Summary
Questo documento descrive un nuovo metodo per la rapida produzione di alta qualità nanoscala bioispirati idrossiapatite. Questo biomateriale è di grande importanza nella produzione di una vasta gamma di dispositivi medici innovativi per applicazioni cliniche in ortopedia, chirurgia craniofacciale e odontoiatria.
Abstract
Idrossiapatite (HA) è stato ampiamente usato come una ceramica medica grazie alla sua buona biocompatibilità e osteoconduttività. Recentemente vi è stato interesse per quanto riguarda l'uso di idrossiapatite nanoscala bioispirati (NHA). Tuttavia, apatite biologica si caratterizza per essere calcio-carenti e carbonato di-sostituito con morfologia piastrinica come nanoscala. Bioispirati Nha ha il potenziale per stimolare la rigenerazione del tessuto osseo ottimale a causa della sua somiglianza con ossa e lo smalto dei denti minerale. Molti dei metodi attualmente utilizzati per fabbricare NHA sia in laboratorio e commercialmente, coinvolgere lunghi processi e complessi. Pertanto, lo scopo di questo studio è stato quello di sviluppare un metodo rapido e affidabile per la preparazione di alta qualità bioispirati Nha. Il metodo di miscelazione rapida sviluppata è stata basata su una reazione acido-base coinvolge idrossido di calcio e acido fosforico. Brevemente, una soluzione di acido fosforico è stata versata in una soluzione di idrossido di calcio seguita da agitazione, lavaggio efasi di essiccazione. Parte del lotto è stato sinterizzato a 1000 ° C per 2 h per investigare elevata stabilità termica dei prodotti. -Analisi diffrattometrica ha mostrato la formazione di successo di HA, che ha mostrato la decomposizione termica di beta-tricalcio fosfato dopo trattamento ad alta temperatura, che è tipico per HA calcio-carenti. Trasformata di Fourier spettroscopia infrarossa ha mostrato la presenza di gruppi carbonato nel prodotto precipitato. Le particelle NHA avevano un basso rapporto di aspetto con dimensioni di circa 50 x 30 nm, vicino alle dimensioni di apatite biologica. Il materiale era anche calcio carente con Ca: rapporto molare P di 1,63, che come apatite biologica è inferiore al rapporto stechiometrico HA di 1,67. Questo nuovo metodo è quindi un processo affidabile e molto più conveniente per la fabbricazione di bioispirati NHA, superando la necessità di lunghe titolazioni e complessi. Il prodotto HA bioispirati risultante è adatto per l'uso in un'ampia varietà diapplicazioni sanitarie mediche e dei consumatori.
Introduction
C'è un grande bisogno clinico per biomateriali avanzati con funzionalità avanzate, al fine di migliorare la qualità della vita dei pazienti e di ridurre gli oneri di assistenza sanitaria di una popolazione che invecchia globale. Idrossiapatite è stato ampiamente utilizzato in applicazioni mediche per molti anni a causa della sua buona biocompatibilità. Recentemente, c'è stato un crescente interesse per l'uso di nanoscala idrossiapatite (NHA), in particolare per la rigenerazione tissutale mineralizzato in medicina e odontoiatria. Il minerale che si trova nelle ossa e lo smalto dei denti è il calcio-carenti, multi-sostituito, idrossiapatite nanoscala. Le stime per le dimensioni delle piastrine biologici Nha riportano dimensioni di 50 nm x 30 nm x 2 nm 1, con strutture più piccole descritti in osso immaturo 2. Contrastingly, il minerale in smalto dei denti è da 10 a 100 volte più grande di quella che si trova nel tessuto osseo sia in lunghezza e larghezza 3, 4. sintetico nha potrebbe essere migliore Definito bioispirati piuttosto che biomimetica, come stiamo cercando di tradurre le osservazioni per quanto riguarda le caratteristiche dei materiali naturali in tecnologie mediche con prestazioni migliorate. È stato suggerito che bioispirati NHA può essere più favorevole in applicazioni rigenerazione ossea e tessuto dentale a causa della sua somiglianza naturale minerale 5.
