Articolo metodologico

Maturazione di staminali umane cardiomiociti derivati ​​dalle cellule in Biowires Utilizzando Stimolazione Elettrica

DOI:

10.3791/55373

⸱

6 maggio 2017

 , 
1Toronto General Research Institute, University Health Network, 2Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto, 3Heart & Stroke/Richard Lewar Centre of Excellence, University of Toronto, 4Laboratory of Medicine and Pathobiology, University of Toronto

In questo articolo

Sommario

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La piattaforma BIOWIRE cardiaco è un metodo in vitro utilizzato per maturare embrionale umano e cardiomiociti derivati dalle cellule staminali pluripotenti indotte (HPSC-CM) combinando coltura cellulare tridimensionale con stimolazione elettrica. Questo manoscritto presenta la configurazione dettagliata della piattaforma BIOWIRE cardiaco.

Abstract

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cardiomiociti derivati ​​dalle cellule staminali umane pluripotenti (HPSC-CMS) sono stati una fonte di cellule promettente e hanno così favorito l'esame delle loro potenziali applicazioni nel campo della ricerca cardiaca, tra cui la scoperta di farmaci, la modellazione della malattia, l'ingegneria dei tessuti e della medicina rigenerativa. Tuttavia, le cellule prodotte da protocolli esistenti mostrano una serie di immaturità rispetto ai cardiomiociti adulti ventricolare nativi. Molti sforzi sono stati fatti maturare HPSC-CM, con solo la maturazione moderata raggiunto finora. Pertanto, un sistema ingegnerizzato, chiamato BIOWIRE, è stato ideato prevedendo stimoli fisici ed elettrici di condurre HPSC-CM ad uno stato più maturo in vitro. Il sistema utilizza una piattaforma microfabbricazione per seminare HPSC-CM in collagene tipo I gel lungo un modello di sutura rigido da montare nel tessuto cardiaco allineata (BIOWIRE), sottoposto alla stimolazione campo elettrico con una frequenza progressivamente crescente. Rispetto ai controlli non stimolate,stimolati biowired cardiomiociti presentano un maggiore grado di maturazione strutturale ed elettrofisiologico. Tali cambiamenti dipendono dalla frequenza di stimolazione. Questo manoscritto descrive in dettaglio la progettazione e realizzazione di biowires.

Introduzione

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La terapia a base di cellule è una delle strategie più promettenti e studiati per raggiungere cardiaca riparazione / rigenerazione. E 'stato aiutato da ingegneria dei tessuti cardiaco e il co-fornitura di biomateriali 1, 2. La maggior parte delle fonti di cellule disponibili sono stati studiati in modelli animali per i loro effetti potenzialmente benefici sulla danneggiati, malati, o cuori di età compresa tra 3. In particolare, notevoli sforzi sono stati fatti per usare cellule staminali pluripotenti umane (HPSC) -derived cardiomiociti (HPSC-CM), una fonte di cellule autologhe potenzialmente illimitato per l'ingegneria tissutale cardiaco. HPSC-CM può essere prodotto utilizzando diversi protocolli stabiliti 4, 5, 6. Tuttavia, le cellule ottenute mostrano fenotipi fetali simile, con una serie di caratteristiche immaturi rispetto al cardiomiociti ventricolari adulti 7, 8. Questo può essere un ostacolo per l'applicazione di HPSC-CMS come modelli di tessuto cardiaco degli adulti nella ricerca scoperta di nuovi farmaci e lo sviluppo di modelli di malattia cardiaca per adulti 9.

