L'uso di traccia Eyeblink condizionamento classico per valutare la disfunzione Hippocampal in un modello del ratto dei disturbi dello spettro fetale alcol

Sommario

Traccia eyeblink condizionamento classico (ECC) è stata usata per valutare apprendimento associativo hippocampal-dipendenti nei ratti adulti che sono stati somministrati un'alta concentrazione (11,9% v/v) di alcol durante lo sviluppo iniziale del cervello neonatale. In generale, le procedure ECC sono suoni strumenti diagnostici per la rilevazione di disfunzione del cervello attraverso molti contesti psicologici e biomedicale.

Abstract

Ratti neonatali sono stati amministrati una concentrazione relativamente alta di alcool etilico (11,9% v/v) durante giorni postnatali 4-9, un momento in cui il cervello fetale subisce rapidi cambiamenti organizzativi ed è simile a accelerato cambiamenti cerebrali che si verificano durante il terzo acetonide in esseri umani. Questo modello dei disordini di spettro di alcool fetale (FASDs) produce gravi danni cerebrali, che imita la quantità e il modello di binge drinking che si verifica in alcune madri alcoliche incinte. Descriviamo l'uso di traccia eyeblink condizionamento classico (ECC), una variante di ordine superiore di apprendimento associativo, per valutare la disfunzione hippocampal a lungo termine che in genere è visto nella prole adulto alcol-esposti. A 90 giorni di età, roditori erano chirurgicamente preparati con registrazione e stimolanti elettrodi, che ha misurato elettromiografici (EMG) lampeggiano attività dal muscolo della palpebra sinistra e consegnato lieve scossa posteriore all'occhio sinistro, rispettivamente. Dopo un periodo di recupero di 5 giorni, hanno subito 6 sessioni di traccia ECC per determinare le differenze di apprendimento associativo tra alcool-esposti e ratti di controllo. Traccia ECC è uno dei molti possibili procedure ECC che possono essere facilmente modificate utilizzando le stesse attrezzature e software, cosicché diversi sistemi neurali possono essere valutati. Procedure ECC in generale, possono essere utilizzate come strumenti diagnostici per la rilevazione di patologia neurale in diversi sistemi cerebrali e diverse condizioni che insultano il cervello.

Introduzione

È piuttosto difficile immaginare che, nell'era attuale caratterizzata da migliori cure mediche e maggiore accesso ai servizi sanitari, l'abuso di alcol rimanga un problema sanitario globale di grande rilevanza. Sfortunatamente, si è dimostrato che una madre in gravidanza che consuma elevate quantità di alcol può dare alla luce un bambino con gravi danni cerebrali e disturbi neurosviluppali permanenti, come evidente nei casi di sindrome da alcol fetale (FAS)^1,2,3. Nelle donne con una storia confermata di consumo materno di alcol, il feto in via di sviluppo è inoltre suscettibile a piccole quantità di alcol o a diversi schemi di consumo alcolico che determinano variazioni delle concentrazioni ematiche di alcol. In questo secondo caso, sebbene i bambini non presentino gravi alterazioni morfologiche o neurocomportamentali come quelli affetti da FAS, possono comunque manifestare disabilità cognitive permanenti e disturbi emotivi di intensità variabile, da lieve a grave^3,4. Nel complesso, la FAS e le forme meno gravi di alterazioni prenatale indotte dall'alcol costituiscono un insieme di disturbi dello spettro alcolico fetale (FASDs). Non sorprende che i FASDs siano completamente prevenibili, ma sorprendentemente le stime indicano che nelle popolazioni in cui l'abuso di alcol è molto diffuso, questi disturbi rimangono la principale causa non genetica di disabilità neurale e cognitiva, colpendo circa il 2%–5% dei bambini negli Stati Uniti e in paesi europei come Francia e Svezia. Per quanto riguarda l'incidenza della sola FAS negli Stati Uniti, la prevalenza è di 2–7 casi ogni 1.000 nati vivi⁵, il che implica che l'incidenza complessiva dei FASDs sia molto più elevata rispetto a quella della FAS.

Studi di neuroimaging condotti su bambini con disturbi dello spettro alcolico fetale (FASD) hanno mostrato che presentano anomalie cerebrali, come un corpo calloso più sottile⁶, un verme cerebellare anteriore più piccolo⁷ e un ippocampo ridotto⁸. Queste anomalie cerebrali sottendono alcune delle alterazioni neurocognitive a lungo termine osservate nei bambini con FASD. I collegamenti precisi tra le variazioni dei cambiamenti cerebrali indotti dall’alcol materno e le variazioni nel profilo (ovvero tipo ed entità) di specifici deficit neurocognitivi non sono ancora stati chiaramente definiti. Tuttavia, come punto di partenza, l’ippocampo rappresenta un eccellente candidato per determinarne la suscettibilità agli effetti dell’alcol prenatale. Infatti, i bambini con FASD mostrano deficit in comportamenti mediati dall’ippocampo, come l’apprendimento del luogo^9,10 e il richiamo differito degli oggetti¹¹.

I modelli rodentici dei DASF si sono rivelati inestimabili per chiarire i meccanismi alla base delle alterazioni neurocognitive osservate nei bambini affetti da DASF. Un modello ben consolidato di esposizione acuta, da noi adottato, prevede la somministrazione di alcol a ratti durante i giorni postnatali 4-9.^12,13, un periodo in cui il cervello subisce una rapida formazione di sinapsi e contatti dendritici, paragonabile alla ventiquattresima settimana fetale umana e protrattosi oltre la 3^rd trimestre^14,15,16,17Questo modello induce una significativa perdita di neuroni nell'ippocampo^18,19 e neuroni in molte altre regioni cerebrali come il cervelletto^{12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23}, accompagnata da gravi deficit nelle funzioni cognitive che interessano diversi domini^21,24,25. Le alterazioni cognitive dovute all'esposizione precoce all'alcol nei ratti possono essere valutate in diversi modi, in particolare con condizionamento classico del riflesso palpebrale (ECC). L'ECC è un paradigma utilizzato da oltre un secolo per indagare scientificamente le basi fondamentali dell'apprendimento^26,27 e in quanto tale, fornisce un metodo utile per comprendere meglio le conseguenze neurocognitive avverse derivanti dall'esposizione prenatale all'alcol. Si tratta di un paradigma molto flessibile che consente agli sperimentatori di utilizzare una varietà di diverse procedure di condizionamento classico (ECC), ciascuna delle quali può essere esaminata in numerose specie di mammiferi lungo la scala filogenetica (dal topo all'uomo) e in diverse fasi dello sviluppo cerebrale^28,29,30,31Inoltre, i circuiti neurali fondamentali che mediato l'apprendimento associativo in questo paradigma sono supportati da dati sperimentali e rapporti neuropsicologici in queste stesse specie^{26,32,33,34,35,36,37}.

Una forma di ECC, l'ECC a traccia, è illustrata in questo articolo (Figura 1). A scopo di confronto, essa viene messa a paragone con la forma più tradizionale: l'ECC a ritardo. Il paradigma ECC si ispira al condizionamento classico condotto sui cani dal fisiologo premio Nobel Ivan Pavlov. Pavlov scoprì che certi stimoli, come i toni, non provocano naturalmente la salivazione, ma quando precedono e si sovrappongono alla presentazione del cibo, la risposta salivare può essere rafforzata da ripetute associazioni tra i due stimoli, purché questa contingenza tra tono e cibo venga mantenuta. Questo rappresenta un esempio di ECC a ritardo, in cui la forza associativa è mediata dalla contiguità temporale immediata tra i due stimoli, creando così condizioni ottimali per l'apprendimento in un animale. Pavlov testò anche altre variazioni della contingenza tono-cibo, ad esempio spegnendo il tono e lasciando un intervallo di "traccia" prima di somministrare il cibo. Quando i due stimoli erano sufficientemente discontigui, risultava molto più difficile per i cani produrre risposte salivatorie prima della somministrazione del cibo. La discontiguità tra lo spegnimento del tono e la somministrazione del cibo rappresenta quindi un esempio di ECC a traccia. Poiché i roditori non salivano naturalmente in presenza di cibo, si utilizzano stimoli più pertinenti alla specie, come una lieve scossa; inoltre, non emettono naturalmente risposte difensive di ammiccamento a un tono. In questo contesto, le procedure di ECC nei roditori prevedono la presentazione di un tono a un determinato livello di decibel, abbinato in qualche modo a una lieve scossa applicata al muscolo della palpebra (orbicularis oculi) o al muscolo temporalis, al fine di indurre una risposta di ammiccamento. Il tono è considerato uno stimolo condizionato (CS), mentre la scossa è considerata uno stimolo incondizionato (US). Nell'ECC a ritardo, il CS viene presentato per primo e rimane attivo per una certa durata. Successivamente, viene somministrato l'US. I due stimoli si sovrappongono per un certo periodo e terminano contemporaneamente; la risposta di ammiccamento prodotta in seguito all'US è considerata una risposta incondizionata (UR). In questa procedura, i roditori imparano a produrre risposte di ammiccamento dopo la presentazione del CS, ma subito prima dell'US, per anticipare questo stimolo avversivo. La risposta di ammiccamento appresa è chiamata risposta condizionata (CR). Nell'ECC a traccia, il CS e l'US sono separati da un intervallo di tempo privo di stimoli, noto come intervallo di traccia; non si sovrappongono nel tempo, a differenza dell'ECC a ritardo. Durante questo intervallo, l'animale deve risolvere i requisiti associativi tra gli stimoli. Analogamente all'ECC a ritardo, l'apprendimento avviene quando l'animale emette in modo consistente una risposta di ammiccamento dopo lo spegnimento del CS, ma immediatamente prima della somministrazione dell'US. Dopo un certo numero di sessioni di acquisizione (CS abbinato a US), si sviluppano curve di apprendimento (basate su diverse misurazioni della CR). Studi di lesione e di neuroimaging mostrano che un apprendimento efficace nell'ECC a ritardo dipende dall'integrità della circuitazione neurologica cervelletto-tronco encefalico^38,39,40, mentre l'ECC a traccia è una procedura di ordine superiore che richiede un coinvolgimento neurale aggiuntivo dell'ippocampo^41,42,43,44 e di altre strutture corticali^45,46. A causa dei requisiti temporali necessari per acquisire con successo le CR a traccia, questo compito risulta più difficile da apprendere (anche per soggetti normali).