Ci sono vari metodi che sono stati segnalati per preparare Nha compreso idrotermale 6, spray secco 7 e sol-gel 8 tecniche. Di questi, il metodo di precipitazione umido viene considerato un metodo relativamente conveniente per la produzione di NHA. Nha metodi di precipitazione bagnato pubblicati includono generalmente una fase di titolazione durante la miscelazione di calcio e fosforo precursori chimici 9, 10, 11,ref "> 12, 13, 14. Tuttavia, questi approcci sono associati con una serie di inconvenienti tra cui processi lunghi e complessi combinati in alcuni casi con la necessità di apparecchiature costose. La produzione commerciale può essere ancora più complesso, con brevetti descrivono reattori sofisticati per fabbricazione di grado medico di alta qualità NHA 15. Ciononostante, la reazione di neutralizzazione fra idrossido di calcio e acido fosforico è vantaggioso a causa della mancanza di chimica nociva sottoprodotti.
Il rapporto tra le condizioni di lavorazione e la morfologia del prodotto NHA 'stato segnalato reazioni titolazione lente. In particolare, per i metodi di titolazione coinvolgono idrossido di calcio e acido fosforico, una temperatura elevata sembrava favorire la preparazione di particelle con un basso rapporto aspetto 13. Questo lavoro è stato notevolmente ampliato da Genpiastrelle et al. 16 che ha dimostrato la relazione tra temperatura e altre condizioni di lavorazione sulla qualità dei prodotti NHA da una vasta gamma di metodi. Ha concluso che il metodo di precipitazione chimica umida di Prakash 13 fatto prodotti di alta qualità, ma va notato che i risultati dipendevano / processi di miscelazione tecnicamente impegnativi e lenti. Il passo di titolazione originale Prakash prende più di un'ora. Tuttavia, i tempi di titolazione più lunghi possono essere richiesti per lotti più grandi per essere preparati.
Per riassumere, mentre l'influenza di diversi fattori quali la temperatura sono ora stati ampiamente studiati, quasi nessuna attenzione è stata diretta a ridurre la complessità e il tempo necessario per eseguire i metodi di titolazione basati associata. Lo scopo di questo studio è stato quindi quello di indagare gli effetti di applicazione di un avvicinamento rapido mix per la produzione di un Nha bioispirati, e pienamente caratterizzazioneZE i materiali risultanti. In caso di successo, un approccio mix rapida semplificato avrebbe grandi benefici per i ricercatori di laboratorio e l'industria allo stesso modo in cui i costi di produzione potrebbero essere sostanzialmente ridotti senza compromettere la qualità.
Protocol
Figura 1. Schema di preparazione mix rapido bioispirati idrossiapatite nanoscala. La soluzione di acido fosforico è stata versata in sospensione di idrossido di calcio. Dopo la sospensione costante durante la notte, il NHA è stato lavato con acqua deionizzata prima di essere essiccato a 60 a 80 ° C. NHA stato quindi macinato in un mortaio di agata e pestello e sinterizzato per studiare la stabilità termica del prodotto NHA. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
1. Rapid Mix Produzione di Nanoscale idrossiapatite
- Preparazione di soluzioni calcio e fosforo per preparare 5 g di nanoscala idrossiapatite con un calcio al fosforo rapporto molare di 1,67.
- Aggiungere 3.705 g di idrossido di calcio per500 mL di acqua deionizzata e mescolare su una piastra agitatore magnetico per 1 ora a 400 rpm.
- In un becher separata, sciogliere 3.459 g di acido fosforico (85%) in 250 mL di acqua deionizzata.
