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Metodi per studiare epiteliale Trasporti funzione delle proteine ​​e di espressione in nativo Intestino e Caco-2 cellule coltivate in 3D

DOI:

10.3791/55304

⸱

March 16th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Illinois at Chicago, 2Department of Research, Jesse Brown VA Medical Center

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Erratum

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Formal Correction: Erratum: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A correction was made to the Authors section in: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D.

One of the authors' names was corrected from:

Arivarasu N. Anabazhagan

to:

Arivarasu N. Anbazhagan

Summary

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Descriviamo semplici metodi per studiare la regolazione del trasportatore della serotonina intestinale funzione (SERT) e l'espressione utilizzando una cella modello in vitro cultura di cellule Caco-2 cresciuto in 3D e un modello ex vivo di intestino di topo. Questi metodi sono applicabili allo studio di altri trasportatori epiteliali.

Abstract

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L'epitelio intestinale ha importanti funzioni di trasporto e di barriera che giocano un ruolo chiave nei normali funzioni fisiologiche dell'organismo fornendo una barriera per particelle estranee. Impaired trasporto epiteliale (ioni, nutrienti, o farmaci) è stata associata a molte malattie e può avere conseguenze che si estendono al di là delle normali funzioni fisiologiche dei trasportatori, ad esempio influenzando l'integrità epiteliale e microbioma intestinale. La comprensione della funzione e regolazione delle proteine ​​di trasporto è essenziale per lo sviluppo di migliori interventi terapeutici. La sfida più grande nello studio del trasporto epiteliale sta sviluppando un sistema modello adatto che ricapitola le caratteristiche importanti delle cellule epiteliali intestinali nativi. Diversi modelli in vitro di colture cellulari, come ad esempio Caco-2, T-84, e le cellule HT-29-Cl.19A sono tipicamente utilizzati nella ricerca sui trasporti epiteliale. Queste linee cellulari rappresentano un approccio riduzionista per modellare la postapithelium e sono stati utilizzati in molti studi meccanicistici, tra cui l'esame delle interazioni epiteliali-microbica. Tuttavia, monostrati cellulari non riflettono accuratamente le interazioni cellula-cellula e il microambiente in vivo. Cellule coltivate in 3D hanno dimostrato essere promettente modelli per Studi permeabilità droga. Abbiamo dimostrato che cellule Caco-2 in 3D possono essere utilizzati per studiare trasportatori epiteliali. È inoltre importante che gli studi in cellule Caco-2 sono integrate con altri modelli per escludere effetti specifici di cellule e tener conto della complessità dell'intestino nativo. Diversi metodi sono stati usati in precedenza per valutare la funzionalità dei trasportatori, come sac estroflesso e uptake in cellule epiteliali isolate o in vescicole di membrana plasmatica isolati. Prendendo in considerazione le sfide nel campo rispetto ai modelli e la misura della funzione di trasporto, dimostriamo qui un protocollo di crescere cellule Caco-2 in 3D e descrivere l'uso di una camera di Ussing comeapproccio efficace per misurare il trasporto della serotonina, come ad esempio negli epiteli intestinali polarizzate intatti.

Introduction

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L'epitelio intestinale è dotato di varie proteine ​​di trasporto (canali, ATPasi, co-trasportatori e scambiatori) che eseguono numerose funzioni che vanno dal l'assorbimento di nutrienti, elettroliti, e farmaci per la secrezione di fluido e ioni nel lume. proteine ​​di trasporto generano gradienti elettrochimici che permettono il movimento di ioni o molecole in modo vettoriale. Questo risultato è ottenuto dalle distribuzioni asimmetriche dei sistemi di trasporto nelle membrane apicale e basolaterale delle cellule epiteliali polarizzate. Inoltre, giunzioni strette, che Tether cellule epiteliali adiacenti, svolgono un ruolo importante in questo processo servend....

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Protocol

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1. Studio di intestinale Trasportatori in un sistema di coltura 3D di Caco-2: 3D crescente Caco-2 colture cellulari su una miscela proteica Gelatinoso

  1. fattore di crescita Scongelare ridotto miscela proteica gelatinosa in ghiaccio per 8 h (o O / N) a 4 ° C. Una volta scongelato, fare 1 ml o 500 aliquote microlitri per l'uso o conservare a -20 ° C per un uso successivo.
  2. Il giorno della cultura, preraffreddare le piastre di coltura (per RNA e proteine ​​di estrazione) o diapositive Pompilius (per immunostaining) su ghiaccio. Aggiungere 30 ml di miscela proteica gelatinosa in ciascun pozzetto di una sagoma di vetro a camera a otto bene (o 120 ml ....

