Un Microfluidic flusso Camera Modello per la trasfusione di piastrine e Emostasi Misure Deposizione delle piastrine e la formazione di fibrina in tempo reale

Sommario

Questo articolo descrive un modello sperimentale di emostasi che misura contemporaneamente la funzione piastrinica e la coagulazione. Piastrine e di fibrina fluorescenza viene misurata in tempo reale, e il tasso di piastrine di adesione, il tasso di coagulazione, e l'inizio della coagulazione sono determinati. Il modello viene utilizzato per determinare le proprietà delle piastrine procoagulanti sotto flusso nei concentrati di trasfusione.

Abstract

modelli microfluidica di emostasi valutare la funzione piastrinica in condizioni di taglio idrodinamica, ma in presenza di anticoagulanti, questa analisi è limitata al solo deposizione delle piastrine. Il rapporto intricato tra Ca ²⁺ funzione di coagulazione e delle piastrine-dipendente richiede un attento e controllato ricalcificazione di sangue prima dell'analisi. Il nostro programma di installazione utilizza un canale di miscelazione a forma di Y, che fornisce concentrato / Mg ²⁺ buffer di Ca ²⁺ al sangue che scorre appena prima di perfusione, consentendo una rapida ricalcificazione senza stasi campione. A differenza di dieci volte della velocità di flusso tra i due serbatoi minimizza diluizione. Il sangue ricalcificato viene perfuso in una camera di analisi collageno-rivestito ed etichettatura differenziale permette imaging in tempo reale sia deposizione di piastrine e di fibrina mediante fluorescenza microscopia video. Il sistema utilizza solo strumenti disponibili in commercio, aumentando le possibilità di standardizzazione. Ricostituzione di throsangue mbocytopenic con piastrine da sopraelevata si concentra, inoltre, modelli di una trasfusione di piastrine, dimostrando il suo impiego in questo settore di ricerca. dati esemplificativi dimostrato che la coagulazione insorgenza e deposizione di fibrina sono linearmente dipendente dalla concentrazione piastrinica, confermando il rapporto tra emostasi primaria e secondaria nel nostro modello. In un lasso di tempo di 16 min perfusione, attivazione contatto non ha avuto luogo, nonostante ricalcificazione alla normalità Ca ²⁺ e livelli di Mg ^2+. Quando fattore di coagulazione XIIa stata inibita da inibitore della tripsina di mais, questo lasso di tempo era anche di più, indicando una gamma dinamica considerevole in cui le variazioni di natura procoagulante delle piastrine possono essere valutati. Co-immobilizzazione del fattore tissutale con il collagene ha ridotto significativamente il tempo di insorgenza della coagulazione, ma non il suo tasso. L'opzione per studiare il fattore tissutale e / o il percorso di contatto aumenta la versatilità e l'utilità del saggio.

Introduzione

emostasi primaria e secondaria sono stati originariamente concepita come due processi biochimici relativamente separabili. emostasi primaria è stato visto come un importante contributo in condizioni di flusso arterioso, con un ruolo chiave per le piastrine, mentre emostasi secondaria è stato visto a dominare la coagulazione sotto il flusso di sangue venoso, permettendo la cascata della proteasi per formare fibrina insolubile. Gli ultimi decenni hanno rimodellato questa visione tradizionale sostanzialmente, riconoscendo che l'attivazione piastrinica e la coagulazione sono interdipendenti e sono ugualmente importanti processi durante l'emostasi fisiologica e patologica in tutti i (non estremi) ambienti idrodinamici. Questo punto di vista è stato tradotto in clinica, dove sono sempre più utilizzati test ideati per misurare completo coagulazione del sangue intero, anche se con molte domande restanti rilevanza, l'applicabilità e l'utilità ^1.

Abbiamo recentemente pubblicato una analisi funzionale di piastrineconcentrati usando camere di flusso microfluidica rivestite con collagene fibrillare in un modello in vitro di trasfusioni ^2, con campioni contenenti livelli normali di globuli rossi, plasma e piastrine. Questo metodo utilizza l'eparina o irudina sangue anticoagulante, che non implica alcun o coinvolgimento limitato di emostasi secondaria, che dipende dalla produzione di trombina e calcio ionizzato (Ca ^2+). Per sostenere la formazione di trombina e, quindi, per includere tutti gli aspetti della emostasi sotto flusso microfluidica, abbiamo sviluppato un metodo complementare sulla stessa piattaforma tecnica, tra cui la connessione ora Ca ^2+. In questo modo, la deposizione piastrinica e la formazione di fibrina possono essere studiate, di nuovo in un modello di trasfusione di piastrine, di valutare la qualità concentrato piastrinico.

