Method Article

Analisi qualitativa e quantitativa della sinapsi Immune nel sistema umano utilizzando Imaging citometria a flusso

DOI:

10.3791/55345

⸱

January 7th, 2019

 ,  , 
1Institute of Immunology, Section Molecular Immunology, University of Heidelberg

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, descriviamo un completo flusso di lavoro per l'analisi qualitativa e quantitativa del sistema immunitarie sinapsi tra cellule T umane primarie e cellule presentanti l'antigene. Il metodo si basa su imaging citometria a flusso, che permette l'acquisizione e la valutazione di diverse immagini di migliaia di cellule all'interno di un periodo di tempo relativamente breve.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La sinapsi immune è l'area di comunicazione tra le cellule di T e cellule presentanti l'antigene (APCs). Cellule T polarizzano recettori e proteine verso la sinapsi immune per assicurare un'associazione stabile e cambio di segnale. Microscopia confocale, TIRF o super-risoluzione classica sono stati usati per studiare la sinapsi immune. Poiché questi metodi richiedono acquisizione immagine manuale e quantificazione richiede molto tempo, l'imaging di eventi rari è impegnativo. Qui, descriviamo un flusso di lavoro che consente l'analisi morfologica di decine di migliaia di celle. Sinapsi immuni sono indotte tra cellule T umane primarie nelle preparazioni di pan-leucociti e cellule di Raji B SEB-caricato di Staphylococcus aureus enterotossina come APC. Acquisizione delle immagini viene eseguita con imaging citometria a flusso, anche chiamato microscopia In-Flow, che combina le caratteristiche di un citometro a flusso e un microscopio a fluorescenza. Una completa strategia di gating per l'identificazione delle cellule T/APC coppie e analizzando le sinapsi immuni è fornita. Come questo flusso di lavoro consente l'analisi di immunitario sinapsi in preparazioni non purificata pan-del leucocita e quindi richiede solo un piccolo volume di sangue (cioè, 1 mL), può essere applicato a campioni da pazienti. D'importanza, diversi campioni possono essere preparati, misurati e analizzati in parallelo.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cellule T sono importanti regolatori del sistema immunitario adattativo e vengono attivate attraverso peptidi antigenici che sono presentati nel contesto dei complessi di istocompatibilità (MHC). Attivazione a cellula T completo richiede due segnali, il segnale di competenza attraverso il recettore di antigene-specifiche cellule T (TCR) / CD3 complesso e il segnale di costimolazione tramite ricevitori accessori. Entrambi i segnali sono generati attraverso l'interazione diretta delle cellule di T con presentanti l'antigene (APCs) di cellule. APCs maturo forniscono il segnale di competenza per l'attivazione di cellule T attraverso complessi MHC-peptide, ed esprimono ligandi costimolazione (ad es., CD80 o CD86) per assicurare la progressione della cellula T di attivazione1. Una importante funzione di costimolazione è il riarrangiamento del citoscheletro actina2,3,4. La F-actina corticale è relativamente statico in cellule di T di riposo. Stimolazione delle cellule T attraverso antigene-cuscinetto APCs conduce ad una profonda riorganizzazione del citoscheletro. Dinamica dell'actina (cioè, veloce actina polimerizzazione/depolimerizzazione cerchi) attiva le cellule di T di creare forze che vengono utilizzate per il trasporto di proteine o organelli, ad esempio. Inoltre, il citoscheletro di actina è importante per lo sviluppo di una speciale zona di contatto tra le cellule di T e APC, chiamato sinapsi immune. Data l'importanza del citoscheletro alla sinapsi immune, è diventato essenziale per sviluppare metodi per quantificare i cambiamenti nel citoscheletro delle cellule T5,6,7,8 , 9.

