Articolo metodologico

I neuroni di imaging all'interno di sezioni di cervello spesse Uso del metodo di Golgi-Cox

DOI:

10.3791/55358

⸱

18 aprile 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Ontario Veterinary College, University of Guelph

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentiamo un protocollo secondo il metodo di colorazione Golgi-Cox in sezioni di cervello spesse, per visualizzare neuroni con lunghi alberi dendritiche contenuti in campioni di tessuto singoli. Due varianti di questo protocollo sono anche presentati che coinvolgono di contrasto viola cresile, e il congelamento dei cervelli non trasformati per la conservazione a lungo termine.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il metodo di Golgi-Cox di neurone colorazione è stato impiegato per più di duecento anni per far progredire la nostra comprensione del neurone morfologia all'interno di campioni di cervello istologici. Mentre è preferibile dal punto di vista pratico per preparare sezioni di cervello del spessore maggiore possibile, al fine di aumentare la probabilità di identificare neuroni colorati che sono completamente contenuti all'interno delle singole sezioni, questo approccio è limitato dal punto di vista tecnico dalla distanza di lavoro di alta Ingrandimento obiettivi del microscopio. Riportiamo qui un protocollo per macchiare neuroni utilizzando il metodo Golgi-Cox in sezioni di cervello di topo che vengono tagliati a 500 spessore um, e visualizzare neuroni tutta la profondità di queste sezioni utilizzando un microscopio verticale dotato di alta risoluzione 30X 1,05 NA silicone obiettivo ad immersione in olio, che ha una distanza di lavoro di 800 micron. Si segnala inoltre due varianti utili di questo protocollo che può essere impiegato per colorazione di contrasto alla superficie dimontato sezioni di cervello con il violetto cresolo Nissl macchia, o di congelare cervelli interi per la conservazione a lungo termine prima di sezionamento e lavorazione finale. Il protocollo principale e le sue due varianti producono sezioni di cervello spesse colorate, durante il quale gli alberi pieni neurone e spine dendritiche dendritiche possono essere visualizzati in modo affidabile e quantificate.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La visualizzazione dei singoli neuroni all'interno di campioni di tessuto consente l'analisi in situ di Neuron caratteristiche morfologiche, che ha notevolmente avanzato la nostra comprensione del cervello e come può essere influenzata dalla malattia endogena o fattori ambientali esogeni. Il metodo di colorazione Golgi-Cox è una soluzione economica, mezzi relativamente semplici di colorando un campione casuale di neuroni nel cervello. Primo sviluppato da Golgi 1 e modificato da Cox 2 nel 1800, i ricercatori hanno ulteriormente perfezionato questa tecnica nel corso degli anni per produrre chiare neuroni, ben colorate, che possono essere utilizzati per visualizzare e quantificare sia albero dendritico morfologia e densità delle spine 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9.

Una considerazione importante tecnica per la visualizzazione dei neuroni colorati all'interno delle sezioni cerebrali è lo spessore massimo fetta, che è limitata dalla distanza di lavoro di alto ingrandimento / obiettivi del microscopio ad alta risoluzione disponibili. Obiettivi ad immersione in olio comuni nel 60 - 100X raggio forniscono un'eccellente risoluzione, ma sono limitati dalla loro distanze di lavoro che sono in genere non superiore a 200 micron. Sezioni di cervello tagliato al micron tra 200 possono essere sufficienti per visualizzare alcuni tipi di neuroni che possono essere contenuti all'interno di questo spessore di strato, ad esempio neuroni piramidali negli strati superficiali della corteccia cerebrale 10, 11, 12, neuroni piramidali della regione CA1 della ippocampo 13, 14, e cellule granulari del giro dentato dell'ippocampo 15. I neuroni con relativamente più lungoalberi dendritiche, come i neuroni piramidali raggio strati profondi della corteccia cerebrale che per il mouse può estendersi oltre 800 um dal corpo cellulare 16, forniscono una sfida maggiore perché dovrebbero essere sezionati a un angolo perfetto cervello per contenere l'intero albero dendrite entro 200 micron fette. Questo può anche non essere fattibile se un dendrite o uno dei suoi rami si estendono in direzione rostrale o caudale. Mentre è possibile affrontare questa limitazione tracciando un neurone in più sezioni di cervello adiacenti, questo approccio introduce una sfida tecnica significativa allineamento delle sezioni accuratamente per tracciare 17. Un approccio più pratico sarebbe visualizzare intere neuroni contenuti in sezioni di cervello che vengono tagliati a spessore maggiore.