Figura 1: Condizionamento classico del riflesso palpebrale con intervallo di traccia. Viene mostrata un'effettiva forma d'onda rappresentativa di un ratto adulto nel gruppo di controllo non intubato (UC). Prima viene presentato il CS tono (85 dB, 2,8 kHz) per 380 ms. Segue un intervallo di traccia di 500 ms, durante il quale non sono presenti stimoli. Successivamente viene somministrato uno shock US (1,6 mA) per 100 ms. L'apprendimento riuscito in questo compito si verifica quando aumenta, nel corso di molte sessioni di allenamento, la frequenza (%) o l'ampiezza (in volt) dei battiti delle palpebre durante la finestra temporale della risposta condizionata (CR) (periodo totale di CR). In particolare, i roditori con un ippocampo integro emettono solitamente un numero maggiore di CR ben sincronizzate (CR adattative) appena prima dell'inizio dello shock US (entro una finestra di 200 ms). Vengono inoltre misurate le risposte di startle (SR) nei primi 80 ms successivi all'inizio del tono CS e le risposte incondizionate (UR). Le SR non associative sono tipicamente basse o assenti nei roditori ben addestrati, mentre ci si aspetta che le UR abbiano alta frequenza e ampiezza. Questo compito richiede che il roditore impari a collegare l'offset del CS con l'onset dell'US (durante l'intervallo di traccia), rendendolo intrinsecamente più difficile da acquisire rispetto al condizionamento classico di tipo delay (ECC). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Qui dimostriamo le conseguenze funzionali avverse dell'esposizione all'alcol in età neonatale somministrata in modo simile a un binge, valutate mediante una procedura di condizionamento classico con intervallo (ECC) che prevede un tono di 85 dB come stimolo condizionato (CS) (2,8 kHz) mantenuto per 380 ms, seguito da una scossa di 1,6 mA come stimolo incondizionato (US) mantenuta per 100 ms, con un intervallo tra questi stimoli di 500 ms. In studi precedenti abbiamo descritto l'utilità di questo test comportamentale nell'esaminare l'intervento della colina e la supplementazione di ferro nel ridurre gli effetti dell'esposizione all'alcol in età neonatale^18,47. In effetti, l'ECC con intervallo può essere utilizzato come strumento diagnostico per valutare le alterazioni ippocampali indotte dall'alcol in età neonatale. Il vantaggio rispetto all'ECC di tipo ritardato è che risulta più sensibile nel rilevare alterazioni della funzione ippocampale, compromessa nei soggetti umani con disturbi dello spettro alcolico fetale (FASD).

La dimostrazione dell'ECC ha applicazioni che vanno ben oltre il campo dell'alcolismo fetale. Molte varianti dell'ECC (ad es., ritardo, traccia, composto, inversione) possono essere utilizzate per chiarire le differenze ontogenetiche nell'apprendimento durante lo sviluppo, le basi neurobiologiche dell'apprendimento associativo nei mammiferi normali, nonché le vulnerabilità di diversi sistemi cerebrali a molteplici condizioni avverse, tra cui (ma non solo) teratogeni, tossine ambientali, traumi cranici, malattie neurodegenerative e disturbi psichiatrici.

Protocollo

NOTA: Tutte le procedure sono state approvate ed eseguite in conformità con le politiche stabilite dall'IACUC della East Carolina University. I ratti Long-Evans sono stati ottenuti accoppiando femmine con maschi riproduttori. I cuccioli dei tre gruppi di trattamento (vedi 1.1) provenivano dalla stessa nidiata di una singola madre. Sono state prodotte cinque nidiate e ciascuna è stata ridotta a 8 cuccioli al terzo giorno postnatale (PD 3). I due cuccioli rimanenti di ogni nidiata sono stati assegnati a esperimenti separati. Nello studio sono stati inclusi prole maschile e femminile (uno per gruppo di esposizione). In totale, sono stati esaminati N = 27 esemplari adulti; 3 ratti sono stati esclusi a causa di fili rotti del dispositivo 3T (vedi 3.1.1), impossibili da riparare il primo giorno di allenamento ECC.

1. Preparazione dei gruppi, dei materiali e delle soluzioni

1. Al terzo giorno postnatale, rimuovere i cuccioli dalla madre e posizionarli su un tappetino riscaldante ad acqua termoregolato per mantenerli al caldo. Utilizzare un procedimento di selezione casuale per assegnare i cuccioli di ratto a uno dei tre gruppi: (1) intubati con alcol (AI); (2) controllo intubato fittizio (SI); o (3) controllo non intubato (UC). Eseguire le procedure approvate per l'identificazione, come il tatuaggio delle zampe con inchiostro [non tossico] mediante un ago da 30G x 1/2 pollice seguendo uno schema numerico. Reintrodurre i cuccioli dalla madre al termine del tatuaggio.
2. Preparare un tubo (o più tubi) per intubazione intragastrica utilizzando polietilene (PE) calibro 50 e 10. La lunghezza complessiva di questo tubo dipende dall'utilizzatore ed è regolabile di conseguenza.
   1. Utilizzare forbici da microdissezione per tagliare un pezzo di tubo PE-50 lungo 3 pollici e un pezzo di tubo PE-10 lungo 6 pollici.
   2. Collegare con attenzione il tubo PE-50 a un ago ipodermico sterile da 22 G x 1 pollice.
   3. Inserire un’estremità del tubo PE-10 nell’estremità aperta del tubo PE-50. Potrebbe essere necessario effettuare un taglio diagonale all’estremità del tubo PE-10 per facilitarne l’inserimento nel tubo PE-50.
   4. Tagliare un piccolo pezzo di tubo PE-50 (circa 2-3 mm) e inserirlo sull’estremità aperta del tubo PE-10. Questo fungerà da fermo visivo.
   5. Conservare il tubo completo per intubazione intragastrica in alcol isopropilico fresco al 70% per mantenerlo sterile.
3. Applicare procedure asettiche per preparare una soluzione di latte stock in bottiglie da 50 mL. La soluzione di latte stock si basa su una formula dietetica inizialmente sviluppata da West et al. (1984)⁴⁸. Conservare le bottiglie a -18 °C fino al momento dell’uso. Scongelare due bottiglie di latte utilizzando acqua calda prima dell’uso.
   1. Aspirare 7,16 mL di alcol etilico al 95% (USP) utilizzando una siringa sterile e aggiungerlo a una bottiglia da 50 mL di latte. Questo produce una soluzione alcolica al 11,9% v/v che viene somministrata ai cuccioli di ratto durante i primi due pasti della giornata (vedere punto 2.1.1); la dose giornaliera totale di alcol è di 5,25 g/kg/giorno. La soluzione è formulata per somministrare l’alcol in un volume (0,0278 mL/g per pasto) all’interno di una soluzione di latte arricchito.
      NOTA: Questa quantità può essere adattata in base alla dimensione della nidiata e al consumo previsto nell’arco di 3-4 giorni. La quantità di alcol aggiunta deve essere regolata di conseguenza per ottenere una soluzione al 11,9% v/v.
   2. Agitare bene questa bottiglia ed etichettarla in modo appropriato (ovvero, Alcol Etilico al 11,9% v/v in Latte).
   3. Etichettare in modo appropriato la seconda bottiglia di latte (senza alcol aggiunto) (ad esempio, Solo Latte) e utilizzarla per i pasti supplementari come indicato al punto 2.1.1.
   4. Conservare entrambe le bottiglie di latte in frigorifero.

2. Esposizione all'alcol nei neonati (giorni postnatali 4-9)

1. Somministrare ai cuccioli AI e SI un totale di 4 intubazioni al giorno a partire dal PD 4. Separare ogni intubazione di 2 h. Poiché i cuccioli AI vengono intubati con una soluzione effettiva, ciascuna delle loro intubazioni è considerata un pasto.
   1. Intubare i cuccioli AI con la soluzione al 11,9% v/v di alcol etilico nel latte durante i primi due pasti della giornata, quindi intubarli con la soluzione solo latte durante gli ultimi due pasti della giornata per integrarne la crescita.
   2. Intubare i cuccioli SI 4 volte senza alcuna soluzione ogni due ore, assicurando la stessa durata di esposizione al tubo PE-10 subita dai cuccioli AI. Il gruppo UC non riceve alcuna intubazione.
2. Rimuovere i cuccioli dalla madre e posizionarli su un tappetino riscaldante a circolazione d'acqua per mantenerli al caldo. Pesare ogni cucciolo e registrare il suo peso corporeo (in g). Consultare una tabella predefinita per l'alimentazione per determinare il volume di intubazione per ciascun cucciolo AI e annotarlo su un foglio di registro.
   1. Collocare la soluzione al 11,9% v/v di alcol etilico nel latte in un bagno a temperatura controllata e agitarla accuratamente.
   2. Procedura di intubazione intragastrica:
      1. Sciacquare accuratamente il tubo per intubazione intragastrica, precedentemente conservato in alcol isopropilico al 70%, con acqua tiepida.
      2. Prelevare la quantità corretta di soluzione utilizzando una siringa sterile da 1 mL.
      3. Immergere la punta del tubo di intubazione (estremità PE-10) in olio di mais fresco (questo facilita l'inserimento).
      4. Misurare la lunghezza del tubo PE-10 dalla bocca del cucciolo fino allo stomaco. Regolare il fermo PE-50 in modo da indicare il punto di arresto.
      5. Inserire con attenzione il tubo PE-10 nella bocca del cucciolo, procedendo lungo l'esofago, superando leggermente lo sfintere gastroesofageo ed entrando nello stomaco. Osservare il cucciolo, stabilizzarlo e premere lo stantuffo della siringa per somministrare la soluzione. Eseguire questa operazione lentamente.
         NOTA: Per evitare di inserire accidentalmente il tubo nella trachea, indirizzare inizialmente il tubo in modo che curvi e venga a contatto con il palato molle prima di procedere in avanti. Utilizzare il palato come guida, poiché il tubo verrà naturalmente deviato da questa zona e diretto verso l'esofago. Qualsiasi deviazione significativa della punta in direzione ventrale potrebbe farlo entrare nella trachea. È preferibile rimuovere il tubo e non proseguire con l'intubazione se non si è certi della sua posizione di ingresso; reinserire correttamente il tubo al tentativo successivo.
      6. Rimuovere con attenzione il tubo PE-10 ed esaminare il cucciolo per verificare la presenza di rigurgito della soluzione, sangue o lesioni fisiche. Riposizionare il cucciolo con i suoi fratelli se non presenta anomalie. L'intera procedura di intubazione richiede approssimativamente meno di 1 min per ogni cucciolo e circa 4 min in totale per i 4 cuccioli sottoposti a intubazione in ogni nidiata (2 AI, 2 SI).
      7. Procedura di intubazione intragastrica per i cuccioli SI: seguire lo stesso procedimento di inserimento del tubo PE-10 previsto per i cuccioli AI, ma senza somministrare alcuna soluzione e per la stessa durata (1 min).
      8. Riportare immediatamente tutti i cuccioli dalla madre al termine della procedura sull'ultimo cucciolo della nidiata. Riportare la madre nel vivario fino alla successiva sessione di alimentazione (tra 2 h).
      9. Sciacquare il tubo per intubazione intragastrica con acqua sterile tiepida e riporlo nell'alcol isopropilico al 70% per la conservazione. Sciacquare accuratamente il tubo con acqua prima di ogni sessione di alimentazione.
      10. Ripetere i punti da 2.2 (escluso il pesaggio dei cuccioli) a 2.2.2.9 per la seconda sessione di alimentazione. Durante gli ultimi due pasti, intubare i cuccioli AI con la soluzione solo latte, utilizzando gli stessi volumi di intubazione determinati in 2.2.
3. Pesare i ratti a intervalli regolari, ad esempio al PD 15 (quando aprono gli occhi), PD 21 (svezzamento), PD 30, PD 60 e PD 90 (intervento chirurgico), per ottenere curve di crescita rappresentative.