In questo metodo, le piastrine e fibrinogeno sono etichettati con fluorofori che sono completamente separati spettri di emissione. a due colori, il video microscopia in tempo reale quindi permette l'analisi diadesione piastrinica primario, nonché l'iniziazione coagulazione e deposizione di fibrina. Una variabile importante in questo tipo di saggio è ricalcificazione, perché l'aggiunta di Ca ²⁺ al sangue statico, prima perfusione, provoca inevitabilmente coagulazione contatto avviato nel contenitore. Questa iniziazione sarà pregiudizi la lettura a causa di intasamento dei tubi e biochip insenature prima di perfusione. Pertanto, nel nostro metodo, citrato sangue anticoagulato e un buffer -contenente Ca ²⁺ vengono pompati separatamente attraverso le cosce di una camera di ingresso a Y. I componenti sono miscelati durante la perfusione prima di entrare in camera di analisi rivestito con solo o in combinazione con il fattore tissutale umano ricombinante (rhTF) collagene. Adattando le velocità di flusso delle pompe separate e la concentrazione di Ca ²⁺ nel buffer, una diluizione 10% del campione di sangue finale avviene.

Usando questo protocollo esteso, dimostriamo il contributo di coagulifattore di XII (FXII) e la concentrazione delle piastrine di contattare via coagulazione iniziazione sotto flusso. I nostri dati mostrano anche che rivestendo rhTF fianco collagene, il fattore tissutale percorso può essere misurata in concomitanza.

Protocollo

Questo protocollo segue le linee guida etiche istituzionali per la ricerca su campioni umani, e il consenso informato è stato ottenuto da tutti i donatori coinvolti. L'approvazione per gli esperimenti descritti qui è stato ottenuto dal Comitato Etico del Policlinico Universitario di Anversa (numero di riconoscimento 16/10/120).

NOTA: le indicazioni di temperatura sono sempre a temperatura ambiente, se non diversamente specificato.

Impostazione 1. microfluidica

1. Preparare i canali microfluidica camera di flusso, tubi e perni di collegamento
   1. Risospendere il flaconcino collagene stock di vortex e poi diluita nella soluzione di glucosio isotonica fornito dal produttore ad una concentrazione finale di 50 mg / mL.
      NOTA: L'uso di collagene equino tendine, fatta principalmente di tipo I fibrille. Il equina collagene di tipo I è spesso definito come "Horm" collagene ed è il gold standard per questo tipo di analisi, sia per la storica eragioni biologiche. collagene umano di tipo III può anche essere usato, ma queste fibrille coat meno, e la risposta piastrinica non è forte. Altre superfici rivestimento possono anche essere utilizzati, come fattore di von Willebrand, fibrinogeno, fibronectina, laminina, vitronectina, thrombospondin-1, o combinazioni di questi ^3.
   2. Prendere un nuovo, biochip microfluidica monouso con otto, canali e dimensioni parallele rettilinee, in mm, di 0,4 W x H x 0,1 20 L. Dispensare 0,8 ml di collagene nel canale (s) del biochip su un'estremità e etichettare questo come l'uscita. Riempire solo 5/6 della lunghezza di canale in modo che le fibrille di collagene non sono rivestite in ingresso del canale, poiché questo può causare intasamento, che ostacola un perfusione efficiente.
   3. Incubare il biochip a 4 ° C per almeno 4 ore in un contenitore umidificato e sigillato.
   4. Per studiare il fattore tissutale (estrinseco) coagulazione mediata in combinazione con il percorso di contatto (intrinseci), cappotto i canali con collaGen e fattore tissutale ricombinante umano (rhTF).
      1. Diluire rhTF in 10 mM 4- (2-idrossietil) -1-acido piperazineethanesulfonic (HEPES) -buffered salina (HBS, 0,9% (w / v) di NaCl, pH 7,4, 1: 3.000, concentrazione stock: 4.5 nM).
      2. Rimuovere la soluzione di collagene di rivestimento attraverso l'uscita. Pipettare 0,8 ml di rhTF in HBS (diluizione 1/500 della concentrazione magazzino, concentrazione finale: 9 PM) nella presa del canale, riempiendo 5/6 della lunghezza di canale, simile alla strategia collagene-coating.
      3. Incubare il biochip per altri 30 min in un contenitore umidificato e sigillato.
   5. Riempire i canali rivestiti con tampone di bloccaggio (1.0% (w / v) di albumina di siero bovino e 0,1% (w / v) di glucosio in HBS), a partire dalla estremità (etichettata come ingresso). Riempire un numero uguale di canali a Y con lo stesso tampone bloccante in un biochip miscelazione.
      1. Assicurarsi che tutti i canali e le braccia canale sono completamente riempito di tampone di bloccaggio. Incubare entrambi biochips per almeno 1 h in un contenitore umidificato e sigillato.
   6. Per ciascun canale in uso, preparare due tubi di 8 cm lunghissimi una 2 cm e uno 46 centimetri di lunghezza. Inserire un perno in una estremità dei tre tubi di piccolo e in entrambe le estremità del tubo più lungo.
2. Preparare la pompa di risciacquo
   1. Risciacquare tutti fluidica pompa e il tubo collegato con acqua distillata.
   2. Sgrassare fusione del biochip con una precisione senza polvere pulire e alcool denaturato per rimuovere le stampe e polvere.
   3. Riempire tutti i tubi con tampone di arresto prima di collegarli ai biochip.
   4. Fissare il biochip rivestito sul palco microscopio automatizzato. Fissare il biochip miscelazione alla stessa altezza come la fase microscopio utilizzando un jack di laboratorio forbice.
   5. Collegare il biochip rivestito con il biochip miscelazione utilizzando il tubo più lungo, lungo 46 cm. Assicurarsi che entrambi biochip sono ad una distanza tale che il tubo forma una linea flessibile, ma diritta.
   6. Collegare un pin connettore siringa nel tubo compatibile Luer della pompa di risciacquo. Collegate alla estremità libera del 2-cm tubi e fissare l'altra estremità all'uscita del biochip rivestito.
   7. Fissare i due tubi da 8 cm verso l'ingresso del biochip miscelazione con i piedini. Mettere l'estremità libera di ciascun tubo in un flaconcino di HBS. Risciacquare tutti i tubi e tutti i canali con 1 ml HBS.
      NOTA: HBS fluisce dal flacone attraverso il tubo 8 cm al chip miscelazione e attraverso la 46-cm tubi al chip rivestito (scorre dal rivestimento per la parte rivestita) a causa della forza di trazione della pompa di risciacquo. Questo passaggio rimuove il buffer di blocco e collagene poco aderito (o rhTF in biochip doppio rivestimento).
3. Preparare le pompe di perfusione
   1. Aprire il software del driver delle pompe di perfusione. Inizializzare le pompe facendo doppio clic sull'icona di siringhe nel software.
   2. Selezionare il tipo di siringa che verrà utilizzato: 1 siringhe ml per la coagulazione BUffer e 2 siringhe ml per il sangue ricostituito.
4. Collegare le siringhe alla costruzione biochip
   1. Scollegare la pompa di risciacquo e tutti i tubi, tranne quello che collega le due biochip. Il tubo scollegato viene riutilizzato nei seguenti passi.
   2. Collegare il tubo di 2 cm con il suo pin del connettore della siringa al blocco Luer di un tubo di scarico a parete spessa. Riempire il tubo a pareti spesse con soluzione di pepsina standard utilizzando una siringa.
      NOTA: L'aggiunta di pepsina alle inibisce il tubo di scarico e lisa post-perfusione coagulazione e quindi impedisce l'intasamento del sistema alla fine posteriore.
   3. Fissare l'estremità aperta del tubo a pareti spesse con un morsetto Kocher. Collocare un contenitore per rifiuti adeguato con candeggina sotto per raccogliere il flow-through.
   4. Fissare il tubo con il perno alla presa del biochip rivestito.

