Questo documento delinea l'identificazione di proteine di ghiaccio-binding da piante freeze-tolleranti attraverso la valutazione di attività di inibizione ghiaccio ricristallizzazione e successivo isolamento di IBPS native che utilizzano la purificazione ghiaccio affinità.
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Articolo metodologico
Identificazione di Plant proteine Ice vincolante attraverso la valutazione di Ice-ricristallizzazione inibizione e isolanti Utilizzando Ice-affinità Purificazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
proteine ghiaccio-binding (IBPS) appartengono a una famiglia di proteine indotte da stress che sono sintetizzate da alcuni organismi esposti a temperature inferiori allo zero. Nelle piante, danni da congelamento si verifica quando i cristalli di ghiaccio extracellulari crescere, con conseguente rottura delle membrane plasmatiche ed eventuale morte cellulare. Adsorbimento di IBPS di cristalli di ghiaccio limita ulteriormente la crescita con un processo noto come inibizione ghiaccio ricristallizzazione (IRI), riducendo così i danni cellulari. IBPS inoltre dimostrare la capacità di abbassare il punto di congelamento di una soluzione al di sotto del punto di fusione di equilibrio, una proprietà nota come isteresi termica (TH) attività. Queste proprietà protettive hanno sollevato interesse per l'identificazione di nuovi IBPS causa del loro potenziale utilizzo in applicazioni industriali, mediche e agricole. Questo documento descrive l'identificazione di pianta IBPS attraverso 1) l'induzione ed estrazione di IBPS nei tessuti vegetali, 2) lo screening di estratti per attività IRI, e 3) l'isolamento e Purificazione di IBPS. Seguendo l'induzione di IBPS da esposizione a bassa temperatura, estratti sono testati per l'attività IRI utilizzando un 'analisi splat', che consente l'osservazione di crescita dei cristalli di ghiaccio utilizzando un microscopio ottico standard. Questo test richiede una bassa concentrazione di proteine e genera risultati che si ottengono in modo rapido e facile interpretazione, fornendo una schermata iniziale per ghiaccio attività di legame. IBPS può quindi essere isolato da proteine contaminanti utilizzando la proprietà di IBPS di adsorbimento sul ghiaccio, attraverso una tecnica chiamata 'ice-affinità di purificazione'. Utilizzando lisati cellulari raccolti da estratti di piante, un emisfero ghiaccio può essere coltivata lentamente su una sonda di ottone. Questo incorpora IBPS nella struttura cristallina del ghiaccio policristallino. Non richiede una conoscenza a priori biochimica o strutturale della IBP, questo metodo consente il recupero di proteina attiva. frazioni proteiche ghiaccio-purificato può essere utilizzato per applicazioni a valle comprendono l'identificazione di pepsequenze marea mediante spettrometria di massa e analisi biochimica delle proteine native.
Introduzione
Proteine ghiaccio-binding (IBPS) sono una famiglia di proteine diverse protettivi che sono stati scoperti in un numero di organismi comprese le piante 1, 2 insetti, pesci 3, 4 e microbi. La caratteristica fondamentale di queste proteine è la loro capacità unica di assorbire specificamente ed efficiente per cristalli di ghiaccio, modificando la loro crescita. IBPS hanno diverse proprietà documentati, con i due più ben caratterizzati essere isteresi termica (TH) e l'inibizione ghiaccio ricristallizzazione (IRI). attività di TH è più facilmente osservata in IBPS prodott....
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Protocollo
Impostazione Apparecchiatura 1. Splat
- Riempire un bagno di acqua circolante temperatura programmabile con glicole etilenico (50% v / v in acqua).
NOTA: verde automotive glicole etilenico può essere utilizzato. - Per assemblare la camera esterna, utilizzare tubi in plastica completamente isolato per collegare bagnomaria in una ciotola di vetro a doppia parete. Isolare la ciotola di vetro con polistirene espanso e coprire con un coperchio capsula di Petri in plastica. Tagliare un foro 3-4 pollici sul fondo della camera di polistirene in modo che la sorgente luminosa può essere visto attraverso la camera di vetro.
- Montare la camera es....