Per mezzo di aiuti del citoscheletro di actina, recettori e proteine di segnalazione sono segregati nei cluster di attivazione supramolecolari (SMACs) all'interno della sinapsi immune. La stabilità della sinapsi immune è assicurata dall'associazione dei recettori ai pacchi di F-actina che aumentano l'elasticità del citoscheletro. Formazione della sinapsi immuni è stato indicato per essere critico per la generazione della risposta immune adattativa. Gli effetti nocivi di una formazione di sinapsi immunitaria difettosa in vivo in primo luogo sono stati realizzati in pazienti affetti da Wiskott Aldrich sindrome (WAS), una malattia in cui polimerizzazione dell'actina e, simultaneamente, la formazione della sinapsi immuni sono disturbati10 . ERA i pazienti possono soffrire di eczema, gravi infezioni ricorrenti, malattie autoimmuni e melanomi. Nonostante questa individuazione, attualmente non è noto se la formazione della sinapsi immuni è diverso nelle cellule T di individui sani e pazienti affetti da malattie autoimmuni o difetti immuni.

Microscopia a fluorescenza, compresi confocale, TIRF e microscopia di Super-risoluzione, sono stati utilizzati per scoprire l'architettura del sistema immunitario sinapsi11,12,13,14. L'alta risoluzione di questi sistemi e la possibilità di effettuare formazione immagine della vivere-cella consente la raccolta di informazioni esatte, spazio-temporali su citoscheletro e proteine di superficie o intracellulare nella sinapsi immune. Molti risultati, tuttavia, sono basati sull'analisi di solo poche decine di cellule T. Inoltre, le cellule T devono essere depurate per questi tipi di microscopia a fluorescenza. Tuttavia, per molte domande di ricerca, l'uso di cellule impura, piuttosto che la risoluzione massima possibile è della massima importanza. Ciò è rilevante se le cellule di T dai pazienti vengono analizzate, dato che l'importo delle donazioni di sangue è limitato e potrebbe esserci la necessità di elaborare molti campioni in parallelo.

Abbiamo stabilito metodi microscopici che consentono l'analisi del citoscheletro nella sinapsi immune nel sistema umano15,16,17. Questi metodi sono basati su citometria a flusso, anche denominato In-Flow microscopia18di imaging. Come un ibrido tra microscopia di fluorescenza e citometria a flusso multispettrale, citometria a flusso di imaging ha suoi punti di forza nell'analizzare parametri morfologici e la localizzazione della proteina in popolazioni eterogenee delle cellule, quali pan-leucociti dalla nel sangue periferico. Abbiamo introdotto una metodologia che permette di quantificare F-actina in coniugati di T-cellula/APC di cellule T umane da campioni di sangue intero, senza la necessità di lunghe e costose purificazione passaggi17. La tecnica qui presentata comprende l'intero flusso di lavoro, di ottenere il campione di sangue per la quantificazione di F-actina nella sinapsi immune.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. preparazione del Pan-leucociti

  1. Disegnare 1 mL di sangue periferico da un donatore sano (o paziente) in una siringa eparinizzata. Assicurarsi di avere l'approvazione del comitato etico competente per la donazione di sangue.
  2. Mescolare 1 mL di periferico umano sangue con 30 mL di tampone di lisi ACK (150mm NH4Cl, 1 mM KHCO3e 0,1 mM EDTA, pH 7,0) in una provetta da 50 mL e incubare per 8 min a temperatura ambiente.
  3. Riempire le provette con PBS e centrifugare a 300 x g per 6 min. aspirare il supernatante e risospendere il pellet in 30 mL di tampone di lisi ACK.
  4. Ripetere i passaggi 1.2 e 1.3 il supernatante è chiaro. Infine, lavare le cellule in PBS, centrifugare a 300 x g per 6 min a temperatura ambiente e risospendere il pellet cellulare in 2 mL di terreno di coltura (RPMI1640 + 10% FCS). Incubare le cellule a 37 ° C per 60 min.

2. caricamento di Raji cellule con SEB

  1. Preparare due provette di Falcon da 15 mL con 1.5 x 106 cellule di Raji per tubo. Rotazione verso il basso le cellule (300 x g per 6 min a temperatura ambiente) e scartare il surnatante.
  2. Risospendere le cellule in medium residua (circa 50 – 100 µ l), µ l 1,9 (1,9 µ g) SEB e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti aggiungere 5 mL di terreno di coltura, rotazione verso il basso le cellule (300 x g per 6 min a temperatura ambiente) e risospendere il pellet in terreno di coltura (RPMI 1640 + 10% FCS) ad una densità di 1 x 106 cellule/mL.