2. Preparazione di campioni di sangue

1. Raccogliere il sangue da un volontario sano e separare i suoi componenti ⁴
   1. Raccogliere il sangue in un contenitore di acido etilendiammina-tetraacetico evacuati (EDTA). Utilizzare questo esempio solo per l'esecuzione di un esame emocromocitometrico completo (CBC) utilizzando un analizzatore ematologico automatico.
   2. Raccogliere il sangue in contenitori di citrato di sodio evacuati. 5 ml di sangue è necessaria per canale.
   3. Mettere il campione (s) su una ricostituzione del sangue rotatore orizzontale in attesa.
      NOTA: Il test dovrebbe essere completata entro 3 h di salasso. campioni di concentrato piastrinico e di sangue intero sono ABO / RhD gruppo sanguigno abbinato.
   4. Centrifugare per 13 min a 250 xg per preparare plasma ricco di piastrine (PRP). Non utilizzare il freno della centrifuga per evitare disturbi del pellet poco compresso.
   5. Trasferire il PRP per un tubo di centrifugazione conica fresco. Centrifugare per 10 minuti a 4.500 g (con freno) per far sedimentare le piastrine e preparare il plasma povero di piastrine (PPP). Eliminare il platpellet elet. Incubare il PPP in un bagno d'acqua a 37 ° C.
   6. Trasferire i globuli rossi concentrati in una nuova provetta conica perforando il fondo quella originale con un ago 21 G.
      NOTA: La conta piastrinica residua nella frazione di cellule rossi concentrati è di 11 ± 4 x 10 ³ per ml (media ± DS, n = 10).
2. ricostituire il sangue
   1. Determinare l'ematocrito dei globuli rossi concentrati previste al punto 2.1.6 utilizzando un analizzatore ematologico automatico.
   2. Determinare la concentrazione piastrinica del concentrato piastrinico che verrà utilizzato per l'analisi con un analizzatore ematologico automatizzato.
   3. Calcolare il volume delle cellule imballati globuli rossi, concentrato piastrinico, e PPP che produrrà un ematocrito 40% e 250 x 10 ³ piastrine / ml in un volume finale 2,5 mL. Mescolare questi per preparare il sangue ricostituito ed eseguire un CBC.
      NOTA: Altri titoli bersaglio di cellule può essere utilizzato, a seconda thdomanda di ricerca e.
   4. Preparare un campione di controllo "vuoto", in cui il volume di concentrato piastrinico viene sostituito dallo stesso volume di soluzione fisiologica per determinare la concentrazione di piastrine "endogeni" (cioè non-sangue piastrine bancari).
3. Etichettare il sangue ricostituito per piastrine e fibrinogeno
   1. Pipettare 13 ml di 10,7 mg / ml soluzione di fibrinogeno Alexa Fluor 405-marcato (70 mg / ml concentrazione finale) in una provetta e aggiungere 1 ml di sangue ricostituito.
      NOTA: Il fibrinogeno è stato etichettato con un kit disponibile in commercio in base al manuale del costruttore.
   2. Mescolare un altro 1 ml di sangue ricostituita in una provetta contenente 2 ml di 1 mm DiOC ₆ (1 micron concentrazione finale) o contenenti 2 ml di 5 mm calceina AM (5 micron concentrazione finale). Aggiungere questo al tubo contenente il sangue con fibrinogeno, dando un volume finale di 2 ml di dalle piastrine e fibrinogeno-sil sangue nuto.
      NOTA: La scelta di colorante può dipendere dalla domanda di ricerca o la preferenza del ricercatore ^5. Essere consapevoli del fatto che l'eccitazione di qualsiasi colorante può causare artefatti fotochimici.
   3. Mescolare delicatamente invertendo. Incubare il campione per 10 min a 37 ° C.
4. Preparare il tampone di coagulazione
   1. Preparare tampone di coagulazione contenente 10 mM CaCl ₂ e 3,75 mM MgCl ₂ in HBS. Preparare 1 ml di tampone di coagulazione per un canale.
   2. Filtrare sterilizzare il buffer di coagulazione attraverso un filtro da 0,2 micron. Pre-caldo di questo a 37 ° C.