Riportiamo qui una tecnica per colorare i neuroni all'interno di 400-500 micron di spessore sezioni del cervello di topi con il metodo di Golgi-Cox, e visualizzare il loro morphology utilizzando un obiettivo ad immersione in olio di silicone ad alta risoluzione che ha una distanza di lavoro di 800 um. L'impregnazione e l'elaborazione del protocollo Golgi-Cox che descriviamo viene modificato da uno dei protocolli moderni più citati nella letteratura 6. Il nostro approccio con sezioni di cervello spesse offre il vantaggio di aumentare la probabilità di identificare neuroni di qualsiasi tipo che sono completamente contenuto all'interno della sezione. Oltre al protocollo principale, abbiamo anche presentare due varianti che forniscono vantaggi unici: (1) colorazione Golgi-Cox con la controcolorante violetto cresolo sulla superficie delle sezioni montate, al fine di definire i confini di regioni cerebrali e identificare strati della corteccia cerebrale, e (2) Golgi-Cox colorazione con una fase di congelamento intermedio per la conservazione a lungo termine di cervelli interi impregnate prima del sezionamento e lavorazione finale.

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Protocollo

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topi CD1-deformazione adulte di sesso femminile sono stati utilizzati in questo studio. colorazione simile può essere realizzato utilizzando entrambi i sessi alle varie età. Animali da esperimento sono stati curati secondo i principi e le linee guida del Consiglio canadese cura degli animali, e il protocollo sperimentale è stato approvato dalla University of Animal Care Comitato Guelph.

