Analisi qualitativa e quantitativa della sinapsi Immune nel sistema umano utilizzando Imaging citometria a flusso

Le cellule T sono importanti regolatori del sistema immunitario adattativo e vengono attivate attraverso peptidi antigenici che sono presentati nel contesto dei complessi di istocompatibilità (MHC). Attivazione a cellula T completo richiede due segnali, il segnale di competenza attraverso il recettore di antigene-specifiche cellule T (TCR) / CD3 complesso e il segnale di costimolazione tramite ricevitori accessori. Entrambi i segnali sono generati attraverso l'interazione diretta delle cellule di T con presentanti l'antigene (APCs) di cellule. APCs maturo forniscono il segnale di competenza per l'attivazione di cellule T attraverso complessi MHC-peptide, ed esprimono ligandi costimolazione (ad es., CD80 o CD86) per assicurare la progressione della cellula T di attivazione¹. Una importante funzione di costimolazione è il riarrangiamento del citoscheletro actina^2,3,4. La F-actina corticale è relativamente statico in cellule di T di riposo. Stimolazione delle cellule T attraverso antigene-cuscinetto APCs conduce ad una profonda riorganizzazione del citoscheletro. Dinamica dell'actina (cioè, veloce actina polimerizzazione/depolimerizzazione cerchi) attiva le cellule di T di creare forze che vengono utilizzate per il trasporto di proteine o organelli, ad esempio. Inoltre, il citoscheletro di actina è importante per lo sviluppo di una speciale zona di contatto tra le cellule di T e APC, chiamato sinapsi immune. Data l'importanza del citoscheletro alla sinapsi immune, è diventato essenziale per sviluppare metodi per quantificare i cambiamenti nel citoscheletro delle cellule T^{5,6,7,8 , 9}.

Per mezzo di aiuti del citoscheletro di actina, recettori e proteine di segnalazione sono segregati nei cluster di attivazione supramolecolari (SMACs) all'interno della sinapsi immune. La stabilità della sinapsi immune è assicurata dall'associazione dei recettori ai pacchi di F-actina che aumentano l'elasticità del citoscheletro. Formazione della sinapsi immuni è stato indicato per essere critico per la generazione della risposta immune adattativa. Gli effetti nocivi di una formazione di sinapsi immunitaria difettosa in vivo in primo luogo sono stati realizzati in pazienti affetti da Wiskott Aldrich sindrome (WAS), una malattia in cui polimerizzazione dell'actina e, simultaneamente, la formazione della sinapsi immuni sono disturbati¹⁰ . ERA i pazienti possono soffrire di eczema, gravi infezioni ricorrenti, malattie autoimmuni e melanomi. Nonostante questa individuazione, attualmente non è noto se la formazione della sinapsi immuni è diverso nelle cellule T di individui sani e pazienti affetti da malattie autoimmuni o difetti immuni.

Microscopia a fluorescenza, compresi confocale, TIRF e microscopia di Super-risoluzione, sono stati utilizzati per scoprire l'architettura del sistema immunitario sinapsi^11,12,13,14. L'alta risoluzione di questi sistemi e la possibilità di effettuare formazione immagine della vivere-cella consente la raccolta di informazioni esatte, spazio-temporali su citoscheletro e proteine di superficie o intracellulare nella sinapsi immune. Molti risultati, tuttavia, sono basati sull'analisi di solo poche decine di cellule T. Inoltre, le cellule T devono essere depurate per questi tipi di microscopia a fluorescenza. Tuttavia, per molte domande di ricerca, l'uso di cellule impura, piuttosto che la risoluzione massima possibile è della massima importanza. Ciò è rilevante se le cellule di T dai pazienti vengono analizzate, dato che l'importo delle donazioni di sangue è limitato e potrebbe esserci la necessità di elaborare molti campioni in parallelo.