Per superare questa limitazione di immaturità fenotipica, nuovi approcci sono stati attivamente studiati per promuovere la maturazione dei cardiomiociti. I primi studi hanno rivelato efficaci proprietà pro-maturazione in cardiomiociti neonatali di ratto tramite ciclico 10 meccanica o stimolazione elettrica 11. Compattazione gel e ciclica stimolazione meccanica stati mostrati anche di migliorare alcuni aspetti della HPSC-CM maturazione 12, 13, con un minimo aumento delle proprietà di manipolazione elettrofisiologiche e di calcio. Pertanto, un sistema piattaforma chiamata "wire biologica" (BIOWIRE) è stato ideato fornendo sia segnali strutturali e campo elettrico stimulation per migliorare la maturazione di HPSC-CM 14. Questo sistema utilizza una piattaforma microfabbricazione per creare tessuto cardiaco allineato che è suscettibile di stimolazione campo elettrico. Questo può essere usato per migliorare la maturità strutturale ed elettrofisiologico di HPSC-CM. Qui, descriviamo i dettagli di tale biowires.

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Protocollo

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1. master e Fabrication

Nota: utilizzare litografia soft per la fabbricazione di dispositivi. Fare un doppio strato SU-8 master per polidimetilsilossano (PDMS) stampaggio.

  1. Progettare il dispositivo utilizzando un design e redazione software (Figura 1A, sinistra). Disegnare ogni strato del maestro separatamente. Stampa il design del dispositivo su due fotomaschere a 20.000 dpi, corrispondenti ai due strati del maestro 15. Impostare il modello dispositivo trasparente e la zona circostante scura; le maschere serviranno da modello per trasferire il disegno otticamente dispositivo sul SU-8 mediante litografia (come descritto da altri 15).
  2. Distribuire circa 4 mL di SU-8 50 sul centro di un wafer di silicio da 4 pollici. Coat SU-8 50 uniformemente sul wafer utilizzando un rivestitore rotazione mediante filatura a 2000 giri al minuto (rpm) per 30 s. Cuocere il wafer su una piastra riscaldante a 95 ° C per 10 min. Esporre il wafer a raggi ultravioletti (UV) lilotta a 200 mJ / cm 2.
  3. Versare circa 4 mL di SU-8 2050 sul centro del wafer e centrifuga a 2500 giri per 30 s. Cuocere sulla piastra C 95 ° per 15 min. Raffreddare a temperatura ambiente (RT).
  4. Ripetere il punto 1.3 altre due volte.
  5. Coprire il wafer rivestito con la trasparenza fotomaschera primo strato. Esporre il wafer di luce UV a 270 mJ / cm 2 per effettuare il primo strato. Cuocere sulla piastra C 95 ° per 15 min.
  6. Rendere il secondo strato di SU-8 2050 ripetendo passo 1,3 volte.
  7. Allineare la maschera secondo strato alle caratteristiche sul primo strato mediante un allineatore maschera. Poi, esporre a luce UV a 240 mJ / cm2. Cuocere in forno a 95 ° C per 15 min.
    NOTA: Il tempo di esposizione è determinato dalla dose di UV totale richiesta e l'intensità di uscita luce UV misurata il giorno prima dell'uso.
  8. Sviluppare il wafer immergendo in propilenglicole monometiletere acetato (PGMEA) e agitazione a 200 giri per 30 minuti in un agitatore orbitale.
  9. Postoil master in una piastra di Petri e con attenzione versare il composto PDMS (base a reticolante ad un rapporto di 10: 1 in peso) sul centro del wafer. Coprire tutte le caratteristiche ed evitare bolle d'aria.
  10. Il calore in un forno a 70 ° C per 2 ore. Utilizzare una lama tagliente per tagliare intorno al bordo della dima BIOWIRE PDMS (Figura 1A, destra). Sbucciare le PDMS dal master. Tagliare il dispositivo con la lama. Mettere il modello BIOWIRE PDMS in un sacchetto di sterilizzazione e autoclave a vapore a 121 ° C per 20 minuti.
  11. In un armadio biosicurezza (BSC), posizionare il PDMS BIOWIRE modello in una capsula di Petri. Utilizzare una pinzetta per tenere e montare un pezzo di sterile sutura chirurgica seta (6-0) al centro del canale del micropozzetto PDMS tali sedili nelle scanalature su entrambe le estremità del canale (Figura 1B-I).

