ministero della Scienza e della Tecnologia (MOST).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Scatola per api mellifereSAN-YI Honey FactoryW1266l'allevamento di api mellifere
(tra i telai)SAN-YI Honey FactoryI1575Limitazione della regina
Escludi regina (in alto)SAN-YI Honey FactoryI1566Limitazione della regina in cima 
Spazzola per apiSAN-YI Honey Factory, TaiwanW1414pulire delicatamente le api sul telaio
Mangiatoia per apiSAN-YI Honey Factory, TaiwanP0219alimentare lo sciroppo di zucchero alla colonia
Scivolo trasparenteWan-Shih-Chei, Taiwan (http://www.mbsc.com.tw/a01goods.asp?s_id=40)1139Contrassegnare l'area larvale sui telai (Materiale: polietilene tereftalato, PET) (Dimensioni = Lunghezza * Larghezza * spessore = 29,7 mm * 21 mm * 0,1 mm)
Piastra di coltura tissu a 24 pozzettiGuangzhou Jet Bio-Filtration Co., LtdTCP011024Allevamento di pupe dall'estrazione
AutoclaveTomin medical equipmenco., LTD.TM-321Prepara acqua deionizzata distillata sterilizzata (ddH2O)
P20 pipetmanGilsonF123600Aggiungi PPN all'incubatrice del pool di cibo larvale dell'ape
 Yihder Co., Ltd.LE-550RDAllevamento di pupe da estrazione
KimwipesCOW LUNG INSTRUMENT CO., LTDAllevamento di pupe da estrazione
Pappa realeNational Ilan University (NIU)NIUMake basic larval diet (BLD)
D-(+)-GlucoseSigmaG8270Make basic larval diet (BLD)
D-(-)-FructosioSigmaF0127Make basic larval diet ( BLD)
Estratto di lievitoCONDA, pronadisa1702Fare la dieta larvale di base (BLD)
SaccarosioTaiwan coporazione di zuccheroE01071010Fare sciroppo di zucchero per il cibo delle api
Piriproxifene (11%)LIH-NUNG CHEMICAL CO.. LTD.Numero di registrazione 1937Regolatore di crescita degli insetti (IGR) utilizzato nell'esperimento
Escludi regina per Fornitore verificato - KCS34155

Riferimenti

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