- Versare la soluzione di fosforo in agitazione la sospensione di idrossido di calcio ad una velocità di circa 100 ml / s. Coprire bicchiere con Parafilm (Bemis, Stati Uniti d'America).
- Lasciare la sospensione sotto agitazione per 1 ora a 400 rpm.
- Prendete il bicchiere dalla piastra agitatore e lasciare riposare durante la notte.
- Lavare la sospensione versando il sopranatante e aggiungendo 500 ml di acqua deionizzata e agitazione per 1 min a 400 rpm. Ripetere questa operazione tre volte in totale, con 2 h tra ogni lavaggio.
- Lasciare sospensione Nha riposare una notte.
- Eliminare il surnatante limpido e posizionare la sospensione NHA si stabilì in una stufa ad 60 a 80 ° C.
- Una volta asciutta, posizionare il Nha essiccato in un mortaio di agata e pestello e macinare fino a fine.
- Mettere 2,5 g di proPolvere dotto NHA in un crogiolo e sinterizzazione polvere di allumina a 1000 ° C per 2 ore utilizzando una velocità di rampa di 10 ° C / min. Dopo il trattamento termico, lasciare il NHA raffreddare nel forno.
- polveri Conservare in un essiccatore a vuoto.
2. Caratterizzazione di Nanoscale idrossiapatite
- Diffrazione di raggi X (XRD) utilizzando diffrattometri modalità di trasmissione
- Mettere una piccola quantità (cioè meno di 200 ml) di poli (vinil alcool) (PVA) colla sulla pellicola di acetato e mescolare con una piccola quantità (cioè meno di 100 mg) di Nha in polvere.
- Trattare con una pistola ad aria calda fino a secco.
- Montare il campione in un supporto del campione e carico su una modalità di trasmissione diffrattometro a raggi X con radiazione Cu K α.
- Utilizzare le impostazioni diffrattometro di 40 kV e 35 mA, con una gamma 2θ di 10-70 °.
- Analizzare i modelli XRD risultanti.
- Utilizzare le seguenti carte XRD per l'identificazione di fase: Idrossiapatite: 9-432. beta-tricalcio fosfato: 04-014-2292.
- Microscopia elettronica a trasmissione (TEM)
- Mettere una piccola quantità di polvere (cioè meno di 10 mg) in un bijou e aggiungere circa 3 mL di etanolo.
- si osserva 30 minuti fino a una sospensione omogenea - campione Ultra-ultrasuoni per 15.
- Pipettare una piccola quantità di soluzione (cioè meno di 1 mL) su una griglia di rame 400 ingranano con pellicola di carbonio, e lasciare asciugare.
- campioni di immagine con una tensione di accelerazione di 80 kV.
- Fluorescenza a raggi X (XRF) servizio da parte dei Materiali e Ingegneria Research Institute (MERI) alla Sheffield Hallam University
- Combinare 0,8 g Nha polvere con 8 g di tetraborato di litio.
- Sciogliere miscela in un crogiolo lega di platino-oro con un forno impostato a 1200 ° C.
- Analizzare i campioni risultanti in uno spettrometro XRF per determinare la composizione elementare dii campioni.
- Trasformata di Fourier spettroscopia infrarossa in modalità riflettanza totale attenuata (FTIR-ATR)
- Eseguire 64 scansioni in background di 4.000 - 500 cm-1 con una risoluzione di 4 cm -1.
- Mettere una piccola quantità (cioè meno di 100 mg) di NHA polvere sulla parte superiore del diamante l'adattatore totale attenuata riflettanza e comprimere sulla superficie del diamante con il tappo a vite.
- Eseguire 32 scansioni 4.000 - 500 cm -1 con una risoluzione di 4 cm -1 con i precedenti scansioni sottratte dalle scansioni campione.