3. Fabbricazione e modifica degli elettrodi

1. Costruire una "testina" elettromiografica (EMG) per ciascun ratto (Figura 2). La testina consente la registrazione delle risposte di ammiccamento tramite il sistema per l'ammiccamento (Figura 4).
   1. Costruire una testina composta da due fili in acciaio inossidabile rivestiti in politetrafluoroetilene (PTFE) calibro 3T (5 cm ciascuno), un filo in acciaio inossidabile rivestito in PTFE calibro 10T (5 cm), tre spine maschio di contatto e un isolatore a presa micro a striscia ridotto a 3 fori (vedere punto 3.1.4).
   2. Eliminare il rivestimento in PTFE dal filo calibro 10T afferrando il centro con una pinzetta dentata di precisione e rimuovendo il rivestimento in entrambe le direzioni con una pinzetta liscia di precisione. Assicurarsi che tutte le tracce di rivestimento siano state rimosse da questo filo.
      1. Pressare un'estremità del filo calibro 10T su un perno di contatto con una pinza dentata da odontotecnico; questo fungerà da filo di massa. Tenere con attenzione un filo calibro 3T con la pinzetta liscia di precisione a 1-1,5 mm da un'estremità. Rimuovere 1-1,5 mm di rivestimento in PTFE lasciando intatto il resto del rivestimento. Pressare una spina di contatto sull'estremità esposta del filo calibro 3T.
      2. Eseguire le stesse operazioni per il secondo filo calibro 3T. Entrambi i fili fungeranno da elettrodi positivo e negativo per la registrazione EMG.
   3. Eseguire test di trazione su tutti i fili per assicurarsi che siano saldamente fissati alle spine. Prestare attenzione a non piegare o danneggiare i fili.
   4. Tagliare un segmento di striscia isolante a presa fino a 3,5 fori (tagliando al centro del quarto foro) con la lama di un spelafili. Ridurre ulteriormente questo segmento a soli 3 fori completi e carteggiare entrambi i lati se necessario. Questo accorgimento garantisce che siano disponibili 3 fori completi. Inserire le unità spina-filo nei tre fori della striscia micro fino a quando le estremità pressate risultino allineate con il bordo inferiore del segmento isolante. L'insieme calibro 10T deve trovarsi in uno dei fori esterni della striscia micro e non in quello centrale.
2. Modificare gli elettrodi stimolatori bipolari (Figura 2).
   1. Assegnare a ciascun ratto un elettrodo stimolatore bipolare. Questo elettrodo applica una piccola quantità di corrente elettrica tramite un isolatore di stimolo (vedere sistema per l'ammiccamento) come stimolo condizionante avversivo nell'ECR. Gli elettrodi vengono forniti dal produttore in forma intrecciata e sono schermati.
   2. Separare leggermente i due conduttori metallici svitandoli di 2-3 giri per formare una forma a V (con un'apertura di 5 mm), quindi utilizzare la pinzetta liscia di precisione per raddrizzare il più possibile ciascun "rebbio". Rimuovere con una lametta 1 mm di schermatura dalla punta di ciascun rebbio (su tutta la circonferenza). Ispezionare ogni rebbio per verificare irregolarità o piegature e correggerle se necessario, senza rimuovere ulteriore schermatura.
3. Rimuovere l'olio di produzione e i detriti estranei dalle testine EMG e dagli elettrodi bipolari lavandoli in alcol etilico al 95%. Farli asciugare e quindi sottoporli ad autoclave.

Figura 2: Elettrodi per la registrazione dell'elettromiografia (EMG) ed elettrodo bipolare. La testa EMG finita (a destra, arancione) è costruita con tre pin maschio, due cavi rivestiti in PTFE di dimensione 3T, un cavo rivestito in PTFE di dimensione 10T e uno strip micro modificato. I tre cavi sono lunghi circa 5 cm ciascuno e sono stati crimpati ai pin di contatto. L'elettrodo bipolare finito (a destra, bianco) è stato svolto, raddrizzato nuovamente e modellato in una forma a V (divisione di 5 mm). La schermatura è stata rimossa dalle estremità delle due punte. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

