Questo protocollo descrive una dettagliata metodologia per la rilevazione di localizzazione di H2O2 all'interno di spermatozoi, Solea senegalensis utilizzando un fluorocromo sensibile DCFH-DA ROS, una macchia di mitocondri dal vivo per i mitocondri, e DAPI per nuclei visualizzazione, rispettivamente. Il protocollo è progettato per essere eseguito all'interno di 2 h con gli spermatozoi o freschi o scongelati.
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Articolo metodologico
Valutazione della posizione intracellulare di specie reattive dell'ossigeno in spermatozoi Solea Senegalensis
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo stress ossidativo è uno dei fattori importanti nel fare diminuire la qualità dello sperma. Lo sviluppo di efficienti protocolli per la rilevazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) degli spermatozoi è di grande importanza in tutte le specie, ma questi metodi sono utilizzati raramente e ancor meno nel teleosteo. Crioconservazione è una tecnica utile in acquacoltura per scopi diversi, comprese le operazioni di gene e garantita disponibilità di sperma durante tutto l'anno. Procedure di congelamento/scongelamento potrebbe causare la produzione di ROS e danneggiare le cellule dello sperma. Considerando i potenziali danni che un eccesso di produzione di ROS potrebbe causare degli spermatozoi a seconda della loro localizzazione, qui una dettagliata metodologia per rilevare H2O2 e per valutare la localizzazione intracellulare mediante microscopia confocale è fornito. Per questo scopo, una combinazione di 3 fluorocromi (2 ′, 7 ′-Dichlorodihydrofluorescein diacetato (DCFH-DA), una macchia di mitocondri dal vivo e 4 ′, 6-Diamidino-2-phenylindole dicloridrato (DAPI)) vengono utilizzati per valutare la co-localizzazione di H2O2 con nuclei di spermatozoi o mitocondri nei campioni di sperma di Solea senegalesis .
Introduzione
La produzione di specie reattive dell'ossigeno è stata collegata con la qualità dello sperma di recente1. Anche se la produzione di ROS nei mitocondri può essere considerata un normale processo fisiologico, lo sforzo ossidativo da un eccesso di produzione di ROS è una chiara causa di danno negli spermatozoi a diversi livelli. In esseri umani, lo sforzo ossidativo è associato con infertilità maschile, alterando la motilità e la capacità di subire capacitazione2; nei mammiferi, cambiamento dell'integrità del DNA nei campioni di seme congelato è stata anche collegata alla sintesi di H2O2
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Protocollo
Nota: Fluorocromo incubazione e analisi confocale richiederà almeno 2-3 h per un controllo e un campione non trattato. Elaborazione dei dati non è incluso in questo calcolo di tempo. Materiali richiesti possono essere trovati nella Tabella materiali. Questo protocollo può essere applicato a spermatozoi freschi o crioconservati. Solea senegalensis è una specie di pesce che depone le uova in acqua fredda, lavoro sempre in condizioni di freddo (4-7 ° C). Vedere la Figura 1 per una visione generale del protocollo.
1. preparativi prima dell'esperimento
- Preparare un 1mm mitocondri ....
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Risultati
La microscopia confocale è un metodo ideale per la valutazione di ROS intracellulari in teleostei sperma. La combinazione dei tre fluorocromi (DAPI, una macchia di mitocondri e DCFH-DA) presentati in questo studio (Figura 1) fornisce molte informazioni utili che possono essere applicati nella ricerca di base e possono avere applicazioni nel migliorare le procedure utilizzate in impianti di acquacoltura industriale, quali i protocolli di crioconservazione. Div.......
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Discussione
È noto che i mitocondri sono organelli chiavi per motilità dello sperma e la funzione. Questi organelli sono contemporaneamente direttamente coinvolti nella produzione di ROS. È interessante notare che, controllati i livelli di ROS sono necessari per lo sperma corretta funzione1. Relazioni positive tra fertilità e stress ossidativo sono state indicate in mammiferi11 ma livelli eccessivi influenzano sperma qualità12. Un fattore cruciale che potrebbe e.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo AQUAGAMETE FA 1205 COST Action. Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal progetto AGL201568330-C2-1-R (MINECO/FEDER). David G. Valcarce è stato finanziato dalla Junta de Castilla y León (EDU1084/2012) e Fondo sociale Europeo. Gli autori riconoscono Dr. Ana Riaza e Stolt Sea Farm S.A., Dr. Paulino de Paz, Dr. Ignacio Martínez Montero e José Ramón Guiérrez. Ringraziamo anche Paula Fernández Colado per videografia.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 2′,7′-diclorodiidrofluoresceina diacetato (DCFH-DA) | Sigma-Aldrich | D6883 | |
| 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Microscopia confocale | Zeiss | LSM800 | |
| Vetrini coprioggetti | Thermo Fisher Scientific | 12-541B | |
| DMSO, grado analitico | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| metanolo, grado analitico | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MitoTrackerRosso profondo | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| Microcentrifuga (refrigerata) | Thermo Fisher Scientific | 75002441 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Neubauerchamber | Sigma-Aldrich | BR717810 | |
| Vetrini | Thermo Fisher Scientific | 10143562BEF |
Riferimenti
- Amaral, S., et al. Mitochondrial functionality and chemical compound action on sperm function. Curr Med Chem. , (2016).
- Morielli, T., O'Flaherty, C. Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa.
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Ristampe e permessi