Representative Results
Spettri XRD (Figura 2) hanno mostrato la precipitazione di una fase pura HA con ampi picchi, indicando una relativamente piccola dimensione dei cristalliti e / o la natura amorfa. Dopo la sinterizzazione ad alta temperatura, è stata rilevata β-tricalcio fosfato (β-TCP), insieme a una fase principale di HA. L'affilatura dei picchi di diffrazione, cioè una riduzione completa mezza larghezza massima, indicato un aumento della dimensione dei cristalliti dopo sinterizzazione.
Figura 2. Analisi fase cristallina di prodotti. diffrazione di raggi X (XRD) modelli di non sinterizzato polvere di idrossiapatite nanoscala (NHA) e polvere di NHA sinterizzati a 1000 ° C per 2 h. etichette di picco: ▼ picchi di idrossiapatite, ■ β-tricalcio fosfato picchi.ge.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
FTIR-ATR spettri (Figura 3) ha confermato la formazione di una fase HA da parte del fosfato caratteristico e bande idrossilici 17, 18. Nel dettaglio sono stati assegnati i gruppi come segue: 3.750 cm -1 (OH - allungare ν OH); 1.086 e 1.022 cm -1 (PO 4 3- ν 3); 962 cm -1 (PO 4 3- ν 1); 630 cm -1 (OH - librazione δ OH); 600 e 570 cm -1 (PO 4 3- ν 4). Nel campione non sinterizzato sono stati assegnati i picchi supplementari come segue: Broad Peak incentrato 3.400 cm -1 (molecole d'acqua assorbita); 1.455 e 1.410 cm -1 (CO 3 2- ν 3); 880 cm
Figura 3. spettri infrarossi di prodotti. Trasformata di Fourier a raggi infrarossi in attenuato modalità totale riflettanza (FTIR-ATR) spettri di polvere non sinterizzato nanoscala idrossiapatite (NHA) e polvere di Nha sinterizzato a 1000 ° C per 2 ore. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Immagini TEM (Figura 4) hanno mostrato la formazione di particelle su scala nanometrica ingegnoh dimensioni di circa 50 nm da 30 nm. Le particelle avevano un rapporto di aspetto bassa (lunghezza delle particelle di larghezza / particelle) di circa 1,7. La dimensione e la forma dei prodotti nanoscala erano di dimensioni simili a apatite biologica 1.
Figura 4. Nanoscale morfologia del prodotto. microscopio elettronico a trasmissione (TEM) di nanoscala idrossiapatite (NHA) preparati secondo il metodo di miscelazione rapida a due ingrandimenti. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Quantitative analisi chimica della polvere NHA via XRF (Tabella 1) ha permesso calcio: rapporto fosforo calcolato come 1.63, che è leggermente inferiore a quella stechiometrica HA which ha un calcio: rapporto di fosforo di 1,67. XRF anche mostrato l'elevata purezza del prodotto NHA con solo tracce di altri elementi registrati.
| Composto | Peso % |
| CaO | 51.52 |
| P 2 O 5 | 39.89 |
| MgO | 0.46 |
| Na 2 O | 0,13 |
| Y 2 O 3 | 0,07 |
| Al 2 O 3 | 0.03 |
| SiO 2 | 0.03 |
| Mn 3 O 4 | 0.03 |
| SrO | 0.02 |
| TiO 2 | 0.01 |
Tabella 1. analisi chimica quantitativa di prodotto. fluorescenza a raggi X (XRF) risultati per non sinterizzato polvere Nha ha mostrato> 99% di purezza, in peso.
Discussion
Apatite naturale è composto di nanoparticelle di idrossiapatite non stechiometrica gassata con la formula chimica approssimativa di Ca 10 xy [(HPO 4) (PO 4)] 6-x (CO 3) y (OH) 2-x. La produzione di biomateriali con stretta somiglianza chimica naturalmente minerale presente stato segnalato per promuovere risposte biologiche ottimali. Per esempio, la ricerca sulla biomimetica calcio-carenti gassata NHA ha dimostrato di essere in grado di stimolare la proliferazione e l'attività della fosfatasi alcalina di cellule murine preosteoblast in misura maggiore rispetto ai convenzionali NHA 19.