1. Golgi-Cox colorazione

  1. Golgi-Cox impregnazione di Brains
    1. Rendere la soluzione Golgi-Cox di 1% (w / v) dicromato di potassio, 0,8% (w / v) cromato di potassio e 1% (w / v) di cloruro mercurico sciogliendo il bicromato di potassio e potassio cromato nell'acqua alta qualità separatamente . Mescolare le soluzioni, aggiungere il cloruro mercurico e filtrare la soluzione finale con grado 1 carta filtro. Conservare la soluzione al buio per un massimo di un mese.
    2. Anestetizzare il mouse utilizzando 5% isoflurano.
    3. Eutanasia il mouse per decapitazione e rimuovere rapidamente il cervello.
    4. Posizionare il cervello in una fiala di scintillazione 20 vetro mL contenente 17 mL di soluzione di Golgi-Cox e incubare al buio a temperatura ambiente per 25 d.
    5. Cryoprotect cervello ponendolo in una provetta conica da 50 ml contenente 40 ml di saccarosio crioprotettore (30% (w / v) di saccarosio in tampone fosfato 0,1 M, pH 7,4) al buio a 4 ° C per 24 h.
      NOTA: Le seguenti tre passaggi facoltativi possono essere impiegati come alternativa al protocollo principale, al fine di congelare il cervello, in questa fase per la conservazione a lungo termine.
    6. Congelare l'intero cervello immergendolo in 200 mL isopentano che è stato pre-raffreddata in ghiaccio secco.
    7. Posizionare il cervello congelato in una provetta e conservare 50 conica al buio a -80 ° C.
    8. Quando pronto a procedere, scongelare il cervello ponendolo in una provetta conica da 50 ml contenente 40 ml di crioprotettore saccarosio al buio a 4 ° C per 24 h.
  2. cervello sezionamento
    1. Rimuovere il cervello dal saccarosio e block per sezionamento tagliando il cervelletto con una lama di rasoio e lasciando un bordo piatto alla restante estremità caudale del cervello.
    2. agar calore (3% (w / v) in acqua) fino a fusione e lasciata raffreddare fino a quando è lievemente superiore al suo punto di fusione.
    3. Collocare il cervello in un piccolo piatto pesare monouso con la sua estremità caudale faccia in giù e aggiungere una quantità sufficiente di agar fuso per coprire il cervello.
    4. Una volta che l'agar è solidificato, rifilare eccesso agar lasciando circa di 2 - 4 mm circonda il cervello e incollare il cervello alla fase di un vibratome con la sua estremità caudale faccia in giù utilizzando una piccola quantità di colla etile cianoacrilato.
    5. Riempire l'area fase vibratome con una quantità sufficiente di crioprotettore saccarosio per coprire il cervello, e la sezione del cervello ad uno spessore fetta 400 - 500 um (a seconda della regione del cervello da esaminare) utilizzando una frequenza di vibrazione di 86 Hz e una velocità di avanzamento della lama 0,125 mm / s.
    6. Usando un piccolo pennello, Sezioni posto cervello in un pozzetto di una piastra di coltura tissutale 6 pozzetti contenenti inserti in mesh-bottom disponibili in commercio e preriempita con 10 ml di 6% (w / v) di saccarosio in tampone fosfato 0,1 M, pH 7,4.
    7. Incubare sezioni al buio a 4 ° CO / N.
  3. Sviluppo del cervello Sezioni
    1. Usando gli inserti in mesh-bottom, trasferire sezioni di cervello in un nuovo pozzetto contenente 5 ml di 2% (w / v) paraformaldeide (PBD) in tampone fosfato 0,1 M, pH 7,4. Incubare su un agitatore meccanico in movimento a velocità ridotta al buio a temperatura ambiente per 15 min.
    2. Lavare sezioni due volte trasferendoli nuovi pozzetti contenenti 5 ml di acqua. Lavare su un bilanciere muove ad una velocità moderata al buio a temperatura ambiente per 5 min.
    3. sezioni di trasferimento in un nuovo pozzetto contenente 5 mL di 2,7% (v / v) di idrossido di ammonio. Incubare su un agitatore meccanico muove ad una velocità lenta al buio a temperatura ambiente per 15 min.
    4. Lavare sezioni due volte trasferendoli nuovi pozzetti contenenti 5 ml di acqua. lavare ona rocker muove ad una velocità moderata al buio a temperatura ambiente per 5 min.
    5. Sezioni di trasferimento in un nuovo pozzetto contenente 5 ml di fissativo A (vedi Materiali Tavolo) che è stato diluito in acqua 10 volte dalla sua concentrazione originale acquistato. Incubare su un agitatore meccanico muove ad una velocità lenta al buio a temperatura ambiente per 25 min.
    6. Lavare sezioni due volte trasferendoli nuovi pozzetti contenenti 5 ml di acqua. Lavare su un bilanciere muove ad una velocità moderata al buio a temperatura ambiente per 5 min.
  4. Montaggio cervello Sezioni
    1. Con un piccolo pennello, montare sezioni su vetrini da microscopio. Rimuovere l'acqua in eccesso e agar usando pinzette e un piccolo tessuto. Assicurarsi che tutta l'agar viene rimosso prima di procedere con la disidratazione.
    2. Consentire sezioni di aria secca a temperatura ambiente per circa 45 min (400 sezioni micron) o 90 min (500 sezioni micron).
      NOTA: Il livello tempi e propria di secchezza è critica, e può essere necessario determinare per ciascunlaboratorio seconda della temperatura ambiente e umidità. Troppo breve tempo di asciugatura porta a sezioni caduta di diapositive durante successive fasi di disidratazione, e troppo tempo di asciugatura porta a sezioni di cracking. Le sezioni saranno ancora sembrano essere lucido al livello appropriato di secchezza.
    3. sezioni macchia con violetto cresolo ponendo i vetrini in Coplin vaschette di colorazione come indicato.
      NOTA: Questa opzione potrebbe essere impiegato per le sezioni che non erano mai stati congelati, al fine di macchiare nuclei neuronali con violetto cresolo. Abbiamo scoperto che la compensazione e reidratante sezioni prima di incubazione in violetto cresolo porta anche alle macchie e bassa sfondo attraverso le sezioni.
      1. Mettere in stanza di compensazione per 5 min. Ripetere una volta.
      2. Mettere in 100% di etanolo per 5 min. Ripetere una volta.
      3. Mettere in etanolo al 95% in acqua, quindi il 75% di etanolo in acqua, e poi il 50% di etanolo in acqua per 2 minuti ciascuna.
      4. Mettere in acqua per 5 minuti.
      5. Mettere in 0,5% (w / v) creSyl violetto in acqua per 7 min.
      6. Mettere in acqua per 2 minuti. Ripetere una volta.
    4. Disidratare sezioni ponendo i vetrini in Coplin vaschette di colorazione come indicato.
      1. Mettere in etanolo al 50% in acqua, quindi il 75% di etanolo in acqua, e poi il 95% di etanolo in acqua per 2 minuti ciascuna.
      2. Mettere in 100% di etanolo per 5 min. Ripetere una volta.
      3. Mettere in stanza di compensazione per 5 min. Ripetere una volta.
        NOTA: Queste disidratazione e che eliminano i periodi sono sufficienti per elaborare il cervello di topo, come descritto in questo manoscritto. Tuttavia, abbiamo osservato per altre specie tra ratto e cowbird, che la fase di compensazione finale può dover essere estesa fino a 15 min totale.
    5. sezioni coprioggetto utilizzando un mezzo di montaggio anidro.
    6. I vetrini asciugare orizzontalmente al buio a temperatura ambiente per almeno 5 d.