2. Creazione della stimolazione elettrica Camera

  1. Fare un paio di pezzi di policarbonato rettangolari (lunghezza x larghezza x spessore: 2 cm x0,85 cm x 0,35 cm) e usarli come la struttura della camera di stimolazione elettrica (Figura 2).
  2. Praticare due fori 3 millimetri larghezza 2 cm di distanza lungo la linea centrale di ogni pezzo di telaio in policarbonato.
  3. Tagliare due pezzi di 1,5 cm aste lungo carbonio. Praticare un foro 1 mm di larghezza attraverso l'asta di carbonio di circa 3 mm dall'estremità. Infilare un filo di platino attraverso il foro dell'asta del carbonio e serrare il filo avvolgendolo intorno all'asta carbonio. Collegare una clip all'altra estremità del filo di platino per la connessione in seguito con lo stimolatore elettrico.
  4. Inserire le barre di carbonio nelle parti del telaio del policarbonato. Posizionare il telaio assemblato con le barre di carbonio in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti.
  5. Versare 2 ml di PDMS nel pozzo. Immergere la parte inferiore dei telai policarbonato in PDMS mantenendo il livello di superficie PDMS vicino ma non raggiungere il fondo delle barre di carbonio. Il calore in un forno a 70 ° C per 2 ore.
  6. Prendere la camera di stimolazione elettrica dei seipiastra -well e metterlo in un sacchetto di sterilizzazione per la sterilizzazione a vapore a 121 ° C per 20 min.

3. enzimatica dissociazione di HPSC-CMS

  1. Indurre HPSC di differenziarsi in cardiomiociti utilizzano un protocollo stabilito 4.
    NOTA: Brevemente, generare cardiomiociti via corpo embrioide fissato (EB) protocolli stelo pro mezzo attraverso la supplementazione sequenziale con proteina ossea morfogenetica 4, fattore di crescita dei fibroblasti, activin A, fattore di crescita vascolare endoteliale, e Dickkopf omologo 1 4. Utilizzare EBs dal giorno 20-34 di differenziazione per fare biowires.
  2. Raccogliere EBS dalla piastra partire allegato con un puntale P 1.000 e trasferire in una provetta conica. Pellet per centrifugazione per 5 min a 125 xg ed RT. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet con pre-riscaldato a 37 ° C collagenasi tipo I contenente 1% deossiribonucleasi I (DNAsi I). Incubare a 37 ° C per 2 hper la digestione.
  3. Aggiungere 5 ml di pre-riscaldato a 37 ° C lavare medio e centrifugare per 5 min a 125 xg ed RT. Eliminare il surnatante. Risospendere il pellet con 2 ml di soluzione di tripsina / acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e incubare a 37 ° C per 5 min.
  4. Aggiungere 1 ml di mezzo di arresto contenente 3% (v / v) DNasi I.
  5. Inserire un ago 20 G (0,9 mm) ad una siringa da 5 ml e passare la sospensione attraverso EB 3-5 volte.
  6. Aggiungere 7 ml di mezzo di lavaggio e centrifugare a 280 xg per 5 min. Eliminare il surnatante. Risospendere il pellet in mezzo (IMDM) Iscove modificato da Dulbecco e memorizzare sul ghiaccio. Determinare il numero di cellule con un emocitometro. Prendere 0,5 x 10 6 cellule e pellet mediante centrifugazione a 280 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante.
  7. Pre-raffreddare tutti i componenti del gel su ghiaccio prima di loro miscelazione in una provetta sterile. Miscelare i seguenti componenti del gel di collagene (concentrazione finale): 2,1 mg / mL tipo coda di ratto collagene I, 24,9 mM glucosio, 23,8 mM NaHCO 3, 14,3 mM NaOH, 10 mM HEPES, e il 10% della matrice extracellulare in mezzo 1x M199. Aggiungere il collagene e la matrice extracellulare scorso. Mescolare pipettando su e giù.
  8. Risospendere 0,5 x 10 6 cellule con 3,5 ml di gel di collagene e mescolare bene.
  9. Utilizzare un puntale P10 aggiungere 4 ml di sospensione cellulare nel canale di 0,5 cm di lunghezza (Figura 1B-II). Regolare la posizione della sutura con pinza sterile se necessario.
  10. Coprire il fondo del piatto Petri sterile con tampone fosfato salino (PBS), facendo attenzione a non toccare il gel. Incubare a 37 ° C per 30 min.
  11. Sostituire la PBS con 12 ml di terreno di coltura (per esempio, stelo pro o terreno raccomandato dal produttore di celle), sufficienti a coprire le cellule (Figura 1B-III). Cultura in un incubatore a 37 ° C per 1 settimana. Cambiare il mezzo di ogni altro giorno.