In questo studio, la precipitazione di HA che mostrava parziale decomposizione termica a 1.000 ° C (figura 2) ha suggerito la formazione di un HA calcio-carenti. Questo è stato sostenuto dalla inferiori a Ca stechiometrico: rapporto P (1.63) ottenuti con i dati XRF (Tgrado 1). Resta inteso che un Ca ridotta: rapporto P è associato con un minore stabilità termica 20, 21, 22, 23. In questo metodo, la rapida aggiunta della soluzione di acido fosforico rapidamente abbassa il pH della sospensione di reazione per generare HPO 4 ioni. La presenza di HPO 4 gruppi facilitato la precipitazione del calcio carente HA, con la formula molecolare: Ca 10-x (HPO 4) x (PO 4) 6-x (OH) 2-x, dove 0 <x <1.
La rapida aggiunta dell'acido fosforico ha quindi un effetto marcato sulla cinetica di precipitazione della reazione. Come descritto in precedenza, le reazioni che coinvolgono titolazione idrossido di calcio e acido fosforico effettuata a temperatura ambiente tendevano a produrre particelle con un elevato rapporto di aspetto 13. per titration reazioni che coinvolgono questi reagenti, è stato necessario utilizzare una temperatura elevata per produrre particelle con un rapporto di aspetto inferiore che sono più simili a apatite biologica 13. Particelle elevato allungamento sono prodotte quando il tasso di nucleazione cristallo è più lento rispetto al tasso di crescita dei cristalli 24. Per il nuovo metodo sviluppato in questo studio, la rapida aggiunta della soluzione di acido fosforico può essere fornito un numero maggiore di siti di nucleazione che ha portato alla maggiore presenza di piccole particelle arrotondate rispetto a meno particelle con un rapporto di formato più grande. Poiché gli autori non sono completamente studiato gli effetti di versare lentamente l'acido fosforico nella sospensione di idrossido di calcio, al fine di ottenere risultati coerenti si consiglia l'acido fosforico viene versata ad una velocità commisurata a quella mostrata nel video (circa 100 mL / S).
Durante lo sviluppo di questo metodo, gli autori investigated una serie di modifiche incrementali al metodo di preparazione NHA basato su Prakash et al. 13 compreso il confronto dei prodotti realizzati con la titolazione lenta e la rapida aggiunta della soluzione di acido fosforico 25. Si è constatato che la lenta titolazione di acido fosforico nella sospensione di idrossido di calcio si ottenne un prodotto con un residuo idrossido di calcio. Si propone che il cambiamento di pH causato dalla rapida aggiunta di acido fosforico incoraggiato lo scioglimento dell'idrossido di calcio e perciò consentito per la conversione di successo dei reagenti in idrossiapatite. Un confronto dei prodotti preparati con il metodo di miscelazione rapida a camera e temperature elevate (60 ° C) hanno trovato che una temperatura elevata determinato una maggiore conduttività dopo la reazione è stata completata. Questo suggerisce che l'idrossido di calcio residuo era presente che era probabilmente dovuto alla minore solubilità di idrossido di calcio aaumento delle temperature. La presenza di idrossido di calcio residuo è desiderabile in quanto la natura di base di questo composto potrebbe compromettere biocompatibilità.