3. induzione di sinapsi immuni e protocollo di colorazione

  1. Pipettare 500 µ l della preparazione delle cellule di Raji SEB-caricato in un tubo di FACS e 500 µ l della preparazione delle cellule di Raji scaricate in un altro tubo di FACS. Aggiungere 650 µ l di pan-leucociti in ciascuna provetta e centrifugare le cellule (300 x g per 10 min a temperatura ambiente). Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 150 µ l di terreno di coltura (RPMI1640 + 10% FCS). Incubare a 37 ° C (in genere per 45 min).
  2. Vortice di delicatamente le cellule (10 s a 1.000 giri/min) e aggiungere 1,5 mL di paraformaldeide (1,5%) durante il vortice per fissare le cellule. Fermare la fissazione aggiungendo 1 mL di PBS + BSA 1%. Appallottolare le celle (300 x g per 10 min a temperatura ambiente e risospensione del pellet in 1 mL di PBS + BSA 1% dopo incubazione a temperatura ambiente per 10 min.
  3. A pellet (300 x g per 10 min a temperatura ambiente) e risospendere le cellule in 100 µ l di PBS + BSA 1% + 0,1% saponina per 15 min a temperatura ambiente per permeabilize le cellule (piastra 96 pozzetti, a forma di U).
  4. Lavare le cellule in PBS + BSA 1% + 0,1% saponina con centrifugazione (300 x g per 10 min a temperatura ambiente) e risospendere il pellet cellulare in 50 µ l di PBS + BSA 1% + 0,1% saponina contenenti anticorpi fluorophore-etichettati o composti (CD3-PE-TxRed (01:30), Phalloidin-AF647 (1: 150) e DAPI (1:3, 000)).
  5. Incubare le cellule a temperatura ambiente al buio per 30 min. lavare le cellule 3 volte aggiungendo 1 mL di PBS + BSA 1% + 0,1% saponina. Centrifugare a 300 x g per 10 min a temperatura ambiente. Re-risospendere le cellule in 60 µ l di PBS per imaging citometria a flusso.

4. acquisizione immagini utilizzando un citometro a flusso

Nota: La seguente immagine acquisizione procedura e analisi dei dati si basano su citometria a flusso utilizzando un software come imagestream (IS100), INSPIRE e le idee di imaging. Tuttavia, altri software di analisi e citometri a flusso può anche essere utilizzato.

  1. Aprire il software di analisi sul computer collegato al citofluorimetro imaging e fare clic su inizializzare Fluidics di menu strumento. Applicare le perline sulla porta destra quando viene richiesto di farlo.
  2. Caricare il modello predefinito dal menu File e fare clic su Esegui/Setup. Scegliere perle dal menu a discesa Visualizza.
  3. Regolare l'illuminatore luminoso-campo cliccando sul intensità impostata se il valore indicato è inferiore a 200.
  4. Eseguire la taratura e routine di test nella scheda Assist cliccando su Start tutto.
  5. Fare clic su Flush/blocco/carico e applicare i campioni nella porta di sinistra quando viene richiesto di farlo. Dopo aver caricato le cellule nel citometro a flusso, aprire il classificatore di cella e regolare i valori come segue: limite massimo di intensità di picco a 1.022 per ogni canale, picco intensità limite inferiore a 50 per canale 2 (DAPI) e 5 (CD3-Pe-TxR), il limite inferiore zona a 50 per canale 1 (dispersione laterale) e limite superiore a 1.500.
  6. Modificare la potenza del laser di eccitazione a 405 nm (15 mW), 488 nm (200 mW) e 647 nm (90 mW) nella scheda impostazione.
  7. Attivare il menu a discesa Visualizza tra cellule e perline per valutare le regolazioni di potenza cella classificatore e laser.
    Nota: Assicurarsi che tutte le cellule e cellula coppie trovano la vista di cella e cella ciuffi, detriti e immagini con pixel saturi si trovano nella visualizzazione detriti cambiando i classificatori di cellulare e/o i poteri del laser di eccitazione.
  8. Definire il nome del campione e la quantità di immagini da acquisire (15.000-25.000 per campioni) e 500 per i controlli di compensazione nella scheda di installazione fare clic su Esegui/Setup per avviare l'acquisizione.