3. perfusione Assay

1. Focalizzare l'ottica del microscopio alle fibre di collagene aderito al fondo del canale. Utilizzare contrasto di fase o il contrasto di interferenza differenziale (DIC). Selezionare "Z corrente impostata per le regioni di piastrelle selezionate" nel software esperimento per risolvere in modo digitale la messa a fuoco selezionata.
2. Definire una regione di interesse (ROI) nel canale selezionato utilizzando il software di acquisizione del microscopio.
   NOTA: Il ROI può essere qualsiasi superficie arbitrariamente scelto all'interno di un canale di perfusione. Si consiglia non analizzare formazione di trombi e generazione di fibrina vicino alla entrata e uscita per evitare l'acquisizione di immagini di trombi uniformemente distribuito. La superficie ROI deve contenere un numero significativo di trombi per consentire il livellamento della variabilità del segnale da singole piastrine. La posizione della ROI nel piano xy del canale è sempre fisso e determinato prima perfusione. Se necessario, la parte non rivestita del canale può essere incluso nell'analisi per determinare se le piastrine si legano non specifico alla plastica biochip.
3. Preparare i campioni per la perfusione
   1. Montare una siringa da 1 ml contenente 1 ml di tampone di coagulazione pre-riscaldato nella pompa di perfusione.
   2. Mescolare il sangue pre-riscaldato ricostituito capovolgendo delicatamente e carico 2 mL in un mL siringa 2.
   3. Assicurarsi che tutta l'aria viene rimosso da entrambe le siringhe e collegare ciascuna ad un tubo da 8 cm con un pin del connettore siringa.
   4. Prime connettori e tubi di entrambe le siringhe ad alta velocità (400 ml / min) e fermarsi quando tutto è riempita con tampone di coagulazione del sangue o.
      NOTA: innesco del tubo, il buffer di coagulazione del sangue e ricostituito saranno immediatamente miscelati nel canale a forma di Y del biochip miscelazione quando iniziare l'esperimento, evitando l'introduzione di aria alle camere di perfusione.
4. Utilizzando perni, fissare l'altra estremità del tubo sia alle gambe di divisione del canale a forma di Y nella biochip miscelazione. La gamba inferiore è utilizzata per perfusione tampone coagulazione e la coscia di sangue ricostituito.
5. Inizia l'esperimento avviando perfusione a 4,4 ml / min per buffer di coagulazione e 44 ml / min per il sangue ricostituito. Rimuovere la pinza Kocher all'uscita del tubo di scarico per permettere perfusione.
   NOTA: portata può essere modificata a seconda della domanda di ricerca. Avviare un cronometro per determinare il tempo tra l'inizio dell'esperimento e l'inizio di acquisizione delle immagini in tempo reale.
6. Registrazione di immagini ogni 10 s per 30 min in tempo reale utilizzando il software di acquisizione e l'esperimento del microscopio. Avviare la registrazione quando il mix di sangue ricostituito e buffer di coagulazione entra nel biochip rivestito montato sul palco microscopio.
   NOTA: Altre Serie tempo può essere utilizzato a seconda del setup sperimentale. Utilizzare un ingrandimento 100X (obiettivo 10X e 10X lenti).

4. terminazione Experiment

1. Terminate le pompe e acquisizione delle immagini dopo 30 min o prima, se il segnale è saturo. Staccare tutti i tubi e siringhe e gettarli come rifiuti a rischio biologico.