Abbiamo stabilito metodi microscopici che consentono l'analisi del citoscheletro nella sinapsi immune nel sistema umano^15,16,17. Questi metodi sono basati su citometria a flusso, anche denominato In-Flow microscopia¹⁸di imaging. Come un ibrido tra microscopia di fluorescenza e citometria a flusso multispettrale, citometria a flusso di imaging ha suoi punti di forza nell'analizzare parametri morfologici e la localizzazione della proteina in popolazioni eterogenee delle cellule, quali pan-leucociti dalla nel sangue periferico. Abbiamo introdotto una metodologia che permette di quantificare F-actina in coniugati di T-cellula/APC di cellule T umane da campioni di sangue intero, senza la necessità di lunghe e costose purificazione passaggi¹⁷. La tecnica qui presentata comprende l'intero flusso di lavoro, di ottenere il campione di sangue per la quantificazione di F-actina nella sinapsi immune.

1. preparazione del Pan-leucociti

1. Disegnare 1 mL di sangue periferico da un donatore sano (o paziente) in una siringa eparinizzata. Assicurarsi di avere l'approvazione del comitato etico competente per la donazione di sangue.
2. Mescolare 1 mL di periferico umano sangue con 30 mL di tampone di lisi ACK (150mm NH₄Cl, 1 mM KHCO₃e 0,1 mM EDTA, pH 7,0) in una provetta da 50 mL e incubare per 8 min a temperatura ambiente.
3. Riempire le provette con PBS e centrifugare a 300 x g per 6 min. aspirare il supernatante e risospendere il pellet in 30 mL di tampone di lisi ACK.
4. Ripetere i passaggi 1.2 e 1.3 il supernatante è chiaro. Infine, lavare le cellule in PBS, centrifugare a 300 x g per 6 min a temperatura ambiente e risospendere il pellet cellulare in 2 mL di terreno di coltura (RPMI1640 + 10% FCS). Incubare le cellule a 37 ° C per 60 min.

2. caricamento di Raji cellule con SEB

1. Preparare due provette di Falcon da 15 mL con 1.5 x 10⁶ cellule di Raji per tubo. Rotazione verso il basso le cellule (300 x g per 6 min a temperatura ambiente) e scartare il surnatante.
2. Risospendere le cellule in medium residua (circa 50 – 100 µ l), µ l 1,9 (1,9 µ g) SEB e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti aggiungere 5 mL di terreno di coltura, rotazione verso il basso le cellule (300 x g per 6 min a temperatura ambiente) e risospendere il pellet in terreno di coltura (RPMI 1640 + 10% FCS) ad una densità di 1 x 10⁶ cellule/mL.

3. induzione di sinapsi immuni e protocollo di colorazione

1. Pipettare 500 µ l della preparazione delle cellule di Raji SEB-caricato in un tubo di FACS e 500 µ l della preparazione delle cellule di Raji scaricate in un altro tubo di FACS. Aggiungere 650 µ l di pan-leucociti in ciascuna provetta e centrifugare le cellule (300 x g per 10 min a temperatura ambiente). Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 150 µ l di terreno di coltura (RPMI1640 + 10% FCS). Incubare a 37 ° C (in genere per 45 min).
2. Vortice di delicatamente le cellule (10 s a 1.000 giri/min) e aggiungere 1,5 mL di paraformaldeide (1,5%) durante il vortice per fissare le cellule. Fermare la fissazione aggiungendo 1 mL di PBS + BSA 1%. Appallottolare le celle (300 x g per 10 min a temperatura ambiente e risospensione del pellet in 1 mL di PBS + BSA 1% dopo incubazione a temperatura ambiente per 10 min.
3. A pellet (300 x g per 10 min a temperatura ambiente) e risospendere le cellule in 100 µ l di PBS + BSA 1% + 0,1% saponina per 15 min a temperatura ambiente per permeabilize le cellule (piastra 96 pozzetti, a forma di U).
4. Lavare le cellule in PBS + BSA 1% + 0,1% saponina con centrifugazione (300 x g per 10 min a temperatura ambiente) e risospendere il pellet cellulare in 50 µ l di PBS + BSA 1% + 0,1% saponina contenenti anticorpi fluorophore-etichettati o composti (CD3-PE-TxRed (01:30), Phalloidin-AF647 (1: 150) e DAPI (1:3, 000)).
5. Incubare le cellule a temperatura ambiente al buio per 30 min. lavare le cellule 3 volte aggiungendo 1 mL di PBS + BSA 1% + 0,1% saponina. Centrifugare a 300 x g per 10 min a temperatura ambiente. Re-risospendere le cellule in 60 µ l di PBS per imaging citometria a flusso.