2. Imaging macchiato neuroni all'interno del cervello spesse Sezioni

  1. Catturare Serie di immagini
    1. Accendere la lampadina microscopio, telecamera, e il controller fase.
    2. Aprire il software microscopio (ad esempio, Neurolucida).
    3. Posizionare un vetrino sul palco microscopio.
    4. Ritrarre una vista immagine 2D della sezione cervello utilizzando un obiettivo a basso ingrandimento come 1,25X 0,4 NA Planapo o 4X 0,16 NA
      1. Mettere a fuoco l'immagine e regolare le impostazioni della fotocamera, tra cui il tempo di esposizione e bilanciamento del bianco.
      2. Creare un punto di riferimento da sinistra-clic su un punto qualsiasi della sezione
      3. Acquisire l'immagine selezionando "acquisire una sola immagine" all'interno della finestra di acquisizione delle immagini.
    5. Catturare metà risoluzione pile di immagini della zona contenente i neuroni (i) di interesse, utilizzando un obiettivo 10X 0,3 NA uPlan FL N.
      1. Mettere a fuoco l'immagine e regolare le impostazioni della fotocamera, tra cui l'esposizione e il bilanciamento del bianco.
      2. Impostare i limiti superiori e inferiori per la serie di immagini puntando alla parte superiore della sezione di unnd selezionando "set" accanto a "cima alla pila" all'interno della finestra di acquisizione delle immagini, e quindi concentrandosi sul fondo della sezione e selezionando "set" accanto a "fondo di stack" all'interno della finestra di acquisizione delle immagini.
      3. Impostare la distanza di incremento di 5 um inserendo "5 um" accanto a "distanza tra le immagini" all'interno della finestra di acquisizione delle immagini.
      4. Catturare la serie di immagini selezionando "immagine acquisiscono stack" all'interno della finestra di acquisizione delle immagini.
      5. Ripetere i passaggi precedenti per catturare tutta l'area di interesse, facendo in modo che tutte le pile di immagini si sovrappongono di almeno il 10% nella assi X e Y.
    6. Cattura alta risoluzione pile di immagini della zona contenente il neurone di interesse, utilizzando un 30X 1,05 NA silicone obiettivo ad immersione in olio.
      1. Applicare 3 - 4 gocce di olio di silicone immersione alla slitta e posizionare l'obiettivo sul vetrino, assicurando di entrare in contatto tra l'obiettivo e il oil.
      2. Mettere a fuoco l'immagine e regolare le impostazioni della fotocamera, tra cui l'esposizione e il bilanciamento del bianco.
      3. Impostare i limiti superiore e inferiore per la pila, concentrandosi all'inizio della sezione e selezionando "set" accanto a "cima alla pila" all'interno della finestra di acquisizione delle immagini, e quindi concentrandosi sul fondo della sezione e selezionando "set" accanto a "fondo di stack" all'interno della finestra di acquisizione delle immagini.
      4. Impostare la distanza di passo 1 um immettendo "1 um" accanto a "distanza tra le immagini" all'interno della finestra di acquisizione delle immagini.
      5. Catturare la serie di immagini selezionando "immagine acquisiscono stack" all'interno della finestra di acquisizione delle immagini.
      6. Ripetere i passaggi precedenti per catturare tutta l'area di interesse, facendo in modo che tutte le pile di immagini si sovrappongono di almeno il 10% nella assi X e Y.
    7. Salvare il file di dati e salvare tutti i file di immagine in formato TIFF per l'elaborazione esterna.
  2. Creazione di immagini Z-proiezione e immagine montaggi
    1. Creare immagini Z-proiezione in ImageJ
      1. il software ImageJ aperto che ha installato il plugin Bio-formati.
      2. Selezionare "Plugins" -> "Bio-formati" -> "Bio-Formati Importatore".
      3. Selezionare il file serie di immagini da aprire.
      4. Una volta che il file viene aperto, modificare il formato RGB selezionando "Immagine" -> "Tipo" -> "colore RGB".
      5. Creare la Z-proiezione selezionando "Immagine" -> "Stack" -> "Z Progetto ...".
      6. Salva Immagine con Z-proiezione bidimensionale come file TIFF.
    2. Creare un'immagine montaggio bidimensionale di tutta l'area di interesse.
      1. Aprire il software (ad esempio, Adobe Photoshop).
      2. Selezionare "File" -> "Automatizzare" -> "Photomerge".
      3. Selezionare "Sfoglia" e quindi aggiungere tutti imagfile ES da unire.
      4. Assicurarsi che "Blend Images Insieme" è selezionato e quindi selezionare "OK".
      5. Salvare l'immagine risultante montaggio di tutta l'area di interesse come file TIFF.