5. analisi dei dati

  1. Trasferire i file di immagine raw (. Rif) sul computer di analisi dati e aprire il software di analisi.
  2. Produrre una matrice di incremento retributivo seguendo le istruzioni del menu a discesa di compensazione. Salvare la matrice di compensazione come comp_Date.ctm.
  3. Aprire un file di immagine raw di esempio (. Rif) e applicare il comp_Date.ctm nella finestra che viene visualizzata per produrre i file di immagine compensata (CIF) e il file di analisi di dati predefinito. (DAF).
  4. Aprire il file di immagine compensata. Convertire le immagini in modalità colore e regolare le tabelle di ricerca per ottenere colori ottimali visibili nella barra degli strumenti Proprietà Galleria dell'immagine. Ottenere un'immagine RGB-fuse utilizzando la scheda composita della barra degli strumenti Proprietà Galleria dell'immagine.
  5. Aprire il gestore di maschera dal menu a discesa di analisi. Creare maschere per definire le cellule di T e la sinapsi immune, come segue:
    1. Selezionare la maschera di T-cellula: "(Fill (Threshold_Ch05, 60)." Selezionare la maschera di valle: "Valley(Ch02,3)." Selezionare la maschera di sinapsi della cellula T: "maschera di cellula T AND Valley (M02, Ch02, 3)."
  6. Aprire il gestore di funzionalità dal menu a discesa di analisi. Calcolare le seguenti caratteristiche:
    1. Per l'espressione totale di CD3 in cellule di T, selezionare "Intensity_T-cells_Ch5." Per la quantità totale di F-actina nelle cellule T, selezionare "Intensity_T-cells_Ch6." Per CD3 espressione nella sinapsi immune, selezionare "Intensity_T-cellulare synapse_Ch5.." Per la quantità di F-actina nella sinapsi immune, selezionare "Intensity_T-cellulare synapse_Ch6.."
    2. Per calcolare l'area di T-cella, selezionare "Area_T-cellule." Per calcolare l'area di sinapsi immunitaria T-cellula, selezionare "sinapsi Area_T-cella."
  7. Determinare la F-actina e CD3 arricchimento nella sinapsi immune utilizzando l'equazione in funzione di gestione:
    figure-protocol-1
  8. Applicare la seguente strategia di gating tramite istogrammi e puntino trame l'area di analisi (per maggiori dettagli, vedi riferimenti 17 e 19):
    1. Scartare le cellule out-of-focus tracciando il "gradiente RMS_M2_Ch2" in un istogramma; impostare la soglia a 15.
    2. Tracciare il CSD contro CD3 intensità in una trama di dot. Impostare un cancello su eventi di CD3-positive.
    3. Trama "Aspect ratio" di M02 (macchia di DAPI) contro la zona di M02 (Dapi macchia). Cancello il Canottiere T-cellula e cellula coppie di conseguenza. Correggere per le coppie di true cella utilizzando l'area della maschera sinapsi, come descritto in precedenza17,19.
    4. Determinare la quantità di F-actina in cellule di T di coppie di T-cellula/APC e canottiere T-cellula e la percentuale di F-actina nella sinapsi immune.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Degli obiettivi principali del metodo descritto qui è la quantificazione dell'arricchimento di proteine (ad es., -F-actina) nella sinapsi immunitaria tra APC (cellule di Raji) e cellule di T in impura pan-leucociti prelevati campioni di sangue umano di basso volume (1 mL) di surrogati. Nella schermata nella Figura 1 fornisce una panoramica della strategia di gating critica di questo metodo. Mostra la Galleria immagini a sinistra e l'area di analisi sulla destra (...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il flusso di lavoro qui presentato consente la quantificazione di immuni sinapsi tra cellule T umane (ex vivo) e APC. In particolare, dell'eritrocito-lisate pan-leucociti sono stati utilizzati come fonti di cellule T, rendendo superfluo fasi di purificazione della T-cellula. La linea cellulare di linfoma della B-cellula Raji servita come surrogato APCs. Questo comporta notevoli vantaggi, poiché permette confronti tra i donatori di sangue del lato della T-cellula della sinapsi immune. Inoltre, DCs autologo sono difficilme...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il lavoro è stato finanziato dal Consiglio di ricerca tedesco (DFG) con sovvenzioni No. SFB-938-M e SA 393/3-4.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
>Multifuge 3 SRHeraeus
RPMI 1640LifeTechnologies#11875085500 mL
FCSPan Biotech#3302-P101102
Polistirene Provetta a Fondo TondoFalcon#3520545 mL
KulturflascheThermo Scientific#178883
salina tamponata con fosfato di DulbeccoSigmaD8662
Siero bovino Albumina Roth#8076.3
SaponinaSigmaS7900
ParaformaldeideSigma Aldrich#16005
FACS Lavaggio SaponinaPBS 1% BSA 0.15 Saponina
ReaktiosgefaBSarstedt72.699.0020.5 mL
Velocità BeadAmnis# 400041
Minishaker MS1IKA Funziona MS1
MikrotiterplatteGreiner Bio One#65010196U
Enterotossina SEBSigma AldrichS4881
DAPISigma AldrichD95421:3000
CD3-PeTxRInvitrogenMHCD03171:30
Sonde molecolariFalloidina-AF647A222871:150
IS100AmnisCitometro a flusso per immagini
IDEASAmnisSoftware
INSPIREAmnisSoftware
Soluzione

