Multimer-PAGE: Un metodo per acquisire e risolvere i complessi proteici nei campioni biologici

Summary

Metodo per la stabilizzazione e la separazione complessi proteici nativi di lisato tessuto non modificato utilizzando una proteina reticolante amminico reattivo accoppiato ad un romanzo elettroforesi bidimensionale poliacrilammide sistema (PAGE) è presentato.

Abstract

Ci sono molti metodi ben sviluppati per purificare e studiare singole proteine ​​e peptidi. Tuttavia, la maggior parte delle funzioni cellulari sono svolte da reti di interazione complessi proteici, che sono spesso difficili da studiare perché il loro legame non covalente e facilmente perturbato da tecniche di purificazione. Questo lavoro descrive un metodo per stabilizzare e separare complessi proteici nativi da tessuto non modificato usando elettroforesi bidimensionale poliacrilammide. Tessuto lisato viene caricato su un gel di poliacrilammide-blu nativa non denaturante, quindi una corrente elettrica viene applicata fino a quando la proteina migra a breve distanza nel gel. La striscia gel contenente la proteina migrato viene poi asportato e incubato con le ditiobis ammina reattiva reticolanti reagenti (succinimidil propionato), che stabilizza covalentemente complessi proteici. La striscia gel contenente complessi reticolati viene poi gettato in un gel di poliacrilammide sodio dodecil solfato, e tegli complessi sono separati completamente. Il metodo si basa su tecniche e materiali noti alla maggior parte dei biologi molecolari, che significa che è poco costoso e facile da imparare. Mentre è limitato nella sua capacità di separare adeguatamente estremamente grandi complessi, e non è stato universalmente successo, il metodo è stato in grado di catturare una vasta gamma di complessi ben studiato, ed è probabile applicabile a molti sistemi di interesse.

Introduction

Funzione cellulare normale dipende da interazioni proteina-proteina ^{1, 2.} Come risultato, malattie umane sono spesso caratterizzate da perturbazioni nel montaggio e il comportamento di vari complessi proteici ^3. La capacità di caratterizzare tali interazioni è quindi cruciale. attuali mezzi di rilevamento di queste interazioni richiedono purificazione di proteine ​​target, spesso seguite da discesa dei loro partner interagenti. Purificazione convenzionale viene realizzata mediante centrifugazione differenziale, precipitazione e / o cromatografia ^4. Questi ....

Protocol

1. Preparazione del tessuto

1. Preparare 10 ml di 4x tampone campione BN-PAGE (200 mM Bis (2-idrossietil) ammino-tris (idrossimetil) metano (Bis-Tris), 200 mM NaCl, 40% w / v di glicerolo, 0,004% Ponceau S, pH 7,2 ).
   NOTA: Questa soluzione madre può essere effettuato in anticipo e conservato a 4 ° C.
2. Diluire 250 ml di tampone campione 4x in 750 microlitri dH ₂ O contenente 1x commerciale cocktail di inibitori delle proteasi. Vortex e freddo sul ghiaccio.
3. Omogeneizzare 20 mg di tessuto bersaglio nel tampone campione BN-PAGE 1 mL 1x ghiacciata con 30 colpi di un omogeneizzatore Dounce pulito.
   Nota: per questo esperim....

Results

In questo esperimento di dimostrazione, multimero-PAGE è stata eseguita su tutto il lisato cervello di ratto. Le proteine ​​risultanti separati sono stati trasferiti su di polivinilidene (PVDF) diflouride membrane, e poi incubate con anticorpi contro le proteine ​​che sono noti per formare complessi. La figura 1 mostra una convalida del protocollo in due modi. In primo luogo, abbiamo dimostrato che le proteine reticolate sono scindibile mediante aggiunta di un agente rid.......

Discussion

interazioni proteina-proteina sono importanti per ogni compito esseri viventi svolgono. A causa di questo, sono oggetto di intenso scrutinio e di ricerca. Multimero-PAGE è un nuovo metodo per l'acquisizione, la separazione e l'analisi di un'ampia gamma di complessi proteici. Abbiamo precedentemente dimostrato la sua applicabilità a studiare oligimerization della malattia associata proteina α-sinucleina ^11. Tuttavia, è estendibile a molti complessi proteici, come mostrato nella

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sostanze chimiche
ε-Acido aminocaproico	Sigma	A2504
Acrilammide	Acros Organics	164855000	tossico.
Acrilammide/bisacrilamide 37,5:1 (soluzione madre 40%T)	BioRad	161-0148	Tossico.
Persolfato di ammonio	Sigma	A3678
Anti coniglio IgG-HRP da capra	Santa Cruz Biotechnology	sc-2004
Kit di analisi dell'acido bicinconnico	Thermofisher	23225
Bis-tris	Sigma	B9754
Albumina sierica bovina	Sigma	A9647
Butanolo	Fisher Scientific	A399-1
Kit substrato di chemiluminescenza	ThermoFisher	24078
Coomassie blue G-250	Sigma-Aldrich	B0770
Digitonin	Sigma	D141	Toxic.
Dimetil solfossido Fisher	Scientific	D128-1
Dithiobis (succinimidylpropionato)	Thermo Scientific	22585
Latte scremato secco	LabScientific	M0841
Glicerolo	Sigma	G9012
Glicina	Fisher Scientific	BP381-5
Cocktail	di inibitori della proteasi HaltThermofisher	78430
Acido cloridrico	Fisher Scientific	A144SI-212	Per titolazione. Caustico.
Metanolo	Fisher Scientific	A412-4	Per l'attivazione della membrana PVDF. Tossico.
Monoclonale anti &alfa;-sinucleina IgG da coniglio	Santa Cruz Biotechnology	sc-7011-R
N,N,N',N'-tetrametiletilendiammina	Sigma	T9281
N,N'-metilenbisacrilammide	Acros Organics	16479	Tossico.
NP40	Boston Bioproducts	P-872
Polisorbato 20 (tween-20)	Fisher Scientific	BP337-500
Membrane per il trasferimento di fluoruro di polivinilidene	Thermo Scientific	88518
Ponceau S	Sigma	P3504
Cloruro di potassio	Fisher Scientific	P217-3
Fosfato di potassio cocktail monobasico	di inibitori	P9791
	Thermo Scientific	88265
Soluzione SDS (10% p/v)	BioRad	161-0416
Cloruro di sodio	Fisher Scientific	BP358-212
Sodio dodecil solfato	Sigma	L37771
Sodio fosfato monobasico	Fisher Scientific	BP329-1
Tricine	Sigma	T0377
Tris base	Fisher Scientific	BP152-500
Tris-HCl (tampone 0,5 M, pH 6,8)	BioRad	161-0799
Tris-HCl (tampone 1,5 M, pH 8,8)	BioRad	161-0798
Name	Company	Numero di catalogo	Comments
Instruments
GE Imagequant LAS 4000	GE Healthcare	28-9558-10
Software ImageJ	NIH
Synergy H1 lettore di micropiastre	BioTek
Gel Former + Stand	Biorad
Centrifuga Microfuge 22R	Beckman Coulter
Omogeneizzatore
Miscelatore a vortice	Fisher Scientific
Omogeneizzatore tissutale ad ultrasuoni	Fisher	Scientific FB120220