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Risultati

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Questo protocollo di colorazione Golgi-Cox e le sue due varianti descritte opzionali possono essere impiegati per visualizzare i singoli neuroni a 400 - 500 um di spessore sezioni del cervello. Rappresentativi montaggi di immagini bidimensionali Z-proiezioni catturate con un obiettivo 10X e 5 micron passi nell'asse Z sono mostrati in Figura 1: A1 - C1 per una grande area di sezioni di cervello coronali che include l'area corteccia anteriore cingolata 1 e la corteccia mot...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descriviamo qui un protocollo di colorazione Golgi-Cox insieme a due varianti utili per la visualizzazione neuroni all'interno delle sezioni di cervello spesse. Come mostrato nelle Rappresentante dei risultati, l'uso di un obiettivo ad alta risoluzione che ha una lunga distanza di 800 micron di lavoro permette la visualizzazione affidabile di intere neuroni per tutta la profondità di sezioni di cervello tagliate a 500 micron. Questo studio di sezioni di cervello relativamente spessi aumenta la probabilità che i ...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto da un Discovery Grant CDCB dalle scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada (NSERC), un John R. Evans Leaders Fund infrastruttura di ricerca concessione di CDCB dal Canada Fondazione per l'innovazione (CFI numero di progetto 30381), e un Discovery Grant NJM da NSERC. ELL è stato sostenuto da una borsa di studio Ontario Laureato e da una borsa di studio OVC dalla Ontario Veterinary College presso l'Università di Guelph. CDS è stato supportato da una ricerca assistentato Undergraduate Student da NSERC. ALM è stato sostenuto da una borsa di studio Alexander Graham Bell da NSERC e da una borsa di studio OVC dalla Ontario Veterinary College presso l'Università di Guelph.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
bicromato di potassioFisher ScientificP188-100Cromato di potassio pericoloso
Fisher ScientificP220-100
Cloruro di mercurioFisher ScientificS25423Carta
da filtro Whatman grado 1Fisher Scientific1001-185
isofluranoPartner farmaceutici del Canada
fiala di scintillazione da 20 mLFisher Scientific03-337-4
saccarosioBioshop CanadaSUC700.1
fosfato di sodio monobasicoSigma AldrichS5011-500G
fosfato di sodio bibasicoSigma AldrichS9390-500G
provetta conica da 50 mLFisher Scientific12-565-271
isopentanoFisher ScientificAC126470010Conosciuto anche come 2-metilbutano; agar pericoloso
Sigma AldrichA1296-100G
piatto di pesatura piccoloFisher Scientific02-202-100
vibratomoLeicaVT1000 S Piastre
coltura tissutale a 6 pozzettiFisher Scientific08-772-1b
inserti per colture tissutali con fondo a reteFisher Scientific07-200-214
paraformadelide (PFA), 16%Microscopio elettronicoSciences 15710-S
Idrossido di ammonioFisher ScientificA669S-500
Pericoloso Kodak Fissativo ASigma AldrichP7542
superfrost plus vetriniFisher Scientific12-550-15
Agente di compensazione CitroSolvFisher Scientific22-143-975
alcol etilico anidroAlcoli commercialiN/A
cresil violaSigma AldrichC1791
permountFisher ScientificSP15-100
microscopio
verticale modello Olympus BX53telecamera a colori, 12 bitMBF BiosciencesDV-47dQImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12
Tavolino per microscopio motorizzato 3D, controller ed enodersMBF BiosciencesN/AFornito e integrato con il microscopio da MBF Biosciences
Obiettivo per microscopio 4XOlympus4x 0.16 N.A. UplanSApo
10X obiettivo per microscopioOlympus10x 0.3 N.A. UPlan FL N 
Obiettivo per microscopio 30XOlympus30x 1.05 N.A. UPlanSApo 
Obiettivo per microscopio 60XOlympus60x 1.42 N.A. PlanAPO N
olio da immersione in siliconeOlympusZ-81114
Software NeurolucidaMBF BiosciencesVersione 10
Software ImageJU. S. National Institutes of HealthVersione correnteCon il plug-in OME Bio-Formats installato
SoftwarePhotoshopAdobeversione CS6
pericoloso pericolosa CP0406V2 per pericoloso

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Golgi Cox MethodNeuron StainingThick Brain SectionsSilicone Oil ImmersionCresyl Violet StainBrain SectioningVibratome SectioningImage Stack AcquisitionDendritic Tree VisualizationSpine Density Analysis

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