4. Procedura chirurgica delle palpebre (giorno postnatale 90)

1. Preparazione dei materiali (vedere Materiali per informazioni dettagliate sugli approvvigionamenti), animali, aree chirurgiche e non chirurgiche:
   1. Autoclavare strumenti e materiali chirurgici – il numero tra parentesi ( ) indica approssimativamente la quantità necessaria per ratto adulto o per misurazione: strumenti chirurgici (1 set ogni 4 ratti, come approvato dall’ECU IACUC), tamponi di garza (3-4), bastoncini di ovatta (5-6), involucro 20 x 20 (4 per/seduta chirurgica), crogiuolo in porcellana (1), spatola microchirurgica in acciaio inossidabile (1), soluzione salina 0,9% (1 flacone lavaggio), capsula di Petri (1), e viti in acciaio inossidabile 0-80 (3/ratto).
   2. Altri materiali sterili necessari: lama chirurgica taglia 10 (1 ogni 4 ratti), campo operatorio sterile (1 per ratto), unguento oftalmico veterinario, povidone-iodio (1 flacone lavaggio), ago ipodermico 26G x 3/8" (2), pinza portatrapano nichelata con punta da trapano #55, cacciavite a testa piatta nichelato per orologiai (lama 1,8-2 mm).
   3. Preparare un’area sterile di attesa per tutti gli strumenti e materiali chirurgici utilizzando un disinfettante approvato per uso in ricerca/medico. Posizionare i materiali su questo spazio quando l’area è pronta.
   4. Preparare un’area chirurgica sterile utilizzando un disinfettante approvato per uso in ricerca/medico. Quest’area contiene un tappetino riscaldante ad acqua termoregolato, un apparato stereotassico dotato di maschera anestetica per ratto, un sterilizzatore a perle di vetro e un vaporizzatore per gas isoflurano (per anestesia). Il vaporizzatore è dotato di tubi collegati alla maschera anestetica e a una camera di induzione situata in un’area separata per le procedure di preparazione animale non sterili; ogni tubo è controllato da una valvola separata.
   5. Lavare accuratamente mani e avambracci con sapone antimicrobico. Senza toccare l’interno, aprire in anticipo tutti gli oggetti confezionati in buste o involucri sterili. Indossare guanti sterili seguendo procedure asettiche e trasferire tutti gli oggetti pertinenti nell’area chirurgica. Impostare la profondità della punta del trapano nella pinza portatrapano (~ 2 mm) e preparare il cacciavite. Coprire i materiali sterili con un involucro sterile fino a quando non si è pronti per iniziare l’intervento.
   6. Preparare un’area non sterile con una bilancia, un rasoio elettrico per peli, siringhe sterili da 1 mL con aghi 26G x 3/8 in (1 per ratto), registro chirurgico e buprenorfina (concentrazione 0,03 mg/mL) somministrata a 0,1 mL/100 grammi.
      ATTENZIONE: La buprenorfina è un oppioide semisintetico di classe III secondo la DEA e deve essere conservata sotto chiave e registrata adeguatamente.
   7. Verificare il livello di gas nel vaporizzatore per isoflurano; aggiungere altro gas se è basso. Lasciare i comandi del flusso e della miscela spenti per ora. Accendere la bombola di O₂ e verificare che ci sia abbastanza gas per tutte le operazioni.
   8. Pesare ogni ratto e registrare il suo peso corporeo nel registro chirurgico. Utilizzare una tabella delle iniezioni di buprenorfina per determinare il volume corretto da iniettare.
   9. Aprire la valvola del vaporizzatore verso la camera di induzione e lasciare chiusa la valvola verso la maschera chirurgica. Impostare la miscela su 3 e il flusso su 3 (3% di isoflurano con O₂ al 100% come gas trasportatore a un volume di 3 L/min).
   10. Posizionare un ratto nella camera di induzione e lasciarlo raggiungere il piano anestetico appropriato (respirazione lenta, assenza di riflesso plantare, assenza di riflesso palpebrale). Rimuovere il ratto dalla camera una volta raggiunto il piano anestetico.
   11. Rasare la testa con il rasoio elettrico, esponendo una quantità sufficiente di cute per il sito d’incisione e per la palpebra sinistra. Se necessario, riposizionare il ratto nella camera di induzione per raggiungere nuovamente il piano anestetico prima di proseguire con la rasatura.
   12. Disinfettare la cute esposta applicando alternativamente alcol isopropilico e povidone-iodio per tre volte. Se necessario, riposizionare il ratto nella camera di induzione per raggiungere nuovamente il piano anestetico prima del trasferimento al tavolo operatorio.
2. Chirurgia
   1. Aprire la valvola del vaporizzatore verso la maschera anestetica e chiudere la valvola verso la camera di induzione. Regolare la miscela a 2,5 e il flusso a 2 (2,5% di isoflurano con O₂ al 100% come gas trasportatore a un volume di 2 L/min). Trasferire il ratto nell’apparato stereotassico e seguire le procedure standard per fissare la testa alla barra incisiva e alle barre auricolari (vedere Geiger et al., 2008⁴⁹ per un esempio).
   2. Somministrare al ratto un’iniezione preoperatoria di buprenorfina (SC) e smaltire con attenzione l’ago (non coperto) in un contenitore per materiali taglienti. Posizionare un campo operatorio sterile sul ratto, esponendo solo l’area chirurgica e isolandola dal resto del corpo.
   3. Indossare mascherina chirurgica, cuffia chirurgica, camice chirurgico, occhiali protettivi e qualsiasi altro dispositivo di protezione personale richiesto dall’IACUC. Lavare e strofinare accuratamente mani e avambracci con sapone antimicrobico. Indossare guanti sterili seguendo procedure sterili.
   4. Applicare una piccola quantità di unguento oftalmico su entrambi gli occhi utilizzando un bastoncino di ovatta per prevenire l’essiccamento.
   5. Procedere con l’intervento quando il ratto mostra un piano anestetico appropriato. Monitorare continuamente il ratto durante tutta l’operazione e verificare periodicamente il livello di isoflurano. Regolare i comandi del flusso e della miscela in base alla risposta del ratto all’anestesia.
   6. Eseguire un’incisione antero-posteriore lungo la linea mediana del cranio con una lama da bisturi. L’incisione deve esporre un’area sufficiente davanti agli occhi (esponendo l’osso frontale) e leggermente dietro la sutura lambdoidea.
   7. Rimuovere con attenzione il periostio sulla parte superiore del cranio evitando sanguinamenti eccessivi. Asciugare con un bastoncino di ovatta tessuto connettivo e sangue in eccesso.
   8. Praticare un foro utilizzando la punta del trapano con l’aiuto della pinza portatrapano, partendo direttamente dietro la sutura coronale su un osso parietale. Rimuovere sangue e detriti ossei con un bastoncino di ovatta. Afferrare una vite 0-80 per la filettatura con pinzette per schegge e fissarla al foro con il cacciavite per orologiai; stringere la vite abbastanza da non danneggiare il tessuto cerebrale corticale (di solito 3-4 giri completi).
   9. Seguire le stesse procedure descritte nel punto 4.2.8 per fissare altre due viti 0-80 al cranio, una direttamente dietro la sutura coronale dell’osso parietale opposto e una direttamente anteriore alla sutura lambdoidea destra. Si è riscontrato che 3 viti sono sufficienti per ancorare il cemento dentale (vedere 4.2.18) al cranio, poiché una quarta vite (anteriore alla sutura lambdoidea sinistra) ostacolerebbe il posizionamento dell’elettrodo bipolare.
   10. Rimuovere un headstage EMG dalla capsula di Petri. Orientare l’headstage in modo che il filo 10T si trovi sul lato destro del ratto. Piegarlo verso l’alto, rendendolo parallelo al bordo inferiore della microstriscia. Dargli una leggera curvatura verso destra in modo che il filo possa avvolgersi intorno alle viti 0-80 anteriore e posteriore. Metterlo da parte ma abbastanza vicino da poterlo raggiungere.
   11. [Assumendo che si sia destri] Tenere pinzette da medicazione da 3 in nella mano sinistra e pinzette da medicazione da 4 in nella mano destra. Afferrare la cute superiore al sito d’incisione del suo occhio sinistro con le pinzette da 4 in e dirigere le pinzette da 3 in verso l’angolo di questo occhio; afferrare la cute in questo punto. Mantenere la presa con le pinzette da 3 in mentre si rilasciano quelle da 4 in.
   12. Prendere un ago da 26G x 3/8 in e inserirlo nell’angolo della palpebra; ruotare l’ago in modo che il lato smussato sia rivolto verso l’alto. Utilizzare pinzette microchirurgiche con piattaforma per inserire il filo centrale 3T nel foro dell’ago. Spingerlo attraverso il foro per alcuni centimetri senza andare completamente in profondità; questo filo è il polo negativo.
   13. Eseguire le procedure descritte nei punti 4.2.11 e 4.2.12 per inserire il filo 3T esterno nella porzione centrale della palpebra; questo filo è il polo positivo.
   14. Con una mano afferrare entrambi gli aghi mentre con l’altra si afferra l’headstage (o con pinzette). Tirare gli aghi lontano dalla palpebra guidando l’headstage nella stessa direzione con un movimento continuo. Se necessario, ruotare l’headstage in modo che il filo 10T sia rivolto verso l’occhio destro dell’animale; evitare che i fili 3T si incrocino. Utilizzare pinzette a punta fine per verificare che il polo positivo sia al centro della palpebra.
   15. Regolare l’headstage in modo che sia centrato tra gli occhi e in posizione ottimale sulla parte superiore dell’osso frontale, anteriore alle viti inserite bilateralmente. Tenere l’headstage con una mano e le pinzette da medicazione da 3 in con l’altra. Avvolgere il filo 10T intorno a una o entrambe le viti sul lato 10T.
   16. Prendere pinzette da medicazione da 3 in in una mano e pinzette da medicazione da 4 in nell’altra. Utilizzare le pinzette da 3 in per afferrare la cute al sito d’incisione verso la tempia sinistra. Usare le pinzette da 4 in per creare una piccola "tasca" separando la cute (cioè la fascia superficiale) dal muscolo temporale. Usare forbici per iride per rimuovere ulteriore tessuto connettivo, lavorando verso l’angolo dell’occhio sinistro, per aumentare le dimensioni di questa tasca. Fare attenzione a non andare troppo in profondità o a recidere vasi sanguigni.
   17. Prendere un elettrodo bipolare e modellare i fili in modo che possano adattarsi alla curvatura del muscolo temporale, mentre le due punte sono posizionate (dorsale e ventrale) posteriormente all’occhio sinistro (vedere video), e l’estremità inferiore dell’elettrodo bipolare può essere posizionata verticalmente sulla sommità del cranio. Lasciare una distanza sufficiente tra l’headstage e questo elettrodo affinché i connettori del cavo commutatore (Figura 3) possano essere collegati senza ostacoli.
   18. Versare la polvere del cemento dentale nel crogiuolo – iniziare con circa 1/3 del crogiuolo, quindi regolare la quantità secondo necessità. Aggiungere il componente liquido fino a ottenere una consistenza acquosa e mescolare i componenti con la spatola. Quando la consistenza del cemento diventa più viscosa, applicarlo al sito d’incisione – coprendo tutti i bordi della cute con margini di almeno 1/8 in.
       1. Applicare abbastanza cemento da fissare l’headstage e l’elettrodo bipolare senza impedire al ratto di chiudere entrambi gli occhi. Pulire rapidamente qualsiasi goccia di cemento che cade sul pelo del ratto.
   19. Assicurarsi che almeno 4-5 filetti dell’elettrodo bipolare rimangano non sigillati dal cemento in modo che il connettore bipolare possa essere avvitato (Figura 3). Rimuovere l’eccesso di cemento dall’headstage – la parte superiore della microstriscia e i tre perni di contatto devono essere puliti. Il cemento si indurisce rapidamente e potrebbe impedire facilmente il completo accoppiamento di uno qualsiasi di questi elettrodi ai connettori del cavo commutatore. Utilizzare pinzette per schegge per rimuovere il cemento in eccesso che si è parzialmente indurito.
   20. Attendere che il cemento si indurisca; diventa trasparente. Usare forbici microchirurgiche per tagliare l’eccesso di lunghezza dai due fili 3T, lasciando alcuni centimetri di spazio di lavoro.
   21. Prendere pinzette microchirurgiche con piattaforma nella mano sinistra e pinzette microchirurgiche a punta fine nella mano destra. Afferrare un filo 3T con le pinzette sinistre leggermente davanti alla palpebra. Con le pinzette destre, spingere la palpebra verso l’alto per esporre più filo 3T e tenerla in posizione. Rilasciare le pinzette sinistre e usare la mano sinistra per afferrare l’headstage (assicurarsi che sia ormai stabile). Usare le pinzette destre per rimuovere parte della guaina in PTFE, consentendo al filo di fare contatto con il muscolo orbicularis oculi.
       NOTA: Fare attenzione a non tirare troppo forte su un filo 3T, poiché potrebbe staccarsi dal perno di contatto. Se un filo si stacca, non sarà possibile sostituire il perno di contatto poiché il cemento indurito non si staccherà liberamente dal cranio senza causare fratture ossee.
   22. Eseguire i passaggi descritti nel punto 4.2.21 per rimuovere l’eccesso di PTFE dal secondo filo 3T.
   23. Prendere le due pinzette microchirurgiche come indicato nel punto 4.2.21 (con piattaforma a sinistra, punta fine a destra). Posizionare le pinzette sinistre leggermente davanti a un filo 3T lasciando spazio perché le pinzette destre possano essere posizionate direttamente davanti alla palpebra. Afferrare il filo con entrambe le pinzette.
       1. Creare un "gancio" mantenendo ferme le pinzette destre e ruotando le pinzette sinistre verso l’alto e intorno verso la palpebra; fare ciò con un unico movimento. Rilasciare con attenzione prima le pinzette destre, poi quelle sinistre.
          NOTA: L’aggancio degli elettrodi alle palpebre aiuta a ridurre al minimo la possibilità che sfreghino sulla cornea. Riduce anche la possibilità di rottura del filo in qualsiasi fase della fase di test comportamentale. Sebbene l’aggancio non impedisca completamente a tutti gli animali il contatto del filo con la cornea, di solito non mostrano segni di danni oculari, come indicato dall’ampiezza elevata del battito di ciglia (misurata dall’oscilloscopio digitale in 5.1.7) e dalle osservazioni quotidiane post-operatorie (lacrimazione eccessiva, chiusura parziale della palpebra, mancanza di mobilità dovuta a danni oculari). Se un ratto mostra segni iniziali di disagio, viene anestetizzato con isoflurano (vedere 4.1.10) e i suoi elettrodi vengono riesaminati e/o riposizionati. Viene applicato unguento oftalmico per prevenire l’essiccamento della cornea. Il ratto viene osservato quotidianamente per eventuali complicazioni oculari post-operatorie e, se queste persistono, si richiede assistenza veterinaria. I ratti che mostrano gravi complicazioni oculari non correggibili con il riposizionamento degli elettrodi o con trattamento veterinario vengono soppressi in modo umano seguendo le procedure operative standard dell’ECU IACUC.
   24. Eseguire i passaggi descritti nel punto 4.2.23 per il secondo filo 3T. Tagliare l’eccesso di filo con le forbici microchirurgiche.
   25. Utilizzare una mano per liberare il ratto dalle barre auricolari mentre si sostiene il corpo con l’altra mano. Ispezionare la testa per verificare la presenza di sangue o detriti, pulire se necessario e somministrare un’iniezione post-operatoria di buprenorfina.
   26. Posizionare il ratto in un contenitore di recupero dotato di fonte di calore (come un tappetino riscaldante ad acqua termoregolato) per facilitare il recupero. Registrare nel registro chirurgico l’orario di fine intervento e qualsiasi nota pertinente riguardo al ratto durante l’operazione. Monitorare il ratto per una corretta respirazione e, quando mostra decubito sterno o si muove, può essere riportato nella sua gabbia abituale.
   27. Risottoporre a sterilizzazione gli strumenti (tranne le pinzette microchirurgiche – poiché potrebbero danneggiarsi) utilizzando il sterilizzatore a perle e assicurarsi che l’area chirurgica rimanga asettica, ripetendo le procedure asettiche se verranno eseguite più operazioni alle palpebre.