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy. Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).
  2. Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration. Journal of leukocyte biology. 73 (1), 30-48 (2003).
  3. Samstag, Y., John, I., Wabnitz, G. H. Cofilin: a redox sensitive mediator of actin dynamics during T-cell activation and migration. Immunol Rev. 256 (1), 30-47 (2013).
  4. Comrie, W. A., Burkhardt, J. K. Action and Traction: Cytoskeletal Control of Receptor Triggering at the Immunological Synapse. Front Immunol. 7, 68(2016).
  5. Piragyte, I., Jun, C. D. Actin engine in immunological synapse. Immune Netw. 12 (3), 71-83 (2012).
  6. Rossy, J., Pageon, S. V., Davis, D. M., Gaus, K. Super-resolution microscopy of the immunological synapse. Curr Opin Immunol. 25 (3), 307-312 (2013).
  7. Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J Vis Exp. (85), (2014).
  8. Comrie, W. A., Babich, A., Burkhardt, J. K. F-actin flow drives affinity maturation and spatial organization of LFA-1 at the immunological synapse. J Cell Biol. 208 (4), 475-491 (2015).
  9. Markey, K. A., Gartlan, K. H., Kuns, R. D., MacDonald, K. P., Hill, G. R. Imaging the immunological synapse between dendritic cells and T cells. J Immunol Methods. 423, 40-44 (2015).
  10. Bouma, G., Burns, S. O., Thrasher, A. J. Wiskott-Aldrich Syndrome: Immunodeficiency resulting from defective cell migration and impaired immunostimulatory activation. Immunobiology. 214 (9-10), 778-790 (2009).
  11. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
  12. Dustin, M. L., Depoil, D. New insights into the T cell synapse from single molecule techniques. Nature reviews. Immunology. 11 (10), 672-684 (2011).
  13. Mace, E. M., Orange, J. S. New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques. Front Immunol. 3, 421(2012).
  14. Yokosuka, T., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
  15. Wabnitz, G. H., et al. Sustained LFA-1 cluster formation in the immune synapse requires the combined activities of L-plastin and calmodulin. European journal of immunology. 40 (9), 2437-2449 (2010).
  16. Wabnitz, G. H., et al. L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells. Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).
  17. Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse. J Immunol Methods. , (2015).
  18. Basiji, D., O'Gorman, M. R. Imaging flow cytometry. J Immunol Methods. 423, 1-2 (2015).
  19. Wabnitz, G. H., Samstag, Y. Multiparametric Characterization of Human T-Cell Immune Synapses by InFlow Microscopy. Methods Mol Biol. 1389, 155-166 (2016).
  20. Balta, E., et al. Qualitative and quantitative analysis of PMN/T-cell interactions by InFlow and super-resolution microscopy. Methods. , (2016).
  21. Hochweller, K., et al. Dendritic cells control T cell tonic signaling required for responsiveness to foreign antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5931-5936 (2010).
  22. Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Immune SynapseImaging Flow CytometryT Cell APC ConjugatesCD3 Expression AnalysisF actin EnrichmentPan leukocyte PreparationSEB loaded Raji CellsGating StrategyProtein QuantificationHuman Blood Sample

Related Articles