4. La stimolazione elettrica per BIOWIRE coltivazione

  1. InBSC, aggiungere 2 ml di PBS a ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti che ospiterà una camera stimolatore elettrico. Utilizzare pinzette sterili per posizionare delicatamente il dispositivo di stimolazione elettrica autoclavato nel pozzo. Eliminare il PBS dal pozzo.
  2. Coprire le barre di carbonio con 5 ml di terreno di coltura pre-riscaldato. Utilizzare pinzette sterili per montare i biowires nella camera di stimolazione elettrica e orientarli perpendicolari alle barre di carbonio (Figura 2).
  3. Posizionare il coperchio sulla parte superiore della piastra di sei pozzetti, ma lascia fili di platino sufficienti raggiungono all'esterno della piastra di connettersi con lo stimolatore elettrico. Posizionare la piastra sei pozzetti in un incubatore di coltura cellulare a 37 ° C e collegare il filo di platino allo stimolatore elettrico.
  4. Stimolare i biowires utilizzando uno stimolatore elettrico con le seguenti impostazioni: bifasica impulso ripetizione, durata dell'impulso 1-ms, 3 V / cm, e 1 impulso al secondo (PPS). Sollevare il PPS ogni 24 ore per i seguenti valori: 1.83, 2.66, 3.49, 40,82, 5,15 e 6. Cambiare il mezzo di ogni altro giorno.
  5. Osservare la contrattilità cardiomiociti in risposta alla stimolazione elettrica sotto un microscopio a ingrandimento 10X.
    NOTA: Dopo una settimana di stimolazione, i biowires diventa maturo (vedere la sezione risultati).

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Risultati

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Il razionale per l'uso di una sutura nelle biowires è servire come stampo per la formazione di costrutti 3D che si allineano in un asse e imitano la forma di fibre cardiache. Abbiamo dimostrato che dopo sette giorni di coltura in BIOWIRE, cellule rimodellato il gel intorno la sutura (Figura 3A). Le celle assemblate lungo l'asse della sutura per formare in linea di tessuto cardiaco (Figura 3). Dopo 7 giorni di precoltura, i biowires sono stati sottoposti ...

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Discussione

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Questo manoscritto descrive la configurazione e implementazione della piattaforma progettata, BIOWIRE, per migliorare la maturazione di HPSC-CM. Il dispositivo può essere realizzato in impianti di microfabbricazione standard e biowires può essere prodotto con tecniche di coltura cellulare comuni e uno stimolatore elettrico.