4. acquisizione immagini utilizzando un citometro a flusso

Nota: La seguente immagine acquisizione procedura e analisi dei dati si basano su citometria a flusso utilizzando un software come imagestream (IS100), INSPIRE e le idee di imaging. Tuttavia, altri software di analisi e citometri a flusso può anche essere utilizzato.

1. Aprire il software di analisi sul computer collegato al citofluorimetro imaging e fare clic su inizializzare Fluidics di menu strumento. Applicare le perline sulla porta destra quando viene richiesto di farlo.
2. Caricare il modello predefinito dal menu File e fare clic su Esegui/Setup. Scegliere perle dal menu a discesa Visualizza.
3. Regolare l'illuminatore luminoso-campo cliccando sul intensità impostata se il valore indicato è inferiore a 200.
4. Eseguire la taratura e routine di test nella scheda Assist cliccando su Start tutto.
5. Fare clic su Flush/blocco/carico e applicare i campioni nella porta di sinistra quando viene richiesto di farlo. Dopo aver caricato le cellule nel citometro a flusso, aprire il classificatore di cella e regolare i valori come segue: limite massimo di intensità di picco a 1.022 per ogni canale, picco intensità limite inferiore a 50 per canale 2 (DAPI) e 5 (CD3-Pe-TxR), il limite inferiore zona a 50 per canale 1 (dispersione laterale) e limite superiore a 1.500.
6. Modificare la potenza del laser di eccitazione a 405 nm (15 mW), 488 nm (200 mW) e 647 nm (90 mW) nella scheda impostazione.
7. Attivare il menu a discesa Visualizza tra cellule e perline per valutare le regolazioni di potenza cella classificatore e laser.
   Nota: Assicurarsi che tutte le cellule e cellula coppie trovano la vista di cella e cella ciuffi, detriti e immagini con pixel saturi si trovano nella visualizzazione detriti cambiando i classificatori di cellulare e/o i poteri del laser di eccitazione.
8. Definire il nome del campione e la quantità di immagini da acquisire (15.000-25.000 per campioni) e 500 per i controlli di compensazione nella scheda di installazione fare clic su Esegui/Setup per avviare l'acquisizione.