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Risultati
Per facilità di set-up, figura 1 e Figura 2 sono inclusi come rappresentazioni visive di apparecchiature utilizzate per l'analisi IRI e purificazione ghiaccio affinità, rispettivamente. Risultati di analisi IRI con estratti raccolti da infestanti senape con e senza IBPS sono rappresentati in figura 3. Questi risultati dimostrano che gli estratti raccolti da infestanti senape, .......
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Discussione
Per l'analisi di successo e purificazione di IBPS, è importante comprendere la natura sensibile alla temperatura di alcune di queste proteine. Determinate macchine IBPS diventa instabile a temperature superiori a 0 ° C, con conseguente dispiegamento, precipitazione e inattività. Per ottenere IBPS attive, è spesso importante che le piante vengono elaborati in una stanza fredda (~ 4 ° C) e campioni sono mantenuti in ghiaccio durante la sperimentazione. Un altro fattore da considerare quando si utilizzano cellule inter.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato da un NSERC (Canada) riconoscere ai VKW.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette per microcentrifuga da 1,5 mL | Fisher | 05-408-129 | |
| Jack da laboratorio regolabile | Fisher | S63080 | |
| Centrifuga da banco | Desaga MC2 | ||
| Sonda in ottone | Fotocamera personalizzata | ||
| Fotocamera/porta fotocamera | Canon | Canon Power Shot SX110 fotocamera digitale; porta | |
| per microscopio personalizzataGarza | Purewipe/Fisher Scientific | 06-665-25A | |
| Provette di concentrazione (0,5 mL) | EMD Millipore | UFC501008 | |
| Provette di concentrazione (15 mL) | EMD Millipore | UFC900308 | |
| Provette coniche (50 mL) | Thermo Fisher | AM12502 | |
| Blocco di raffreddamento | VWR | 13259 | Utilizzare un blocco |
| riscaldante in metalloDeumidificatore | Whirlpool | 50 pinte Energy Star deumidificatore; acquisto dal fornitore locale | |
| Perline di dessciazione | t.h.e. Essiccante/VWR | EM-DX0017-2 | 6-8 dimensioni della maglia; 100% indicante |
| Microscopio di dissezione | Olympus Tokyo | ||
| Ciotola di vetro a doppia parete | Generico | Acquisto dal fornitore locale di vetreria da laboratorio | |
| Ghiaccio secco | Generico | Utilizzare un fornitore locale; pericoloso | |
| Compresse inibitore dell'EDTA-proteasi | Sigma Aldrich | 11836170001 | Roche cOmplete mini |
| Glicole etilenico | Generico | Verde Glicole etilenico per autoveicoli può essere acquistato da qualsiasi negozio di ferramenta locale (i.e. Home Depot) | |
| Hexane | Sigma Aldrich | 296090 | Anidro, 95%; pericoloso |
| Olio da immersione | Sigma Aldrich | 56822 | |
| Centrifuga JA10/20 | Beckman | ||
| Capsula di Petri in plastica di grandi dimensioni | Azoto | ||
| liquido | generico Uso | generico fornitore locale; pericoloso | |
| Piastra di agitazione magnetica | Hanna Instruments | HI190M | |
| Vetrini per coperchio per microscopio | Fisher | 12-542A | |
| Tubo di plastica | Generico | Acquisto di tubo in PVC dal negozio di ferramenta locale | |
| Film polarizzato | Edmund Optics | 43-781 | |
| Polistirene espanso | Generico | Può essere costruito da scatole di spedizione in polistirene | |
| Mortaio e pestello Poreclain | Fisher | FB961 | |
| PVPP | Sigma Aldrich | 77627 | 110 µ m granulometria |
| Supporto per storta | Fisher | 12-000 | |
| Piccola ancoretta | Fisher | 14-513-51 | |
| Bagno d'acqua a temperatura programmabile | VWR | 13271-118 | |
| Grasso per vuoto | Dow Corning/Sigma Aldrich | Z273554 | |
| Tubo in vinile | Generico |
Riferimenti
- Sidebottom, C., et al. Heat-stable antifreeze protein from grass. Nature. 406 (6793), 256(2000).
- Duman, J. G. Antifreeze and ice nucleator proteins in terrestrial arthropods. Annu Rev Physiol. 63, 327-357 (2001).
- Davies, P. L., Hew, C. L.
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Ristampe e permessi