A nostra conoscenza, non esiste un metodo simile a quello riportato biowires. Questa strategia rivela che il miglioramento delle proprietà di maturazione sono dipendenti ...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione-in-aiuto del Heart and Stroke Foundation of Canada (G-14-0.006.265), sovvenzioni di funzionamento dal Canadian Institutes of Health Research (137.352 e 143.066), e una borsa di studio fondazione JP Bickell (1.013.821 ) al SSN.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Acido L-ascorbicoSigmaA-4544hPSC-CM terreno di coltura componente
AutoCADAutodesk, IncSoftware per la progettazione del dispositivo
Barre di carbonio, Ø 3 mmComponente della camera di stimolazione elettrica
Collagene, tipo 1, coda di topoBD Biosciences354249Gel di collagene: 2,1 mg/mL di collagene di coda di ratto di tipo I in 24,9 mM di glucosio, 23,8 mM di NaHCO3, 14,3 mM di NaOH, 10 mM di HEPES, in 1 terreno M199 con il 10% di Matrigel ridotto del fattore di crescita.
Collagenasi di tipo ISigmaC01300,2% collagenasi tipo I (p/v) e 20% FBS (v/v) in PBS con Ca2+ e Mg2+. Sterilizzare con 0,22 μ m e fare aliquote da 12 mL. Conservare a -20 °C.
Deossiribonucleasi I (DNasi I)EMD Millipore260913-25MUProdurre 1 mg/mL di DNasi I soluzione madre in acqua. Filtrare in modo sterile e conservare aliquote da 0,5 mL a &meno; 20 ° C
Trapano e punte (Ø 1 mm e 2 mm)DremelFori nei telai in policarbonato
Stimolatore elettricoErbas88x
Siero fetale bovino (FBS)WISENT Inc.080-450
D-(+)-Glucosio SigmaG5767Componente in gel di collagene
L-GlutamminaThermo Fisher Scientific25030081
H2OMilliQ18.2 MΩ &punto medio; cm a 25 gradi C, ultrapuro, per rendere tutte le soluzioni
HEPESSigmaH4034Componente in gel di collagene
Piastra riscaldanteTorrey PinesHS40
Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM)Thermo Fisher Scientific12440053
Allineatore per mascheraEVG EVG 620
Matrigel, fattore di crescita ridotto Corning354230Componente in gel di collagene
Medium 199 (M199)Thermo Fisher Scientific11825015Componente in gel di collagene
Monotioglicerolo (MTG)SigmaM-6145hPSC-CM
Agitatore orbitaleVWR89032-088
Penicillina/Streptomicina (P/S)Thermo Fisher Scientific15070063
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con Ca2+ e Mg2+ Thermo Fisher Scientific14040133
Piastra (6 pozzetti)PiastraCorning 353046
(6 pozzetti), attacco bassoFili di platino Corning3471
, 0,2 mmComponente della camera dello stimolatore elettrico
Polidimetilsilossano (PDMS)Dow CorningSylgard 184
Glicole propilenico monometil etere acetato (PGMEA)Doe & Ingalls Inc.Per sviluppare la busta per wafer
, convertitori a strappo92308per la sterilizzazione a vapore
Wafer di silicone, 4 polliciUniversityWafer Inc.
Bicarbonato di sodio (NaHCO3)SigmaS5761Componente in gel di collagene
Idrossido di sodioSigmaS8045Componente in gel di collagene
Sprin coaterSistemi di rivestimento specialiG3P-8
StemPro-34 terreno di colturaThermo Fisher Scientific10639011Terreno di coltura hPSC-CM. Per fare 50 ml, aggiungere 1,3 ml di supplemento, 500 μ L di 100&volte; L-Glutammina, 250 μ L di 30 mg/mL di transferrina, 500 μ l di 5 mg/mL di acido ascorbico, 150 μ L di 26 μ l /2 mL di monotioglicerolo (MTG) e 500 μ L (1 %) penicillina/streptomicina.
di arresto: FBS (1:1)
SU-8 50 MicroChem Corp.fotoresist, componente principale
SU-8 2050 MicroChem Corp.fotoresist, componente principale
TransferrinaRoche10-652-202hPSC-CM terreno di coltura
composto Tripsina/EDTA, 0,25%Thermo Fisher Scientific25200056hPSC-CM terreno di coltura composto
TerrenoIMDM contenente l'1% di penicillina/streptomicina
Componente per terreni di coltura Mezzi di lavaggio

Riferimenti

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