5. Procedura di Condizionamento Classico dell'Ammiccamento in Condizione di Traccia

Figura 3: Scatola di condizionamento operante modificata per il condizionamento del riflesso palpebrale. I ratti sono mammiferi liberi di muoversi, pertanto si utilizza un commutatore rotante per mantenere il contatto del segnale elettrico proveniente dall'EMG e dai connettori bipolari fissati alla testa. Il commutatore è collegato al braccio dello stantuffo, il quale è controbilanciato per ridurre la pressione sul ratto. Un altoparlante piezoelettrico emette un tono a 2,8 kHz a 85 dB e questi valori vengono regolarmente calibrati. La schiuma acustica contribuisce ad attenuare il rumore ambientale. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Sistema di condizionamento palpebrale. Questo sistema su misura comprende un'unità integratrice EMG che filtra e amplifica i segnali in entrata dai ratti, un'unità di controllo dello stimolo che eroga vari stimoli oltre a toni e scosse, un preamplificatore per ciascuna gabbia operante per aumentare il guadagno del segnale EMG e un isolatore di stimolo per ciascuna gabbia operante; fornisce livelli di shock variabili (in mA). Un oscilloscopio digitale (non incluso nel sistema standard di condizionamento palpebrale) viene utilizzato a scopo diagnostico durante l'abituazione e l'acquisizione. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

1. Iniziare l'abituazione e l'addestramento all'acquisizione 5 giorni dopo l'intervento chirurgico. Sottoporre ogni ratto a un giorno di manipolazione e abituazione all'apparato di addestramento, costituito da una scatola di condizionamento operante modificata collocata all'interno di una camera più grande insonorizzata (Figura 3), seguito da 6 giorni di addestramento all'acquisizione. Eseguire le sessioni di abituazione e acquisizione utilizzando un sistema personalizzato per il riflesso palpebrale (Figura 4).
   1. Creare un file di registro per l'addestramento e stamparlo per l'uso quotidiano. Questo registro deve avere i gruppi di ratti assegnati in modo pseudo-casuale (o con altro metodo di randomizzazione) alle rispettive scatole di addestramento.
   2. Accendere il sistema per il riflesso palpebrale, il computer ed eseguire il software relativo. Questa versione del software comprende diversi moduli (o applicazioni) che funzionano in modo indipendente. Eseguire il modulo Animale per creare un file *.RAT contenente le informazioni sui soggetti (numero della sessione, identificativo animale, sesso, peso e numero della scatola). Un singolo file RAT gestisce fino a quattro ratti, formando un gruppo di soggetti. Inserire i valori corrispondenti e salvare il file. Creare un file RAT separato per ogni gruppo di ratti da addestrare.
   3. Trasferire i ratti dal loro allevamento alla stanza di prova e chiudere la porta. Manipolare ogni ratto per 5 minuti.
   4. Trasferire un ratto nella sua scatola assegnata e collegare i connettori EMG e bipolari del cavo del commutatore rispettivamente allo stadio testa EMG e all'elettrodo bipolare sulla sua testa.
      NOTA: Alla prima esposizione al cavo del commutatore, un ratto potrebbe opporre resistenza e mostrare segni di stress. Manipolare l'animale con attenzione e concedere pause tra tentativi di collegamento non riusciti per ridurre lo stress.
   5. Utilizzare un commutatore che ruota di 360° mantenendo la trasmissione/ricezione del segnale elettrico mentre il ratto si muove liberamente all'interno della scatola. Il commutatore ha 5 canali (3 per gli elettrodi EMG, 2 per gli elettrodi bipolari) che conducono all'unità integratore EMG, la quale filtra e amplifica il segnale grezzo.
   6. Verificare che il ratto si muova liberamente e che non sia ostacolato dal peso dell'insieme del cavo del commutatore o del braccio di sostegno. Regolare il contrappeso situato dietro al sostegno, se necessario. Verificare che tutti i connettori siano saldamente fissati, quindi chiudere la porta della scatola. Eseguire la stessa procedura di collegamento/verifica per tutti i ratti.
   7. Utilizzare un oscilloscopio per osservare l'attività EMG alla ricerca di segnali anomali (ad esempio, attività elettrica ad alta frequenza e/o alta ampiezza) e un sistema di videosorveglianza per controllare il loro stato (ad esempio, attività motoria, sensibilità all'ambiente, segni di dolore), se disponibile. Annotare eventuali problemi riscontrati nel registro di addestramento.
   8. Lasciare che i ratti si abituino alle loro camere per 10 minuti, quindi riportarli alle loro gabbie di origine.
   9. Pulire e disinfettare le scatole di condizionamento operante, spazzare il pavimento e pulire i tavoli. Eseguire queste procedure dopo ogni sessione.
2. L'addestramento all'acquisizione si svolge per 6 giorni consecutivi (sessioni).
   1. Giorno 1: Trasferire un ratto nella sua scatola assegnata e collegare i connettori EMG e bipolari del cavo del commutatore rispettivamente allo stadio testa EMG e all'elettrodo bipolare sulla sua testa. Eseguire le stesse procedure indicate nei punti 5.1.6 e 5.1.7.
   2. Accendere gli isolatori di stimolo e impostare la corrente da erogare a 0,4 mA (4% di 10 mA come mostrato nel video). Gli isolatori erogano corrente elettrica in modo alternato (cioè da prova a prova) tra le punte dorsale e ventrale dell'elettrodo bipolare. Questo aiuta a ridurre l'affaticamento delle fibre muscolari (in ciascun sito muscolare) durante stimolazioni ripetute.
   3. Osservare tutte le risposte palpebrali emesse e la tolleranza mostrata in ogni prova per tutti i ratti. Dopo ogni seconda prova, aumentare l'intensità dello stimolo condizionato (US) di 0,4 mA per ogni ratto, fino a raggiungere 1,6 mA (nelle prove 7 e 8). Verificare nuovamente che tutti i ratti rispondano normalmente nelle loro scatole, che le impostazioni di amplificazione e guadagno siano costanti e che i segnali elettrici siano corretti (cioè, basso rumore EMG o assenza di rumore). Utilizzare un'intensità dello stimolo condizionato (US) di 1,6 mA per tutti i giorni dell'addestramento all'acquisizione.
      NOTA: Se un ratto mostra segni di dolore a un determinato livello di stimolo (ad esempio, salta ripetutamente dal pavimento, scala le pareti, corre in giro), la prova viene interrotta e l'intensità viene riportata al valore precedente (0,4 mA in meno) per due prove. Successivamente, al ratto viene nuovamente somministrato il valore di stimolo più elevato che non aveva tollerato; se mostra tolleranza, riceverà valori crescenti fino a raggiungere 1,6 mA. Se non tollera alcun valore, verrà utilizzato per tutto l'addestramento il valore immediatamente inferiore (a incrementi di 0,4 mA) che riesce a tollerare.
   4. Utilizzare un oscilloscopio per osservare l'attività EMG alla ricerca di segnali anomali (e.g., attività elettrica ad alta frequenza e/o alta ampiezza) e un sistema di videosorveglianza per controllare il loro stato (e.g., attività motoria, sensibilità all'ambiente, segni di dolore).
      NOTA: Spiegazione del condizionamento palpebrale di tipo "trace": un'epoca rappresentativa di prova con forme d'onda EMG registrate è illustrata nella Figura 1 e la procedura di condizionamento "trace" è spiegata in dettaglio nel video. Il file di addestramento per il condizionamento "trace" è impostato per erogare 100 prove (90 prove associate CS-US e 10 prove con solo CS ogni 10^a prova), con un intervallo medio tra le prove di 30 secondi. L'intera sessione di addestramento dura circa 52 minuti (supponendo nessuna interruzione). Tutti i ratti sono naïve nella Sessione 1 e svilupperanno curve di apprendimento differenziali (determinate dall'espressione delle CR) man mano che procedono attraverso diversi giorni di addestramento.
   5. Iniziare l'addestramento: eseguire il modulo software Blink. Quando richiesto, selezionare il file RAT corretto e il file di addestramento per il condizionamento palpebrale "trace".
   6. Registrare l'ora di inizio e il nome dell'operatore nel registro di addestramento. A questo punto monitorare tutta l'attività: segnali EMG corretti, buone risposte palpebrali allo stimolo condizionato (US) (cioè, UR elevate/frequenti), stato di salute degli animali e funzionamento corretto dell'apparato hardware. Annotare eventuali osservazioni rilevanti nel registro di addestramento.
   7. La raccolta dati viene acquisita automaticamente dal software sotto forma di file RAW (uno per ratto, per giorno). I file RAW contengono dati di ampiezza EMG (in volt), conteggi di frequenza, latenza e dati areali per le risposte di startle (SR), le UR e le CR (totali e adattative). L'artefatto dello stimolo oscura i primi 100 ms del periodo UR; pertanto, solo gli ultimi 140 ms del periodo UR contengono dati UR.
   8. Al termine dell'addestramento, il software si chiuderà automaticamente. Rimuovere tutti i ratti dalle loro scatole di addestramento e riportarli all'allevamento.
   9. Ripetere i passaggi 5.2.5 - 5.2.6 per tutti i giorni successivi di addestramento. Prima di avviare il modulo Blink in un determinato giorno, aggiornare il numero della sessione all'interno del file RAT. Ciò consente la creazione di nuovi file RAW per tutti i ratti in quel giorno. Ogni ratto dovrebbe avere 6 file RAW, supponendo che nessuno sia stato rimosso dall'addestramento.
3. Elaborare i file RAW e creare un file filtrato per l'analisi statistica.
   1. Eseguire il modulo Analisi. Esaminare ogni sessione per ogni ratto prova per prova alla ricerca di prove problematiche. Questo passaggio serve a individuare prove che potrebbero essere compromesse per vari motivi (e.g., attività di baseline eccessiva pre-CS, movimenti eccessivi, distacco dell'elettrodo, problemi con cavi/fili). Il software dispone di algoritmi che assistono l'operatore nel rilevare ed eliminare "prove difettose" dal set di dati filtrato.
   2. Importare i dati filtrati in un programma per fogli elettronici ed eseguire le analisi statistiche pertinenti.