Analisi 5. I dati

1. Determinare la crescita trombo (fluorescenza verde) e la formazione di fibrina (viola fluorescence) cinetiche con il software di analisi di immagine. I seguenti comandi sono specifici per il software utilizzato qui:
   1. Aprire la lavorazione dei plugin: cuciture per unire le immagini side-by-side per ogni punto del tempo.
   2. Aprire il plug-in di analisi dell'immagine per determinare la copertura della superficie delle piastrine.
   3. Aprire la Misura plugin. Definire il ROI disegnando un rettangolo di regione tra cui tutte le fibre trombi e di fibrina; in questo protocollo, il ROI è un rettangolo di 637 millimetri ^2.
      Selezionare la scheda Tutte Vista per includere tutti i punti di tempo registrati.
   4. Usare Creare tabelle per generare automaticamente un foglio di calcolo che conterrà il valore di intensità di fluorescenza media della regione rettangolo selezionato di ogni punto di tempo.
   5. Salvare i fogli di calcolo in formato XML.
2. Aprire un foglio di calcolo in un foglio di calcolo per ulteriori calcoli.
   1. Sottrarre l'iniziale (backgrouND) il valore di tutti i dati.
   2. Tracciare il segnale fluorescente in funzione del tempo di perfusione sia verde (piastrine) ei viola coloranti (fibrina).
      NOTA: Prendere in considerazione il tempo che intercorre tra l'inizializzazione della pompa e il punto di partenza effettiva di acquisizione delle immagini. La formazione del trombo è generalmente un processo in due fasi in questo modello: (1) "lento" adesione piastrinica (cioè, adesione) al collagene immobilizzato seguito da (2) crescita trombo coagulazione-guidato con un aumento "rapida" sia vincolante piastrinica ( cioè, accumulo) e la deposizione di fibrina (cioè, coagulazione) (Figura 1).
   3. Calcolare la pendenza della adesione piastrinica e l'accumulo mediante regressione lineare; questo versante produce piastrine cinetica di crescita trombo in ogni fase della sua formazione.
   4. Calcolare la pendenza della fibrina coagulazione ed estrapolare questa linea di intercettare l'asse X, determinare il momento di insorgenza.

Risultati

L'analisi dei dati in tempo reale grezzo viene descritto in Figura 1. Innanzitutto, le piastrine aderiscono alla superficie reattiva, con un conseguente aumento costante fluorescenza verde registrata (figura 1A, i), chiamati adesione. Durante questa fase, c'è poco fluorescenza viola, indicando che la fibrina non è o è solo marginalmente formato (Figura 1B). All'inizio della coagulazione, viola-fluorescenti depositi di fibrina rapidamente (iii), e durante quel tempo, piastrine verde fluorescenza aumenta a circa lo stesso tasso, designati qui come accumulo di piastrine (ii). Un singolo esperimento torna così tre tassi di aumento di fluorescenza (i, ii, e iii) come marker surrogato per la velocità con cui piastrine e fibrina deposizione avviene in questo modello. Inoltre, un momento di insorgenza della coagulazione (momento-di-insorgenza (iv)) viene estrapolato, che è un determinante di piastrinepotenziale procoagulante.

In assenza di TF, coagulazione iniziazione è lento e primariamente attraversa il percorso di contatto dove il complesso tenase intrinseca attiva FX mediante attivazione diretta FIX ⁶ da FXI e / o FXII. Per dimostrare la dipendenza FXII, 4 micron di inibitore della tripsina mais (CTI) è stato aggiunto per inibire FXII attivato (FXIIa) ^7. Questa inibizione non ha influenzato l'adesione delle piastrine (Figura 2A), ma la coagulazione non è stato avviato per la durata totale arbitrariamente definito dell'esperimento perfusione (Figura 2B e supplementare Video 1).

In vitro, il percorso contatto può essere avviata da materiali estranei come il vetro, o in saggi clinici utilizzando un materiale minerale, come il caolino. In vivo, piastrine attivate forniscono la carica negativa ^{8 <}/ sup> attraverso l'esposizione di membrana di fosfolipidi acidi ^9, come fosfatidilserina, e / o attraverso il rilascio di polifosfati (polipo) ^{10, 11.} I nostri microfluidici imita test in tempo reale il secondo perché, in un intervallo di concentrazioni di piastrine, la reazione emostatico dipendeva dalla conta piastrinica (Figura 3). Aumentando il numero di piastrine nel campione ricostituito, il tasso di aderenza (Figura 3A), di accumulo (Figura 3B, verde), e la coagulazione (Figura 3B, viola) aumentato linearmente. Il momento-di-insorgenza significativamente ridotto (Figura 3C) aumentando la concentrazione di piastrine, suggerendo che è richiesto un numero soglia (attivato) depositato piastrine per innescare la coagulazione.

Al momento danni ai tessuti in vivo, tuttavia, le cellule TF-cuscinetto Avrònitiate la coagulazione del sangue attraverso il FVIIa-TF complesso tenase estrinseca in presenza di Ca ^2+. Questo è imitato nel nostro setup sperimentale per post-rivestimento delle camere di perfusione collagene che contiene con lipidated rhTF. In un'analisi accoppiato di canali rivestiti con solo o in combinazione con rhTF collagene, coagulazione insorgenza era significativamente più veloce (Figura 4A). Il tasso di adesione piastrinica non era lineare, quindi non regressione lineare potrebbe essere eseguita (dati non mostrati). Sia il tasso di coagulazione e l'accumulo di piastrine non erano differenti tra le condizioni (Figura 4B-4C, supplementare Video 2).

