Questo documento presenta una serie di protocolli per lo sviluppo di cellule ingegnerizzate e superfici funzionalizzate che consentono sinteticamente progettati E. coli di controllare e manipolare superfici materiche programmabili.
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Articolo metodologico
Utilizzando biologia sintetica per Ingegnere cellule viventi che si interfacciano con materiali programmabili
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Abbiamo sviluppato un'interfaccia abiotico-biotici che permette alle cellule ingegnerizzate per controllare le proprietà del materiale di una superficie funzionalizzata. Questo sistema è composto creando due moduli: un ceppo sinteticamente stratificato di cellule di E. coli e un'interfaccia materiale funzionalizzato. All'interno di questo documento, i dettagli di un protocollo per l'ingegneria genetica comportamenti selezionati all'interno di un ceppo di E. coli che utilizzano strategie di clonazione molecolare. Una volta sviluppato, questo ceppo produce livelli elevati di biotina quando esposti ad un induttore chimico. Inoltre, noi dettaglio protocolli per creare due superfici funzionalizzate differenti, ognuno dei quali è in grado di rispondere alla biotina cellule sintetizzato. Nel loro insieme, presentiamo una metodologia per la creazione di un sistema collegato, abiotici-biotici che permette progettato cellule per controllare la composizione dei materiali e il montaggio su substrati non viventi.
Introduzione
Qui, si riportano le procedure per sviluppare un substrato programmabile capace di rispondere ad un segnale chimico da una linea cellulare ingegnerizzata. 1 Facciamo questo con la creazione di una interfaccia biotina-streptavidina che risponde alla biotina prodotta da coli sinteticamente ingegnerizzato Escherichia (E. coli) cellule. In precedenza, le superfici programmabili sono stati progettati per una vasta gamma di applicazioni, dalla rilevazione della tossina 2 e point-of-care diagnosi 3 di difesa e sicurezza. 4 Mentre superfici programmabili possono ....
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Protocollo
1. Media e Cultura Preparazione
- Preparare il brodo lisogenia (LB) supporti miscelando 25 g di polvere stock LB con 1 L di acqua deionizzata (DI) e sterilizzazione in autoclave la soluzione a 121 ° C per 20 minuti per sterilizzare.
- Per preparare piastre LB, aggiungere 15 g di agar (1,5%) per il supporto LB prima della sterilizzazione
- Preparare soluzioni di 1,000x carbenicillina (Cb) in acqua deionizzata (50 mg / ml).
- Se la preparazione di supporti LB che include un antibiotico per la selezione dei trasformanti resistenti, attendere fino a quando la temperatura del supporto LB sterilizzato è inferiore a 60 ° C, e....
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Risultati
Risultati rappresentativi sono presentati nelle cinque figure allegate. In primo luogo, vi presentiamo il processo di clonazione verrà visualizzata graficamente (figura 1), in modo che il lettore possa seguire visivamente i passaggi critici per la creazione del sinteticamente ingegnerizzato ceppo di E. coli. Per caratterizzare la dinamica di popolazione delle cellule, forniamo una curva di crescita (figura 2) generato misurando la densità ottica.......
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Discussione
Abbiamo presentato una nuova strategia per l'interfacciamento cellule ingegnerizzate vive con una superficie del materiale funzionalizzato. Ciò è stato realizzato attraverso lo sviluppo di una linea cellulare in grado di sintetizzare livelli elevati di biotina quando indotta con IPTG. Gli elevati livelli di biotina possono poi essere utilizzati per modificare la superficie funzionalizzata. I protocolli dettagliati come ingegnere alla linea di cellule di E. coli e come creare due superfici funzionalizzate di.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano il sostegno di premio FA9550-13-1-0108 dall'Ufficio Air Force di ricerca scientifica degli Stati Uniti. Gli autori inoltre riconoscono il sostegno di premio N00014-15-1-2502 dal Office of Naval Research degli Stati Uniti, il finanziamento dell'Istituto per Critical Tecnologia e Scienza Applicata presso Virginia Polytechnic Institute e State University, e dal National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program, il numero di riconoscimento 1.607.310.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| LB Brodo, Miller | Fisher Scientific | 12-795-027 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP9744500 | |
| Carbenicillina | Fisher Scientific | BP26481 | |
| M9, sali minimi, 5x | Sigma-Aldrich | M6030 | |
| acidi casaimino. | Fisher Scientific | BP1424-100 | |
| Solfato di magnesio, Anidro | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Cloruro di calcio, Diidrato | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Destrosio (D-glucosio), Anidro | Fisher Scientific | D16-1 | |
| NEB Turbo Cell Line | New England Biolabs | C2984l | |
| Oligonucleotide Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | 25N sintesi, purificazione DSL |
| Q5 Polimerasi ad alta fedeltà | New England Biolabs | M0491S | |
| Q5 Tampone di reazione | New England Biolabs | B9027S | |
| dNTP Solution Mix | New England Biolabs | N0447S | |
| Agarosio | Bioexpress | E-3120-125 | |
| Etidio Bromuro, 1% | Fisher Scientific | BP1302-10 | |
| Kit di estrazione su gel | Epoch Biolabs | 2260250 | |
| Kit di minipreparazione del DNA plasmidico GenCatch | Epoch Biolabs | 2160250 | |
| AatII | New England Biolabs | R0117S | |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | R3104S | |
| EcoRI-HF | New England Biolabs | R3101S | |
| Cutsmart Buffer | New England Biolabs | B7204S | |
| T4 DNA Ligasi | New England Biolabs | M0202S | |
| T4 DNA Ligasi Reaction Buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| ColiRolle Glass Plating Beads | EMD Millipore | 7101-3 | |
| Glicerolo | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| NHS-Destiobiotin (DTB) | Thermo Fisher Scientific | 16129 | |
| Succinimidil Trans-4-(maleimidilmetil) Cicloesano-1-carbossilato (SMCC) | Thermo Fisher Scientific | S1534 | |
| Dimetil solfossido (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Succinimidil 3-(2-piridilditio) propionato (SPDP) | Thermo Fisher Scientific | S1531 | |
| NHS-LC-LC-biotina | Thermo Fisher Scientific | 21343 | |
| Perossidasi di rafano (HRP) | Thermo Fisher Scientific | 31490 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), 10x Soluzione | Fisher Scientific | BP399500 | |
| Streptavidina (SA) | Thermo Fisher Scientific | 21145 | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Ditiotreitolo (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Acido etilendiamminotetaacetico (EDTA) | Fisher Scientific | S311-500 | |
| Tween 80 | Fisher Scientific | T164-500 | |
| Perossido di idrogeno | Fisher Scientific | H325-4 | |
| 3, 3', 5, 5'-tetrametilbenzidina (TMB) | Fisher Scientific | AC229280050 | |
| Concentratori centrifughi Vivaspin 500 | Viva Products | VS0192 | |
| Acetato di sodio, anidro | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| Piastre in polistirene a 96 pozzetti | Thermo Fisher Scientific | 266120 |
Riferimenti
- Zhang, R., Heyde, K. C., Scott, F. Y., Paek, S. -H., Ruder, W. C. Programming Surface Chemistry with Engineered Cells. ACS Synth. Biol. , (2016).
- Zhou, X., et al. Reduced graphene oxide films used as matrix of MALDI-TOF-MS for detection of octachlorodibenzo-p-dioxin.<....
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Ristampe e permessi