5. analisi dei dati

1. Trasferire i file di immagine raw (. Rif) sul computer di analisi dati e aprire il software di analisi.
2. Produrre una matrice di incremento retributivo seguendo le istruzioni del menu a discesa di compensazione. Salvare la matrice di compensazione come comp_Date.ctm.
3. Aprire un file di immagine raw di esempio (. Rif) e applicare il comp_Date.ctm nella finestra che viene visualizzata per produrre i file di immagine compensata (CIF) e il file di analisi di dati predefinito. (DAF).
4. Aprire il file di immagine compensata. Convertire le immagini in modalità colore e regolare le tabelle di ricerca per ottenere colori ottimali visibili nella barra degli strumenti Proprietà Galleria dell'immagine. Ottenere un'immagine RGB-fuse utilizzando la scheda composita della barra degli strumenti Proprietà Galleria dell'immagine.
5. Aprire il gestore di maschera dal menu a discesa di analisi. Creare maschere per definire le cellule di T e la sinapsi immune, come segue:
   1. Selezionare la maschera di T-cellula: "(Fill (Threshold_Ch05, 60)." Selezionare la maschera di valle: "Valley(Ch02,3)." Selezionare la maschera di sinapsi della cellula T: "maschera di cellula T AND Valley (M02, Ch02, 3)."
6. Aprire il gestore di funzionalità dal menu a discesa di analisi. Calcolare le seguenti caratteristiche:
   1. Per l'espressione totale di CD3 in cellule di T, selezionare "Intensity_T-cells_Ch5." Per la quantità totale di F-actina nelle cellule T, selezionare "Intensity_T-cells_Ch6." Per CD3 espressione nella sinapsi immune, selezionare "Intensity_T-cellulare synapse_Ch5.." Per la quantità di F-actina nella sinapsi immune, selezionare "Intensity_T-cellulare synapse_Ch6.."
   2. Per calcolare l'area di T-cella, selezionare "Area_T-cellule." Per calcolare l'area di sinapsi immunitaria T-cellula, selezionare "sinapsi Area_T-cella."
7. Determinare la F-actina e CD3 arricchimento nella sinapsi immune utilizzando l'equazione in funzione di gestione:
   
8. Applicare la seguente strategia di gating tramite istogrammi e puntino trame l'area di analisi (per maggiori dettagli, vedi riferimenti 17 e 19):
   1. Scartare le cellule out-of-focus tracciando il "gradiente RMS_M2_Ch2" in un istogramma; impostare la soglia a 15.
   2. Tracciare il CSD contro CD3 intensità in una trama di dot. Impostare un cancello su eventi di CD3-positive.
   3. Trama "Aspect ratio" di M02 (macchia di DAPI) contro la zona di M02 (Dapi macchia). Cancello il Canottiere T-cellula e cellula coppie di conseguenza. Correggere per le coppie di true cella utilizzando l'area della maschera sinapsi, come descritto in precedenza^17,19.
   4. Determinare la quantità di F-actina in cellule di T di coppie di T-cellula/APC e canottiere T-cellula e la percentuale di F-actina nella sinapsi immune.

Degli obiettivi principali del metodo descritto qui è la quantificazione dell'arricchimento di proteine (ad es., -F-actina) nella sinapsi immunitaria tra APC (cellule di Raji) e cellule di T in impura pan-leucociti prelevati campioni di sangue umano di basso volume (1 mL) di surrogati. Nella schermata nella Figura 1 fornisce una panoramica della strategia di gating critica di questo metodo. Mostra la Galleria immagini a sinistra e l'area di analisi sulla destra (Figura 1). La Galleria di immagini Mostra il cancello "In Focus". Le immagini raffigurate sono principalmente granulociti e due coppie di T-cellula/APC. F-actina e CD3 sono arricchite nel numero delle cellule coppia 30272. La strategia di gating per quantificare la quantità di cellule adulte con tale arricchimento è mostrata nell'area di analisi ed è descritto nel protocollo (Vedi punto 5.8) o altrove17,19. La trama Ultima puntino nell'area di analisi Visualizza la quantità (percentuale della proteina) di CD3 (asse x) e F-actina (asse y) nella sinapsi immune. Se più del 30% della proteina era situato all'interno della maschera di sinapsi immuni, è stato considerato come arricchimento di proteina nel sistema immunitario sinapsi20. Puntino terreni contenente arricchimento dati sono stati utilizzati per produrre un risultato finale tipico (Figura 2A). L'immagine sulla sinistra Mostra immagini di esempio dei coniugati di T-cellula/APC, con basse quantità di CD3 e F-actina nella sinapsi immune, mentre sulla destra, coniugati di T-cellula/APC sono raffigurati con un forte arricchimento di CD3 e F-actina. La quantità di CD3 alla sinapsi immune (percentuale proteica) viene tracciata sull'asse x, e la quantità di F-actina alla sinapsi immunitaria viene tracciata sull'asse y. La percentuale nel cancello rappresenta la quantità di cellule di T che hanno un arricchimento del CD3 e F-actina alla sinapsi immunitaria in presenza di un superantigen. In assenza di superantigen, 15% per cento delle cellule di T hanno mostrato un arricchimento alla sinapsi immune di CD3 e di F-actina. La quantità di cellule è aumentato al 29% in presenza di superantigen. Una singola quantificazione di arricchimento CD3 (Figura 2B) o arricchimento di F-actina (Figura 2) è indicata in presenza ed assenza di superantigen. Questi risultati indicano che, in assenza di superantigen, 18,3 ± 3,5% e, in presenza di superantigen, 34,3 ± 4,0% dell'importo totale di F-actina nelle cellule sono stati accumulati alla sinapsi immune. Interessante, ci era già CD3 accumulo in assenza di superantigen (16,6 ± 2,1% dell'importo totale CD3), che è stata aumentata significativamente dall'aggiunta di superantigen (24,6 ± 3,0% dell'importo totale CD3). Questo metodo consente la quantificazione di quanta proteina è accumulato alla sinapsi immunitaria tra cellule T e APC.