Figura 1: L'analisi di regressione di adesione piastrinica e la coagulazione in camere di perfusione microfluidica. Questa figura chiarisce i parametri derivati ​​da tempo reale di fluorescenza dati grezzi acquisite durante il flusso di sangue ricalcificato su una superficie reattiva. (A) Media intensità della fluorescenza verde mostra deposizione piastrinica in funzione del tempo di perfusione. La curva descrive un processo bimodale che inizia con (i) aumentando lentamente adesione piastrinica lineare seguita da (ii) in rapida crescita accumulo lineare. Entrambe le parti lineari della curva sono regrediti e la pendenza di queste descrive due aliquote di formazione di trombi per fluorescenza piastrinica; (I) adesione e (ii) di accumulo. (B) Significa intensità della fluorescenza viola mostra la deposizione di fibrina in funzione del tempo. Durante adesione piastrinica, fluorescenza viola è essenzialmente assente, mentre sviluppa rapidamente seguente inizio della coagulazione. L'(iv) momento-del-insorgenza è definita come l'intercetta con l'asse x della regressione lineare estrapolata di (iii) la seconda fase di formazione di trombi per fluorescenza fibrina designato qui come coagulazione.ef = target "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/55351fig1large.jpg" = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2: In assenza di TF, coagulazione in camere a flusso perfusione collagene rivestite dipende FXIIa. Perfusione microfluidica di sangue ricostituito contenente CTI o buffer di controllo (CONTROL) è stata effettuata ad una velocità di taglio di 1000 s ^-1 per un totale di 30 min. (A) Il tasso di adesione piastrinica (s ^-1) non era dipendente da CTI. (B) Il momento-di-insorgenza per campioni CTI trattati era oltre il limite 30 min dell'esperimento (mostrato come una linea tratteggiata), dimostrando la dipendenza FXIIa di questo parametro. Bar e punti sono valori medi, i baffi sono deviazione standard. L'analisi statistica è stata da paired t-test. (NS = non significativo, n ≥3). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Coagulazione sotto flusso dipende dal numero delle piastrine. Esperimenti perfusione microfluidica sono stati eseguiti nelle camere di collagene rivestite di sangue ricostituita in presenza di Ca ²⁺ e concentrazioni piastriniche variabili (n ≥3). (A) Tasso di adesione piastrinica (B) tasso di accumulazione piastrinica (verde) e coagulazione (viola), e (C) momento-di-insorgenza sono mostrati come funzioni delle concentrazioni di piastrine nel sangue ricostituito. Dots sono valori medi, i baffi sono deviazioni standard. Clicca qui per visualizzare un Versi più grandisu questa figura.

Figura 4: Attivazione di entrambi TF e contatto della coagulazione riduce significativamente il momento-di-insorgenza della coagulazione. Ricostituita di sangue, in presenza di Ca ^2+, è stato perfuso con camere rivestite con solo o con collagene e rhTF studiare il pathway contatto solo o una combinazione delle vie di contatto e TF collagene. (A) Il momento-di-insorgenza della coagulazione è significativamente ridotta in camere di flusso TF contenenti. (B) Il tasso di accumulo di piastrine durante la coagulazione e (C) il tasso della coagulazione non sono significativamente diversi tra collagene solo o camere di flusso collagen- e rhTF-rivestite. Bar e punti sono valori medi; baffi sono deviazioni standard. L'analisi statistica è stata da paired t-test. (Ns = non significativo, * p < 0.05, n ≥3). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Video complementare 1: In assenza di TF, coagulazione in camere a flusso perfusione collagene rivestite dipende FXIIa. Il ruolo della via di contatto è determinato in camere di flusso perfusione collagene rivestite. (A) Sovrapposto sequenza di immagini di fluorescenza di piastrine (verde) e di fibrina (ogen) (viola) deposizione in assenza di CTI. (B) stessa sequenza come riquadro A ma con il canale verde spento. (C) Sovrapposto sequenza di immagini di fluorescenza di piastrine (verde) e di fibrina (ogen) (viola) deposizione in presenza di CTI. (D) stessa sequenza come il pannello C ma con il canale verde spento.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/Supplementary_video_1.avi "target =" _ blank "> Clicca qui per scaricare questo video.

Supplementare Video 2: L'attivazione di entrambi TF e il percorso contatto riduce in modo significativo la coagulazione momento-di-insorgenza. Per studiare il ruolo di TF, sono stati usati camere a flusso rivestiti con solo o con collagene e rhTF collagene. (A) Sovrapposto sequenza di immagini di fluorescenza di piastrine (verde) e di fibrina (ogen) (viola) deposizione in camere di flusso rivestito solo con il collagene. (B) stessa sequenza come riquadro A ma con il canale verde spento. (C) Sovrapposto sequenza di immagini di fluorescenza di piastrine (verde) e di fibrina (ogen) (viola) deposizione in camere di flusso rivestiti con collagene e rhTF. (D) stessa sequenza come il pannello C ma con la switc canale verdehed off. Clicca qui per scaricare questo video.