Risultati

Il software di eyeblink è in grado di fornire un insieme ampio e completo di dati per molti tipi di misure. Per brevità, segnaliamo che in questo studio, rappresentante risultati per apprendimento e prestazioni misure che includono adattivo percentuale di CR, adaptive CR ampiezza, percentuale di UR e ampiezza di UR. Il periodo di CR adattivo è stato scelto in quanto rappresenta l'acquisizione di risposte tempestive eyeblink sopra formazione ripetuta, a seguito di una maggiore plasticità sinaptica nell'ippocampo durante traccia ECC^50,51,52. Le misure di UR sono stati scelti per delucidare se il deficit d'apprendimento indotti da alcool neonatale in traccia ECC erano dovuti a interruzioni nell'apprendimento associativo o interruzioni nella risposta allo shock noi - che può indicare le differenze motivazionali o motore, piuttosto che le differenze di apprendimento tra i gruppi di trattamento. Dati per ogni misura sono stati analizzati utilizzando 2 (sesso) x 3 (gruppo neonatale) x 6 (sessione) miscelati ANOVAs, con sessione come il fattore di ripetere-misure. Significativi effetti principali per il trattamento neonatale sono stati analizzati mediante test post-hoc di Tukey e interazioni significative sono stati analizzati mediante test semplici effetti. Tutte le analisi statistiche sono state condotte utilizzando un livello minimo di alfa di 0,05 e risultati nei grafici sono media ± SEM

Cominciando con la misura di percentuale di CR adattiva, l'ANOVA indicato un significativo effetto principale del gruppo neonatale, F(2,21) = 11,69, p < 0.001, ma nessun significativo effetto principale del sesso (p = 0.71) o interazione significativa fra questi fattori (p = 0,20). Come previsto, adaptive CR percentuale aumentata sopra le sei sessioni di formazione, F(5, 105) = 81.15, p < 0,001 e le differenze tra gruppi neonatale dipendevano da un certo livello di sessione, F(10, 105) = 4,58, p < 0.001. Non c'erano nessun altre interazioni significative che coinvolgono il fattore di sessione. Allo stesso modo per ampiezza di CR adattivo, c'era ancora un significativo effetto principale del gruppo neonatale, F(2,21) = 22,32, p < 0.001, ma nessun significativo effetto principale del sesso (p = 0,21) o interazione significativa fra questi fattori (p = 0.48). Ampiezza di CR inoltre è aumentato significativamente nel corso di sei sessioni di formazione, F(5, 105) = 59.27, p < 0,001 e le differenze tra gruppi neonatale dipendevano da un certo livello di sessione, F(10, 105) = 4,31, p < 0.001. Nel complesso, sia misure di CR hanno mostrato differenze significative tra i mezzi del gruppo e questi mezzi separati significativamente alle diverse sessioni di formazione. Per confermare che i gruppi hanno differito significativamente, test post-hoc di Tukey ha mostrato che i ratti (AI) alcol intubati eseguito significativamente peggio su entrambe le misure CR rispetto alla unintubated-controllo (UC) e intubati sham ratti (SI) (p < 0,01 per percentuale di CR; p < 0,001 per ampiezza di CR), che non hanno differito da altro (p> 0.05). Effetti semplici test eseguiti su gruppo neonatale significativo x interazioni di sessione per entrambe le misure CR, ha confermate che i ratti AI più significativamente sono stati alterati nell'acquisizione di CRs inizio alle sessione 2 e proseguendo attraverso sessione 6 rispetto ai ratti sia UC e SI (tutti p< 0,05), che non hanno differito da ogni altro in tutto sei sessioni. L'unica eccezione era adattivo ampiezza di CR per ratti non SI hanno cominciato a differire significativamente dai ratti AI fino alla sessione 3. Questi risultati sono mostrati in Figura 5A, 5B.

Non c'erano differenze significative nelle misure di UR a causa del sesso, gruppo neonatale o interazioni di questi fattori con il fattore di sessione. Questi risultati negativi hanno indicato che ogni gruppo è stato in grado di emettere eyeblink risposte allo shock noi altrettanto, e che i deficit di apprendimento osservati nei ratti AI non erano influenzati da differenze motivazionali o motore a lampeggiare (Figura 6A, 6B).

Figura 5 : Acquisizione di traccia condizionata risponde (media ± SEM). L'esposizione precoce di alcool (gruppo IA) significativamente influenzato acquisizione di percentuale di risposta adattativa condizionati (CR) (A) e ampiezza (B). Traccia ECC è intrinsecamente difficile da acquisire, quindi le misure sono relativamente più basse per tutti i gruppi - con ritardo ECC, percentuali possono raggiungere l'80-85% nei modelli del roditore di FASD^21,53. Tuttavia, la traccia procedura ECC è più faticoso sull'ippocampo, che è suscettibile agli effetti di alcool durante lo sviluppo iniziale del cervello. * = p < 0.05, * * = p < 0,01, * * * = p < 0,001 tra UC e AI ratti; campione sono indicate tra parentesi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6 : Acquisizione delle risposte unconditioned (media ± SEM). Prestazioni di eyeblink (percentuale di UR e ampiezza di UR) non era significativamente differente tra i gruppi. La mancanza di differenze indicano che l'intensità della scossa usata durante l'allenamento di acquisizione non ha alterato in modo differenziale motivazione nei ratti AI o la loro capacità di produrre difensiva lampeggiare le risposte allo shock, rispetto ai due gruppi di controllo (UC e SI). Campione sono indicate tra parentesi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Cuccioli di ratto neonatale che ricevuto alcol etilico durante giorni postnatali 4-9 ha esibito traccia eyeblink condizionata disabilità in età adulta. Questi risultati sostengono l'idea che l'alcol è un teratogeno con effetti nocivi sulla funzione hippocampal di resistere. Nel complesso, condizionato blocca nella procedura traccia era più bassa per i ratti esposti all'alcol rispetto ai ratti in entrambi i gruppi di controllo. Le disabilità di apprendimento associativo nei ratti esposti di alcool non sono state influenzate dalle differenze motivazionali o motore (cioè., nessuna differenza in lampeggiante all'intensità della scossa U.S.).