Figura 1: strategia per l'identificazione delle sinapsi immuni nelle preparazioni di pan-leucocita di Gating. La figura mostra una schermata del software e contiene un flusso di lavoro completo di analisi per la valutazione di arricchimento CD3 e F-actina nella sinapsi immunitaria delle cellule T coniugato di APC in presenza di SEB. Le immagini vengono visualizzate nella Galleria di immagini sulla sinistra (Ch2 = DAPI; CH5 = CD3-PETxR; CH6 = falloidina AF647; e Merge = immagine combinata contenente Ch2, Ch5 e Ch6). Il software fornisce una barra degli strumenti di visualizzazione dell'immagine per regolare per tabelle di ricerca, visualizzazione maschera e modalità colore/scala di grigi. Parte destra della schermata mostra l'area di analisi e la barra degli strumenti analisi. L'area di analisi contiene istogrammi e il dot plot come segue: 1) istogramma per trovare celle a fuoco secondo la funzionalità RMS gradiente della colorazione DAPI. 2) gating sulle cellule di T in base all'espressione di CD3 (Intensity_MC_Ch05, asse x) e il profilo di dispersione laterale (Intensity_MC_Ch01, asse y). 3) Gating su potenziali coppie di T-cellula/APC secondo le proporzioni della macchia DAPI (aspetto ratio_M02, asse y) e il profilo di dispersione laterale (Intensity_MC_Ch01, asse x). 4) gating su vere coppie di T-cellula/APC secondo la maschera di sinapsi di zona (asse x) e l'area della macchia CD3 (asse y). 5) gating su sinapsi immuni mature definite da arricchimento (> 30% contenuto di proteina nell'interfaccia) di CD3 (asse x) e F-actina (asse y) nella sinapsi immune. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.<!--

Figura 2: Imaging dati di citometria a flusso su CD3 e F-actina arricchimento nella sinapsi immune. Grafici di (A) il punto nel centro mostrano la percentuale di CD3 (asse x) e F-actina (asse y) nella sinapsi immune. T-cellula/APC si coniuga con una matura sinapsi immune in assenza (parte superiore) o presenza (parte inferiore) di SEB sono raffigurati. Le immagini sulla sinistra mostrano T-cellula/APC coppie con un basso grado di arricchimento CD3 e F-actina, mentre coppia T-cellula/APC con un alto grado di arricchimento CD3 e F-actina (maturo immuni sinapsi) di visualizzare le immagini sulla destra. Barra della scala = 10 µm (basso a sinistra). Il risultato è rappresentante di tre esperimenti indipendenti. (B-C) Significa CD3 (B) o l'arricchimento di F-actina (C) nella sinapsi immune in presenza o assenza di SEB è indicato come percentuale della proteina (n = 3; SE). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.