Discussione

La trasfusione di concentrati piastrinici è prescritto per il paziente trombocitopenica per prevenire o fermare l'emorragia. Il suo impatto clinico è stato recentemente evidenziato in una rassegna storica di leucemia acuta ^12, ricordando che un aumento dei tassi di sopravvivenza dei pazienti pediatrici negli anni sessanta e settanta sono stati in gran parte attribuibile al miglioramento (piastrine) medicina trasfusionale. concentrati piastrinici sono utilizzati anche per arginare sanguinamento nel trauma acuto o durante l'intervento chirurgico. In queste condizioni, le piastrine con eccellenti proprietà procoagulanti che avviare rapidamente emostasi sono preferiti, ma concentrati piastrinici sono preparati da donazioni di donatori volontari e, a differenza farmaco farmacologico, standardizzati per la preparazione solo, non per la composizione (chimica). Pertanto, molte domande nel settore bancario sangue sono risposta, compresi quelli sulle modalità ottimali di donazione, condizioni di conservazione, e le pratiche trasfusionali. Nel campo della platelet (trasfusione) biologia, molte domande sulla clearance delle cellule dalla circolazione, il contributo delle piastrine trasfuse per emostasi, o la loro immunologia anche rimanere senza risposta.

Numerose tecniche di laboratorio per l'analisi della funzione piastrinica sono disponibili, ma questi lo più affrontare un aspetto singolare della funzione piastrinica, come aggregazione o degranulazione ^13. Per valutare in generale piastrine e concentrati piastrinici, modelli completi di emostasi sono indispensabili, e queste devono includere idrodinamica. Reologia del sangue è essenziale per interpretare correttamente il comportamento delle piastrine durante emostasi ^{14, 15} o trombosi ^16, anche se l'anticoagulazione impedisce Ca ²⁺ e / o trombina di partecipare in presenza di citrato o eparina, rispettivamente, ^2. Per studiare l'interazione tra coagulazione e la funzione delle piastrine in condizioni di flusso ¹⁷, È necessario ^18, normale produzione di trombina, e quindi senza Ca ²⁺ pure. La configurazione sperimentale per studiare l'emostasi in queste condizioni è complesso, perché le misure di prevenzione "manufatto" o l'attivazione incontrollata della coagulazione dovrebbe essere presa il più possibile. Inoltre, molti gruppi di ricerca specializzati utilizzano misura dell'hardware ^{19, 20,} che causa notevole variabilità inter-laboratorio ^5. Limiti tipici di questo approccio sono l'uso di recipienti di forma rettangolare, profili di flusso non pulsatile, e non umani rivestimenti superficiali ^5. Il test che descriviamo qui utilizza strumenti disponibili in commercio e può quindi essere adatto per la standardizzazione.

Poiché la reazione cascata della coagulazione è facilmente attivabile volta sangue non è contenuto all'interno del corpo umano, ricalcificazione controllato è un passo fondamentale. To raggiungere questo obiettivo, l'aggiunta di Ca ²⁺ deve essere rinviata a poco prima della perfusione sulla superficie collagene reattiva, perché quando il buffer di ²⁺ Ca viene fornito sfuso al sangue statica, la coagulazione avviene inevitabilmente luogo, alla fine intasamento della tubazione e polarizzazione dei dati interpretazione (dati non mostrati). La soluzione a questo problema è di pompare il buffer Ca ²⁺ e il sangue separatamente, consentendo la miscelazione da forze convettivi e diffusivi durante la perfusione nel suo cammino verso la camera di analisi. miscelazione completa è raggiunto in un segmento di 46 cm di tubo fra le camere di miscelazione e di analisi. Questa lunghezza è stata calcolata per il tempo di permanenza ottimale dei reagenti per mescolare basato sulle leggi fondamentali della massa e il trasporto convettivo ²¹ durante la perfusione alla portata utilizzato (1.000 s ^-1). Questo approccio si è dimostrato controllabile e riproducibile.

Contatto attivazione della coagulazione è a volte visto come un artefatto di sempliceprelievo di sangue e da evitare quando si interpretano i tempi di coagulazione. Pertanto, abbiamo dimostrato che, in assenza di inibitori della coagulazione contatto indotta dalle ore 16.7 min (± 3,7 min) della perfusione. In presenza di CTI di inibire l'attivazione contatto FXIIa-mediata, coagulazione non è iniziata durante il corso arbitrariamente definito dell'esperimento (30 min). Questa finestra di sperimentazione è sufficientemente lungo per discernere i campioni che sono pro o antitrombotica. Anche se la coagulazione dall'attivazione contatto può essere una conseguenza indesiderata di sangue contatto con superfici artificiali, i nostri dati dimostrano un chiaro effetto dose biologica delle piastrine. Questo può essere importante per la medicina trasfusionale, perché recenti scoperte su FXII, piastrine polifosfati ^10, la distribuzione fosfatidilserina ^22, e microparticelle piastrine ²³ sono in realtà rivalutato contatto via coagulazione come un importante contributo alla emostasi, especialmente nel contesto di trombosi ^24. Per esempio, la resa variabile trasfusioni di piastrine nei pazienti o espressione fosfatidilserina variabile piastrine paraboliche possono quindi indurre variabilità dell'effetto terapeutico se coagulazione successo è mostrato a dipendere da questi fattori.