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Results

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Immunocolorazione in 3D Caco-2 cisti è mostrato in Figura 1. Una immagine rappresentativa di un piano XY mostrando lume ben delimitate-in cisti 3D macchiato di falloidina actina è mostrata in figura 1A. Il lato rivolto verso il lume denota il lato apicale. Le cellule epiteliali in coltura in un risultato ambiente 3D in un robusto fenotipo epiteliale. Diversi Caco-2 cisti il giorno 12, quando actina e SERT sono stati co-macchiato, sono mostrati in

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Discussion

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Monostrati di cellule Caco-2 completamente differenziati sono stati ampiamente utilizzati come polarizzato monostrati epiteliali per studiare il trasporto intestinale 10, 11, 12, 13, 14, 15. Tuttavia, per imitare l'organizzazione fisiologica delle cellule epiteliali intestinali, c'è stato un considerevole interesse p.......

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Disclosures

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

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Ringraziamo il Sig. Christopher Manzella, studente MD/PhD nel laboratorio RKG, per averci aiutato a modificare e correggere il nostro manoscritto.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x PBSATCCATCC® HTB&timido; 37&commercio;cellule
Carl Zeiss10x PBSper imaging confocale
3[H]-5-HT LabtekII152453Cellule di coltura per microscopia
5-HT Gibco70013-032Non è una sostanza pericolosa
95% O2- 5% CO2 cilindroKPL71-00-27Non è una sostanza pericolosa
Agar (per piastre Agar)FischerBP151-100Tossicità acuta, Ora
Agar (per elettrodo)SigmaG7126-1KGNon è una sostanza pericolosa
Alexa Fluor PhalloidinSigmaC3867-1VLNon è una sostanza pericolosa
Albumina sierica bovina (BSA)SigmaP6148-500GNocivo se ingerito o inalato
CaCl2LifeTechnologiesA12380Non è una sostanza pericolosa
Caco-2 CellsSigmaA8806-5GNon è una sostanza pericolosa
Lisi cellulare TamponeFischerBP337-100Non un sostanza pericolosa
Vetrini ChaberedSigmaS5886-1KGNon è una sostanza pericolosa
Soluzione di collagene di tipo 1Elettrodi SigmaS8045-500G
SigmaS-0876
EMEMGibco di Life Technologies25200-056
Siero fetale bovino (FBS)Corning356234utilizzato come matrice extracellulare
FluoxetinaQiagen74104
GentamicinaATCC30-2003Terreni di coltura cellulare
glicina, Danvers, MA
Hepes Roche11836145001
IndometacinaGibco di Life Technologies15070-063
K2HPO4Gibco di Life Technologies15710-064
KOHGibco di Life Technologies15630-080
Acido L-ascorbico Gibco by Life Technologies10082147
Contatore a scintillazione liquidaGibco di Life Technologies70013--032
LSM710 MetaPhysiologic Instruments, San Diego, CA EM-CSYS-8
Mannitolo, San Diego, CAP2304
MatrigelPhysiologic Instruments, San Diego, CA VCC MC8
MgCl2Physiologic Instruments, San Diego, CA DM MC6
Pinza multicanale di tensione/correntePhysiologic Instruments, San Diego, CA P2300
NaCl, San Diego, CA P2023-100
NaClFisher Scientific, Hampton, NHBP1423
NaHCO3Sigma-Aldrich, St Louis, MOS5886
Siero di capra normale (NGS, 10%)Fisher Scientific, Hampton, NHS233
Paraformaldeide (PFA)Sigma-Aldrich, St Louis, MOP288
Pen-StrpSigma-Aldrich, St Louis, MOC3881
Reagente per il dosaggio delle proteineSigma-Aldrich, St Louis, MO10420
Cocktail di inibitori della proteinasiMEDOX, Chicago, IL stile G-12300
RNA easy Mini kitSigma-Aldrich, St Louis, MOM4125
Modulo di ingresso per elettrodi a canale singolo Sigma-Aldrich, St Louis, MOA92902
Cursori per camere snapwellSigma-Aldrich, St Louis, MOH9523
Fosfato di sodio (Na2HPO4)Sigma-Aldrich, St Louis, MOF132
Idrossido di sodio (NaOH)Sigma-Aldrich, St Louis, MOT7039
TGF-β 1Perkin-Elmer, Waltham, MANFT1167250UC
Triton X-100Packard Instruments, Downers Grove, ILB1600
Trypsin EDTASigma-Aldrich, St Louis, MO221473
Tween-20Bio Rad Laboratories, Hercules, CA5000006
Ussing Chamber (solo camera)Sigma-Aldrich, St Louis, MOI7378
Sistemi di camere UssingSigma-Aldrich, St Louis, MOA1296
Microsope Segnalazione cellulare dellaStrumenti fisiologici Strumenti fisiologici

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation. Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).
  2. Shen, C., Meng, Q., Zhang, G. Design of 3D printed insert for hanging culture of Caco-2 cells. B....

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Caco 2 Cells3D CultureUssing ChamberSerotonin TransportEpithelial TransportIntestinal EpitheliumSERT ProteinWestern BlotImmunofluorescenceCell Culture

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