Mentre traccia ECC è un attrezzo diagnostico utile per illuminante neuropatologia hippocampal indotta da sfida, i risultati di questo metodo devono essere inseriti nel giusto contesto. In primo luogo, gli elementi procedurali chiave in questa dimostrazione coinvolto la somministrazione mirata di alcol durante una nota finestra di vulnerabilità per lo sviluppo del cervello, fabbricazione di hardware di elettrodo che permette la registrazione di attività elettromiografica e fornisce la resistenza agli urti, impianto chirurgico di suddetto hardware e successivi la sperimentazione animale con un paradigma di apprendimento che valuta una funzione cognitiva di interesse. In ogni fase del processo, si deve prestare attenzione a non causare danni inutili/non intenzionale ai soggetti del roditore e monitorare regolarmente i loro segni di salute. Loro risultati comportamentali forniscono la "finestra" di cognizione, un costrutto psicologico che è solo accuratamente descritto quando la loro salute non è compromessa da errori sperimentali che comprende la somministrazione di alcool, difetti dell'hardware o l'impianto chirurgico. Così, ogni elemento procedura nel processo di ricerca deve essere implementato in maniera sana al fine di garantire che i risultati da ECC possono essere estrapolati per risultati in esseri umani. In secondo luogo, il paradigma ECC fornisce informazioni sulla natura dell'apprendimento associativo, ma deve prestare attenzione per non estendere i risultati utilizzando questo approccio e largamente li attribuiscono ad altri dominii conoscitivi - come memoria di lavoro, memorie di breve/lungo termine e coscienza - a meno che uno ha integrato alcune sfaccettature di questi domini all'interno di uno studio ECC di disegno sperimentale. Ad esempio, questa dimostrazione ha esaminato la fase di acquisizione dell'apprendimento ECC traccia, ma non ha esaminato la conservazione della memoria nei ratti dopo hanno completato la formazione. Memoria è quindi un processo psicologico indipendente che deve essere valutato oltre ad apprendere. Per impostazione predefinita, si può incorporare un intervallo di mantenimento memoria per valutare o capacità di memoria a breve termine o a lungo termine. In terzo luogo, riconoscimento che ci sono sistemi di memoria parallela⁵⁴ che possono lavorare simultaneamente con i fattori motivazionali, esperienziali e ormonali che contribuiscono al comportamento, è essenziale per la comprensione che l'associatività (durante ECC) è ma uno dei molti processi che rivelano ciò che è "buono" o "poveri" di apprendimento. Infine, traccia ECC non è un compito puramente hippocampal-dipendente, come altre regioni del cervello possono mediare alcuni componente del CR. Così, la comprensione delle interazioni tra diversi circuiti neurali e/o il tipo di parametri dello stimolo che sono utilizzati in uno studio, devono essere presi in considerazione quando si effettuano le implicazioni sulla base dei risultati discreti. Ad esempio, il cervelletto, contribuisce anche alla traccia ECC, dove essa influenza le caratteristiche topografiche del CR e CR tempismo, specialmente quando l'ISI è breve durata. Traccia ECC non è interessato in esseri umani con danno cerebellare che vengono testati con un intervallo lungo traccia (1.000 ms), ma è interessato a coloro che ricevono un più breve intervallo (400 ms) di traccia³⁴. Inoltre, lesioni bilaterali della corteccia prefrontale mediale dorsale (mPFC) destinati a regioni anteriore del cingulate e mediale agranular in topi, evitare l'acquisizione della traccia CRs⁵⁵, mentre la distruzione del mPFC caudale nei conigli produce simili risultati⁴⁶. Questi risultati sottolineano anche l'importanza di considerare le differenze tra specie in contributi prefrontali cerebellare-cervello stelo guidato apprendimento associativo, come traccia ECC. Mentre l'esposizione neonatale dell'alcool durante l'acquisizione di 4-9 influenzata negativamente PD di 500-ms traccia CRs per adulto ratti in questo studio e altri^47,56, questo non è lo stesso caso di ratti neonatali alcol-esposti che verificano un intervallo traccia di 300 ms, anche quando ha sfidato a dosi relativamente elevate di alcol (5 g/kg)⁵⁷, suggerendo che il danno di traccia in ratti alcool-esposti dipende la durata dell'intervallo traccia.

In questo studio, l'ippocampo è stato sottolineato come essendo di vitale importanza per la mediazione traccia ECC e quando sfidato da esposizione neonatale dell'alcool, esibisce danni neurali che si riflette da disturbi nell'acquisizione della traccia CRs. Esso deve ammonito, tuttavia, che il circuito di gambo cervelletto-cervello, in particolare il nucleo di interpositus, è essenziale per molte sfaccettature di ECC, compresa l'acquisizione, espressione e caratteristiche topografiche del CR, a seconda del tipo di attività ECC tra cui traccia ECC^{36,40,55,58,59}. Infatti, questo circuito neurale interagisce con l'ippocampo per guidare l'espressione di CRs durante forme di ordine superiore di ECC, come traccia ECC⁶⁰. Non è del tutto chiaro se l'esposizione dell'alcool durante lo sviluppo iniziale del cervello in particolare riguarda la funzione hippocampal nella traccia ECC. Molte regioni differenti del cervello sono vulnerabili ai primi insulto di alcool, inclusi mPFC, cervelletto e ippocampo^{18,19,23,47,61,62}, ed è molto probabile che alcol pregiudica il funzionamento di queste strutture a vari livelli e variano, ma funzionalmente importanti differenze attraverso molte procedure ECC. Nonostante le insidie per quanto riguarda l'interpretazione dei risultati da studi di traccia ECC, acquisizione di traccia CRs è stato indicato per almeno fare affidamento su un ippocampo intatto, come supportato da lesione animale studi^{42,44,63,64,65}. Questa procedura rimane così un approccio altamente prezioso per dimostrare i legami tra l'esposizione dell'alcool inerente allo sviluppo per traccia condizionata blocca perché i circuiti neurali sottostante, è molto meglio compreso che quello degli altri compiti di hippocampal-dipendente, come luogo di apprendimento nel labirinto dell'acqua di Morris, riconoscimento di oggetti nuovi e contestuale e traccia di paura condizionata.

ECC come un metodo del comportamento di "saggiare" cognizione, ha applicabilità diffusa nel campo della neuroteratology inerente allo sviluppo. Infatti, i risultati recenti dal nostro laboratorio sostengono la nozione che l'ippocampo in via di sviluppo è altamente sensibile agli effetti di alcol, che possono essere mitigati da diverse strategie interventistiche^18,47. Il vantaggio chiave è che con una migliore comprensione dei deficit d'apprendimento ECC traccia indotta da alcool, possono essere predittivi di altri problemi nella base di hippocampal funzioni di fuori di apprendimento associativo - particolarmente quelli conosciuti per essere mediato tramite la stessa neurocircuiti hippocampal.