In co-immobilizzare lipidated rhTF con il collagene, il percorso di coagulazione estrinseca, o pathway TF, viene attivata durante la deposizione delle piastrine sul collagene. Questo si estende il saggio al suo modo più completo, come un modello per le lesioni che portano il sangue a contatto con le cellule TF-cuscinetto e tessuto. I nostri dati mostrano che co-immobilizzazione di collagene e TF diminuisce il momento della coagulazione insorgenza ma non modifica la velocità di coagulazione. Da notare, la quantità di rhTF immobilizzato sulla superficie è una variabile importante in questo modello ^{25, 26} e deve essere standardizzato entro un dato studio. Nel presence della CTI, il percorso TF può essere studiato esclusivamente (non mostrato) per l'attivazione contatto viene impedito.

In conclusione, il nostro apparato sperimentale combina un modello di trasfusioni per la ricostituzione del sangue trombocitopenica con le piastrine paraboliche e un modello di emostasi dalla deposizione delle piastrine calcio-dipendente e la formazione di fibrina sotto flusso idrodinamico. Questo test sarà utilizzato per rispondere a domande sulla natura procoagulante delle piastrine paraboliche e le tecniche di preparazione concentrato effetti piastrine avere su questo.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Siringa da 1 ml	BD	A00434
Siringa da 10 ml	BD	309604
Siringa da 2 ml	BD	307727
Alexa Fluor 405	Life Technologies	A30100	È stato seguito il manuale del produttore per l'etichettatura del fibrinogeno
BD vacutainer Eclipse	Becton, Dickinson and Company	368650	Ago per prelievo sangue con supporto premontato
Tubo vacutainer BD con EDTA	Becton, Dickinson and Company	368856
provetta vacutainer BD con citrato di sodio	Becton, Dickinson and Company	366575
Tampone bloccante	nella preparazione della casa	nella preparazione della casa	1,0% (p/v) di albumina sierica bovina e 0,1% (p/v) di glucosio nella
sonde molecolari	Calcein AM	C1430
Tampone di coagulazione	nella preparazione della casa	preparazione in casa	10 mM CaCl2 e 3,75  mM MgCl2 in provetta conica HBS
15 mL	Greiner bio-one	1888271
provetta conica 50 mL	Greiner bio-one	227261
Inibitore della tripsina di mais (CTI)	Enzyme Research Laboratories	CTI
Alcool denaturato	Fiers	T0011.5
DiOC6	Sigma-Aldrich	318426	3,3′-Dioxilossacarbocianina ioduro - 1 mM soluzione in
DMSO Pompa microfluidica Exigo	Cellix	EXIGO-PC-FS7.0-MF
Fibrinogeno	Sigma-Aldrich	F3879	Marcato internamente con AF 405 - concentrazione stock 10,7  mg/mL
Analizzatore ematologico	Sysmex	pocH-100i
HEPES soluzione salina tamponata (HBS)	in preparazione in casa	in casa	10 mM 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanesolfonico acido (HEPES) soluzione salina tamponata (0,9% (p/v) NaCl), pH 7,4
Horm Collagen	Takeda/Nycomed	1130630	Collagene nativo del tendine equino (tipo I) La soluzione isotonica di glucosio per diluire il collagene è integrato
Scatola umidificata	Cellix	HUMID-BOX
Incubazione bagnomaria	GFL	1013
Microscopio	Zeiss	Axio Observer Z1	dotato di colibri-LED e telecamera CCD ad alta risoluzione
Mirus Evo Nanopump	Cellix	188-MIRUS-PUMP-EVO	con pipetta Multiflow8
	Marca	A03429
Puntali per pipette 100-1000	Greiner bio-one	740290
Puntali per pipette 1-10	Eppendorf	A08928
Puntali per pipette 2-200	Greiner bio-one	739280
Agitatore orbitale per concentrato piastrinico	Helmer	PF-48i
Salviette di precisione	Kimtech	5511
Soluzione di pepsina	Strumento Hanna	HI7073L	2 g di pepsina per 75 mL di soluzione, Soluzione di pulizia delle proteine con pepsina
Fattore tissutale umano ricombinante Innovin	Dade Berhing	B4212-40	rhTF con fosfolipidi
sintetici Microscopio software	Zeiss	N/A	ZEN 2012
Dispositivo di aggancio sterile	Terumo BCT	TSCD
Centrifuga da tavolo	Eppendorf	521-0095
Rullo per tubi	Ratek	BTR5-12V
Sigillante per tubi	Terumo BCT	AC-155
Vena8 pin connettore siringa	Cellix	CONNECTORS-B1IC-PACK100
Vena8 Fluoro+ Biochips	Cellix	188V8CF-400-100-02P10	Biochip rivestito
Vena8 Aghi	Cellix	SS-P-B1IC-B1OC-PACK200
Tubi Vena8	Cellix	TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F
VenaDelta Y1 Biochips	Cellix	VDY1-400-100-01-02	Miscelatore
a vortice	di miscelazione VWR	58816-121
ZEN2012 software	Zeiss