FTIR rilevata l'attività caratteristica fosfato e ossidrile gruppo associato con HA (figura 3). È stato osservato che lo spettro del prodotto sinterizzato mostrato nitide fosfato e ossidrile picchi. Questi cambiamenti sono stati associati con una maggiore cristallinità del prodotto 26, 27 .La spettro non sinterizzato fornito la prova di tipo B sostituzione carbonato dove ioni di carbonato hanno sostituito per gruppi fosfato. Questo è in contrasto con un tipo di sostituzione in cui ioni carbonato possono sostituire gruppi ossidrilici 17. E 'stato riportato che la sostituzione B-tipo di carbonato avviene in apatite biologica 3. Tuttavia, Tampieri et al. ha riferito che, mentre B-tipo di sostituzione è stato predominformica nei giovani le ossa, di tipo A sostituzione di carbonato è sempre più presente nelle ossa di individui più anziani 28. sostituzione del carbonato è stato trovato per diminuire la cristallinità e la stabilità termica della NHA mentre aumentando la sua solubilità. Sono stati proposti Queste modifiche contribuire all'aumento bioattività di carbonato-sostituito HA 29. HA biologica è noto anche per contenere alcuni degli altri elementi rilevati nell'analisi XRF (Tabella 1), come magnesio, sodio e stronzio 30. La presenza di questi elementi può anche contribuire ad aumentare efficacia biologica. Il lavoro futuro dovrebbe essere diretto alla preparazione di questi apatite in nanoscala sostituito, e anche i prodotti con una maggiore biofunzionalità come l'argento-drogato nha 31. Per preparare sostituito NHA, l'elemento può essere introdotta con una corrispondente riduzione dell'elemento prevista per Substitute per, ad esempio, una riduzione della quantità del composto di calcio quando stronzio, magnesio o zinco sostituzione viene tentato 32. In alternativa, un altro approccio potrebbe essere quello di aggiungere elementi con l'intento di fornire ioni 'drogati', che sono presenti sulla superficie della NHA senza necessariamente intenzione di sostituire l'elemento nel reticolo cristallino HA 31. Per queste modifiche al metodo è possibile preparare soluzioni miste come idrossido di calcio e nitrato d'argento, e di effettuare la reazione nello stesso modo come descritto qui.
In conclusione, questo lavoro riporta un metodo rapido e sostanzialmente migliorata innovativo per la preparazione di bioispirati NHA. Per questo metodo, la rapida miscelazione delle sostanze chimiche richiede meno di 5 secondi, che è una marcata riduzione del tempo rispetto al titolazioni reazioni tipicamente richiedono ore di attento monitoraggio. Esso ha un grande potenziale per l'utilizzo in biomatsviluppo erial a causa della sua relativa semplicità e basso costo rispetto ai metodi di produzione industriali Nha attualmente utilizzati in cui la complessità intrinseca delle attuali risultati dei sistemi commerciali in tempi di ricerca e sviluppo lunghe, e aumentato notevolmente i costi di produzione. In particolare, questo nuovo metodo è superiore ai processi di flusso continuo o tecniche idrotermali a causa della minore notevolmente i requisiti investimenti in attrezzature di start-up.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio EPSRC CASE in collaborazione con Ceramisys Ltd. ed è anche associato con mede innovazione, il Centro EPSRC per il settore manifatturiero innovativo in dispositivi medici [codice di autorizzazione EP / K029592 / 1]. Gli autori desiderano inoltre ringraziare Robert Burton alla Sheffield Hallam University per l'analisi XRF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium hydroxide (purity of ≥ 96%) | Sigma Aldrich UK | 31219 | Good laboratory practise should be used at all times including the use of appropriate personal protective equipment. |
| Phosphoric acid (85%) | Sigma Aldrich UK | 345245 | Safety goggles and a faceshield should be used when handling this product (see safety data sheet from Sigma Aldrich for further information). |
| STOE IP X-ray diffractometer | Phillips | ||
| International centre for diffraction data (ICDD) PDF4+ database | International Centre for Diffraction Data | ||
| Holey carbon films on 300 mesh grids | Agar Scientific | S147-3H | |
| Tecnai G2 Spirit transmission electron microscope | FEI | ||
| Lithium tetraborate | ICPH, Malzéville, France | ||
| PW2440 XRF spectrometer | Philips | ||
| ThermoScientific Nikolett Spectrometer | Unicam Ltd |
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