Applicazione di traccia ECC e le sue altre varianti (ad es., ritardo, inversione, discriminazione, composto) per delucidare i meccanismi neurobiologici e sistemi neurali coinvolti nell'apprendimento associativo, può essere esteso oltre il campo della ricerca sull'alcool fetale. Ad esempio, questo paradigma ha ricevuto molta attenzione in casi umani e modelli animali di patologie psichiatriche come schizofrenia^66,67, malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer^68,69e le droghe di abuso^70,71,72. Suoi benefici come un metodo di ricerca per valutare la disfunzione e la funzione neurocognitiva sono così evidenti attraverso molte discipline psicologiche e biomedicale, tra cui neuroscienze.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Esposizione all'alcol neonatale
190 Alcol etilico a prova (USP)	Pharmco-AAPER	225-36000 [ECU Medical Storeroom]	Può essere sostituito; dovrebbe essere USP; evitare l'uso di 200 gradi di alcol etilico
Contenitore/cestino per cuccioli	Qualsiasi
olio di mais	Qualsiasi
terapia dell'acqua riscaldata per uso alimentare con / Cuscinetti	Gaymar	TP-500	Per mantenere caldi i cuccioli; può essere sostituito
Aghi ipodermici 22G x 1 in, Sterili	Qualsiasi
Aghi ipodermici 30G x 1/2 in, Sterili	Qualsiasi
Alcool isopropilico 70%	EMD Millipore	PX1840-4 [Fisher Scientific]	Può essere sostituito; reagente grade www.fishersci.com
Ratti Long-Evans (riproduttori di femmine e maschi)	Charles River Laboratories	N/A [ECU Dept. of Comparative Medicine]	L'età e il peso devono essere specificati; il prezzo varia in base a questi fattori www.criver.com
Forbici per micro dissezione, lame da 3,5 pollici, lame da 23 mm	Strumenti di ricerca biomedica	11-2200	Per il taglio di tubi in PE brisurgical.com
Tubo in polietilene 10 (0,011 pollici). Documento d'identità; 0,024 pollici O.D.)	BD Diagnostic Systems	22-204008 [Fisher Scientific]	Può essere sostituito www.fishersci.com
Tubo in polietilene 50 (0,023 pollici). Documento d'identità; 0,038 pollici O.D.)	BD Diagnostic Systems	22270835 [Fisher Scientific]	Può essere sostituito www.fishersci.com
Scaldabagno regolato o scaldabiberon per bambini	Qualsiasi		Opzionale; aiuta a riscaldare le soluzioni di latte freddo
Siringhe di tubercolina, sterili, 1,0 ml	Qualsiasi
Siringhe di tubercolina, sterili, 10 ml	Qualsiasi		Può essere utilizzato per estrarre l'alcol etilico o utilizzare micropipette di dimensioni adeguate
Bilancia	Qualsiasi		Dovrebbe avere una buona risoluzione (in unità di grammi)
Name	Company	Numero di catalogo	Comments
>EMG Headstage Fabbricazione ed elettrodo bipolare Elettrodo bipolare di modifica
2 canali SS Twisted	Plastics One, Inc.	MS303/2-B/SPC  ELEGGERE SS  2C TW .008"	Deve specificare una lunghezza personalizzata di 20 mm sotto il piedistallo www.plastics1.com
Centi-Loc Strip Socket Insulator (aka, Micro Strip)	ITT Cannon / ITT Interconnect	Solutions CTA4-IS-60* o CTA4-1S-60*	*Dipende dal fornitore; vedere www.onlinecomponents.com o www.avnetexpress.avnet.com
Pinze dentali, seghettate	CMF Medicon	390.20.05	Può essere sostituito; utilizzare per crimpare i fili ai pin di contatto maschio www.medicon.de
Forbici per micro dissezione, lame da 3,5 pollici, 23 mm Strumenti	di ricerca biomedica	11-2200	Utilizzare solo per tagliare fili 3T; il taglio di fili 10T danneggerà la lama - utilizzare invece la lama dello spelafili brisurgical.com
Filo di acciaio inossidabile rivestito in PTFE, 10T (diametro nudo .010 in)	Sigmund Cohn-Medwire	316SS10T	www.sigmundcohn.com
Filo di acciaio inossidabile rivestito in PTFE, 3T (diametro nudo 0.003 in)	Sigmund Cohn-Medwire	316SS3T	www.sigmundcohn.com
Lama di rasoio	Qualsiasi		Per spellare 1 mm dai rebbi dell'elettrodo bipolare
Presa Relia-Tac Pin di contatto, Maschio	Cooper Interconnect	220-P02-100	Vedi Allied Electronics Cat # 70144761 www.alliedelec.com
Pinzette, ad alta precisione, seghettate, 4 3/4 in	Microscopia elettronica Scienze	78314-00D	Per afferrare saldamente il filo 10T durante la rimozione del PTFE con pinzette lisce www.emsdiasum.com
Pinzette, alta precisione, lisce, 4 3/4 pollici Microscopia	elettronica Scienze	78313-00B	www.emsdiasum.com
Pinzette, punte ultra fini, 4 3/4 pollici Microscopia	elettronica	Scienze 78510-0	Per spellare 1 mm di PTFE da un'estremità del filo 3T; afferrare la parte schermata con una pinzetta liscia www.emsdiasum.com
Spelafili, 16-26 AWG	Qualsiasi		Utilizzare l'estremità della lama per tagliare micro strisce
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Chirurgia delle palpebre
Strumenti chirurgici (acciaio inossidabile di alta qualità)
2 pinze per medicazione, 4 in strumenti di	ricerca biomedica	30-1205	Possono essere sostituiti; pinze extra per afferrare elettrodi/viti al di fuori del vassoio chirurgico brisurgical.com
Pinze per medicazione, 3 in strumenti di	ricerca biomedica	30-1200	Può essere sostituito brisurgical.com
Vassoio strumenti	ricerca biomedica	24-1355	Può essere sostituito brisurgical.com
Manico di coltello n. 3, 5 in	Strumenti di ricerca biomedica	26-1000	Può essere sostituito brisurgical.com
Pinze da dissezione, 3,5 pollici, Punti fini	Strumenti di ricerca biomedica	10-1630	Può essere sostituito brisurgical.com
Pinza per micro dissezione, 3,5 pollici, piattaforma liscia (0,3 x 5 mm)	Strumenti per la ricerca biomedica	10-1720	brisurgical.com
Forbici per micro dissezione, 3,5 pollici, estremamente delicate, lame da 15 mm Strumenti	di ricerca biomedica	11-2000	Può essere sostituito brisurgical.com
Pinze per schegge semplici, 3,5 pollici	Strumenti di ricerca biomedica	30-1600	Può essere sostituito brisurgical.com
#10 Lama chirurgica in acciaio inossidabile per manico #3, sterile	Qualsiasi		Può essere sostituito
0-80 x 0,125 in viti in acciaio inossidabile Plastics	One, Inc.	0-80 x 0.125	Può essere sostituito www.plastics1.com
Alcohol Prep Pads, Sterile	Fisher Scientific	22-363-750 [Fisher Scientific	Può essere sostituito www.fishersci.com
Betadine Povidone-Iodine	Purdue Frederick Co.	6761815101 [Fisher Scientific]	Può essere sostituito www.fishersci.com
Betadine Povidone-Iodio Prep Pads	Moore Medical	19-898-946 [Fisher Scientific]	Può essere sostituito www.fishersci.com
Tamponi con punta in cotone, autoclavabili	Qualsiasi		Tipicamente 7,6 cm o 15,2 cm di lunghezza
Punta da trapano per morsa a perno, #55 (0,052 pollici)	Qualsiasi		metallo dovrebbe resistere alla ruggine e alla corrosione
Cuscinetti di garza, 2 pollici x 2 in	Fisher Scientific	22-362-178 [Fisher Scientific]	Può essere sostituito www.fishersci.com
Guanti in lattice/nitrile/vinile per uso generico	Qualsiasi
Sterilizzatore di perline di vetro	Qualsiasi		strumento sterilizzato tra un intervento chirurgico e l'altro
Pompa per terapia dell'acqua riscaldata con cuscinetti x 2	Gaymar	TP-500	Può essere sostituito; si consigliano pompe separate: 1 per la chirurgia, 1 per il recupero
Aghi ipodermici 26G x 3/8 pollici, sterili	Qualsiasi
isoflurano	Vedco	NDC 50989-150-12	Il produttore può essere sostituito; può essere richiesta l'approvazione veterinaria
Sistema di vaporizzazione dell'isoflurano, da tavolo,	Parkland Scientific	V3000PK	respirabile Può essere sostituito www.parklandscientific.com
Cacciavite per gioiellieri con lama da 1,8-2 mm	Qualsiasi		metallo dovrebbe resistere alla ruggine e alla corrosione
Pacchetto BCA Ortho-Jet (cemento dentale)	Lang Dental	B1334	Contiene polvere (1 lb) e liquido www.langdental.com
Serbatoio di ossigeno con regolatore di pressione, Grande			fornitore locale
Crogiolo in porcellana, ad alta forma, smaltato, 10 ml	CoorsTek, Inc.	07-965C [Fisher Scientific]	Può essere sostituito con Fisher FB-965-I Wide-Form Crucible www.fishersci.com
Puralube Veterinary Ophthalmic Unguento, sterile	Henry Schein Company	NC0144682 [Fisher Scientific]	Può essere sostituito www.fishersci.com
Quatricide PV-15	Pharmacal	PV-15	Disinfettante antimicrobico; può essere sostituito www.pharmacal.com
Maschere per anestesia a gas di ratto per chirurgia stereotassica	Stoelting Company	51610	www.stoeltingco.com
Apparecchio stereotassico per ratti con barre auricolari (45 gradi)	Si		barra a 45 gradi per evitare di danneggiare i timpani Roboz
Surgical Instrument Milk	Roboz Surgical	NC9358575 [Fisher Scientific]	Può essere sostituito; per lubrificare gli strumenti durante la sterilizzazione in autoclave www.fishersci.com
Tagliacapelli per roditori	Qualsiasi
cloruro di sodio	Fisher	Scientific S641-500 [Fisher Scientific]	Per fare soluzione salina allo 0,9%; grado reagente; USP www.fishersci.com
Microspatola in acciaio inossidabile (lama: 0,75 L x 0,18 pollici. W)	Fisher Scientific	21-401-15 [Fisher Scientific]	Può essere sostituito www.fishersci.com
Starrett Pin Vise, 0,000 in - 0,055 in	Qualsiasi		nichelato o equivalente consigliato per resistere alla ruggine e alla corrosione
Guanti chirurgici sterili	Qualsiasi
involucro di sterilizzazione, 20 in x 20 in, autoclavabile	Propper Manufacturing	11-890-8C [Fisher Scientific]	Utile per avvolgere materiali autoclavabili e su campo sterile durante la chirurgia www.fishersci.com
Telo chirurgico, sterile/autoclavabile	Qualsiasi		Potrebbe essere necessario tagliare a misura per i ratti
Camice chirurgico*	Qualsiasi		*Se richiesto dalla
maschera chirurgica IACUC	Qualsiasi
Siringhe di tubercolina, sterili, 1,0 ml	Qualsiasi
bilancia	Qualsiasi		Dovrebbe avere una buona risoluzione (in unità di grammi)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Sistema e componenti Eyeblink (supponendo un sistema a 4 roditori)
5 Commutatore a 5 canali x 4	Plastics One, Inc.	SL2 + 3C	www.plastics1.com
Cavo per elettrodi bipolari, doppio 305 x 4	Plastics One, Inc.	305-305 80CM TT2 (C)	Fornisce l'estremità della spina all'elettrodo bipolare sul ratto e al commutatore; deve essere modificato www.plastics1.com
Cavo, 5 canali, schermato, 26 AWG x 4	Qualsiasi		Per fabbricare il cavo del commutatore; questo deve essere fatto da zero
Camera per la scatola di prova operante (interno: 24 A x 23 L x 14 P pollici) x 4	Med-Associates		Può essere sostituito; le dimensioni interne dovrebbero adattarsi comodamente alla scatola di prova operativa, con spazio per la schiuma acustica; adatto con ventola - 55-60 dB www.med-associates.com
Eyeblink System and Software	JSA Designs	N/A	Proprietario e personalizzato per il laboratorio
di ricercaGuaina termorestringente (3/16 pollici, 1/4 pollici, 3/8 pollici, 1/2 pollici di diametro)	Qualsiasi		Per proteggere le estremità saldate e le giunzioni del cavo del commutatore modificato
Schiuma acustica a triplo picco in melamina con Hypalon nero (24 x 48 pollici)	McMaster-Carr	9162T5	Può essere sostituito; tagliato per adattarsi a 4 camere di alloggiamento www.mcmaster.com
Scatola di prova operativa (esterno 12,5 L x 10 L x 13,5 pollici A), completa x 4	Med-Associates	ENV-007 Pacchetto personalizzato	Con pavimento a griglia in acciaio inossidabile e parte superiore personalizzata (3 pollici di foro al centro per il cavo del commutatore) www.med-associates.com
Oscilloscopio (opzionale)	Qualsiasi		Specifiche minime consigliate: larghezza di banda analogica di 200 MHz, campionamento in tempo reale 1 GS/s, 4 canali; vedere www.picotech.com /td>
Tweeter piezoelettrici (altoparlanti) x 4 (7 x 3 pollici)	MCM Electronics	53-805	Deve corrispondere alle specifiche della gamma di frequenza per il sistema eyeblink (2500 Hz - 25 KHz) www.mcmelectronics.com
Stazione di saldatura, saldatura, flusso, stagno	Qualsiasi		Per saldare cavi da 26 AWG a prese femmina (che si adattano a pin di contatto relia-tac maschio) e spine bipolari
Isolatori di stimolo x 4	WPI International	A365	Queste unità funzionano con batterie alcaline da 16-9 V; è disponibile una versione ricaricabile adatta (A365R www.wpiinc.com
Cavo per elettrodo tripolare per commutatore SL3C x 4	Plastics One, Inc.	335-335 80cm TT3 C	Fornisce l'estremità della spina allo stadio EMG sul ratto e al commutatore; deve essere modificato www.plastics1.com
USB Luci LED x 4	Qualsiasi		luce basata su USB non causa "rumore" elettrico con i segnali EMG dai ratti www.plastics1.com
Webcams x 4, Software di sorveglianza	Qualsiasi
PC Computer con sistema operativo MS Windows	Qualsiasi

pompa per , seghettati seghettati Strumenti di Micro non consiglia qualsiasi