I neuroni di imaging all'interno di sezioni di cervello spesse Uso del metodo di Golgi-Cox

Summary

Presentiamo un protocollo secondo il metodo di colorazione Golgi-Cox in sezioni di cervello spesse, per visualizzare neuroni con lunghi alberi dendritiche contenuti in campioni di tessuto singoli. Due varianti di questo protocollo sono anche presentati che coinvolgono di contrasto viola cresile, e il congelamento dei cervelli non trasformati per la conservazione a lungo termine.

Abstract

Il metodo di Golgi-Cox di neurone colorazione è stato impiegato per più di duecento anni per far progredire la nostra comprensione del neurone morfologia all'interno di campioni di cervello istologici. Mentre è preferibile dal punto di vista pratico per preparare sezioni di cervello del spessore maggiore possibile, al fine di aumentare la probabilità di identificare neuroni colorati che sono completamente contenuti all'interno delle singole sezioni, questo approccio è limitato dal punto di vista tecnico dalla distanza di lavoro di alta Ingrandimento obiettivi del microscopio. Riportiamo qui un protocollo per macchiare neuroni utilizzando il metodo Golgi-Cox in sezioni di cervello di topo che vengono tagliati a 500 spessore um, e visualizzare neuroni tutta la profondità di queste sezioni utilizzando un microscopio verticale dotato di alta risoluzione 30X 1,05 NA silicone obiettivo ad immersione in olio, che ha una distanza di lavoro di 800 micron. Si segnala inoltre due varianti utili di questo protocollo che può essere impiegato per colorazione di contrasto alla superficie dimontato sezioni di cervello con il violetto cresolo Nissl macchia, o di congelare cervelli interi per la conservazione a lungo termine prima di sezionamento e lavorazione finale. Il protocollo principale e le sue due varianti producono sezioni di cervello spesse colorate, durante il quale gli alberi pieni neurone e spine dendritiche dendritiche possono essere visualizzati in modo affidabile e quantificate.

Introduction

La visualizzazione dei singoli neuroni all'interno di campioni di tessuto consente l'analisi in situ di Neuron caratteristiche morfologiche, che ha notevolmente avanzato la nostra comprensione del cervello e come può essere influenzata dalla malattia endogena o fattori ambientali esogeni. Il metodo di colorazione Golgi-Cox è una soluzione economica, mezzi relativamente semplici di colorando un campione casuale di neuroni nel cervello. Primo sviluppato da Golgi ¹ e modificato da Cox ² nel 1800, i ricercatori hanno ulteriormente perfezionato questa tecnica nel corso degli anni per produrre chiare neuroni,....

Protocol

topi CD1-deformazione adulte di sesso femminile sono stati utilizzati in questo studio. colorazione simile può essere realizzato utilizzando entrambi i sessi alle varie età. Animali da esperimento sono stati curati secondo i principi e le linee guida del Consiglio canadese cura degli animali, e il protocollo sperimentale è stato approvato dalla University of Animal Care Comitato Guelph.

1. Golgi-Cox colorazione

1. Golgi-Cox impregnazione di Brains
   1. Rendere la soluzione Golgi-Cox di 1% (w / v) dicromato di potassio, 0,8% (w / v) cromato di potassio e 1% (w / v) di cloruro mercurico sciogliendo il bicromato ....

Results

Questo protocollo di colorazione Golgi-Cox e le sue due varianti descritte opzionali possono essere impiegati per visualizzare i singoli neuroni a 400 - 500 um di spessore sezioni del cervello. Rappresentativi montaggi di immagini bidimensionali Z-proiezioni catturate con un obiettivo 10X e 5 micron passi nell'asse Z sono mostrati in Figura 1: A1 - C1 per una grande area di sezioni di cervello coronali che include l'area corteccia anteriore cingolata 1 e la corteccia mot.......

Discussion

Descriviamo qui un protocollo di colorazione Golgi-Cox insieme a due varianti utili per la visualizzazione neuroni all'interno delle sezioni di cervello spesse. Come mostrato nelle Rappresentante dei risultati, l'uso di un obiettivo ad alta risoluzione che ha una lunga distanza di 800 micron di lavoro permette la visualizzazione affidabile di intere neuroni per tutta la profondità di sezioni di cervello tagliate a 500 micron. Questo studio di sezioni di cervello relativamente spessi aumenta la probabilità che i .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
bicromato di potassio	Fisher Scientific	P188-100	Cromato di potassio pericoloso
	Fisher Scientific	P220-100
Cloruro di mercurio	Fisher Scientific	S25423	Carta
da filtro Whatman grado 1	Fisher Scientific	1001-185
isoflurano	Partner farmaceutici del Canada
fiala di scintillazione da 20 mL	Fisher Scientific	03-337-4
saccarosio	Bioshop Canada	SUC700.1
fosfato di sodio monobasico	Sigma Aldrich	S5011-500G
fosfato di sodio bibasico	Sigma Aldrich	S9390-500G
provetta conica da 50 mL	Fisher Scientific	12-565-271
isopentano	Fisher Scientific	AC126470010	Conosciuto anche come 2-metilbutano; agar pericoloso
	Sigma Aldrich	A1296-100G
piatto di pesatura piccolo	Fisher Scientific	02-202-100
vibratomo	Leica	VT1000 S Piastre
coltura tissutale a 6 pozzetti	Fisher Scientific	08-772-1b
inserti per colture tissutali con fondo a rete	Fisher Scientific	07-200-214
paraformadelide (PFA), 16%	Microscopio elettronico	Sciences 15710-S
Idrossido di ammonio	Fisher Scientific	A669S-500
Pericoloso Kodak Fissativo A	Sigma Aldrich	P7542
superfrost plus vetrini	Fisher Scientific	12-550-15
Agente di compensazione CitroSolv	Fisher Scientific	22-143-975
alcol etilico anidro	Alcoli commerciali	N/A
cresil viola	Sigma Aldrich	C1791
permount	Fisher Scientific	SP15-100
microscopio
verticale modello Olympus BX53telecamera a colori, 12 bit	MBF Biosciences	DV-47d	QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12
Tavolino per microscopio motorizzato 3D, controller ed enoders	MBF Biosciences	N/A	Fornito e integrato con il microscopio da MBF Biosciences
Obiettivo per microscopio 4X	Olympus	4x 0.16 N.A. UplanSApo
10X obiettivo per microscopio	Olympus	10x 0.3 N.A. UPlan FL N
Obiettivo per microscopio 30X	Olympus	30x 1.05 N.A. UPlanSApo
Obiettivo per microscopio 60X	Olympus	60x 1.42 N.A. PlanAPO N
olio da immersione in silicone	Olympus	Z-81114
Software Neurolucida	MBF Biosciences	Versione 10
Software ImageJ	U. S. National Institutes of Health	Versione corrente	Con il plug-in OME Bio-Formats installato
Software	PhotoshopAdobe	versione CS6