Preparazione del cromosoma meiotico si diffonde da Mouse spermatociti

Sommario

Meiosi sono il processo di sviluppo da cui i gameti sono formate attraverso un singolo ciclo di replicazione del DNA e due successivi turni di segregazione del cromosoma. Meiosi mammiferi possono essere esaminate utilizzando una tecnica per preparare cromosomici meiotica. Qui, noi dimostrare un metodo di preparazione di superficie-diffusione nuclei da spermatociti di mouse.

Abstract

Meiosi nei mammiferi sono un processo di sviluppo dinamico che si verifica nelle cellule germinali e possa essere studiato e caratterizzato. Utilizzando un metodo per diffondere i nuclei sulla superficie delle diapositive (piuttosto che farli cadere da un'altezza), dimostriamo una tecnica ottimizzata su spermatociti del mouse che è stato descritto nel 1997. Questo metodo è ampiamente usato nei laboratori per lo studio dei mammiferi meiosi perché produce una pletora di nuclei di alta qualità in fase di sottostadi della profase I. seminiferi tubuli si inserisce in una soluzione ipotonica a gonfiarsi spermatociti. Poi spermatociti vengono rilasciati in una soluzione di saccarosio per creare una sospensione cellulare e i nuclei sono sparsi su vetrini imbevuta di fissativo. A seguito di immunostaining, può essere esaminata una diversità delle proteine attinente a processi meiotici. Ad esempio, proteine del complesso synaptonemal, una struttura tripartita che collega i cromosoma assi e nuclei degli omologhi insieme possono essere facilmente visualizzate. Proteine di ricombinazione meiotic, che sono coinvolti nella riparazione di rotture a doppio filamento del DNA tramite la ricombinazione omologa, possono anche essere immunostained per valutare la progressione della Profase I. Qui descriviamo e dimostrare dettagliatamente una tecnica ampiamente utilizzata per lo studio dei mammiferi meiosi in spermatociti da topo maschio giovanile o adulta.

Introduzione

Topi sono utilizzati estesamente come organismo modello per lo studio di meiosi nei mammiferi. Possono essere valutati sia i normali processi di sviluppo e difetti che si verificano durante la meiosi. La linea temporale e la progressione delle caratteristiche salienti che si verificano durante la profase I e sottostadi, come pure una moltitudine di specifiche proteine coinvolte in processi cruciali per la regolazione della meiosi può essere caratterizzati in wild type e topi mutanti. Diversi processi specializzati che si verificano durante la meiosi che ho posso essere studiato in dettaglio (rivisto in Handel e Schimenti¹). Questi includono la formazione di rotture a doppio filamento (DSB) del DNA e riparazione, ricombinazione, la formazione di Complesso Sinaptonemale e segregazione del cromosoma.

Un aspetto importante di studiare processi meiotici è la capacità di esaminare i nuclei contenenti cromosomi omologhi sono risolti, visivamente e otticamente, per meglio distinguono e identificano i sottostadi della profase I. profase è composto da 5 sottostadi che sono caratterizzati da specifiche caratteristiche tra cui la formazione del complesso synaptonemal (SC). Lo SC è un'impalcatura di proteina tripartita che consente l'accoppiamento e la riparazione di rotture a doppio filamento del DNA degli omologhi. Durante leptonema, omologhi allineare come gli elementi assiali di SC sono fissati. Quindi allegato di elementi centrali del complesso synaptonemal durante zygonema facilita la connessione fisica e accoppiamento (sinapsi) tra coppie di omologhi di. Durante pachynema, sinapsi degli omologhi diventa completo e crossover di DNA sono formate dalla riparazione di una popolazione di seleziona delle rotture del doppio filamento di DNA tramite ricombinazione omologa. La SC Disassembla durante diplonema, permettendo per omologhi di desynapse ma rimangono attaccati ai loro centromeri ed ai luoghi dei crossover di DNA. Infine durante diacinesi, omologhi ricondenseranno e si verifica la transizione alla metafase¹.

Storicamente, superficie-diffusione della cromatina meiotica ha reso alcuni nuclei, particolarmente quelle dalle prime fasi della Profase I². Di conseguenza, questi metodi sono stati modificati per migliorare la separazione delle cellule dai tessuti (cioè testicolo o dell'ovaio), la tecnica di diffusione della cromatina meiotica e la resa dei nuclei meiotic di alta qualità per valutazione^{2,3, 4}. Inoltre, questo metodo si è rivelato utile nel preservare nucleare e cromatina associata proteine nei nuclei meiotici, come dimostrato da immunolocalizzazione pubblicati tecniche^5,6,7. Di conseguenza, il metodo inizialmente descritto da Peters² e dimostrato qui rese molti nuclei di spermatocita scoppio separata contenente gli omologhi che subiscono i sottostadi leptotene, zigotene, pachitene, diplotene e diacinesi della Profase I.

La tecnica della preparazione di superficie-diffusione nuclei (chiamati anche analisi di diffusione della cromatina) è ampiamente usata per lo studio di meiosi nei campi della biologia riproduttiva e cella. Diapositive che contengono i nuclei superficie-diffusione possono essere successivamente immunostained con gli anticorpi alle proteine di interesse o sottoposti a macchiatura d'argento e poi analizzati con microscopia. Il metodo è simile per i topi maschi e femminili, anche se le modifiche sono state descritte per topi femmina². È fondamentale non overmince tubuli seminiferi. I nuclei devono anche essere ben distribuiti affinché seguendo immunostaining omologhi e proteine associate sono chiaramente visibili con la microscopia. Superficie-diffusione nuclei possono essere preparati in poche ore ed entrambi immunostained immediatamente o conservati a-80 ° C per un massimo di 3 settimane prima di scongelamento e immunostaining. Tuttavia, risultati ottimali si ottengono migliori per alcune proteine se immunostaining viene eseguita immediatamente o entro 2 settimane di preparazione di superficie-diffusione nuclei. I vetrini possono essere immunostained con un protocollo standard usando gli anticorpi alle proteine di interesse, seguita da incubazione con gli anticorpi secondari coniugati a fluorescente proteine o coloranti, allora imaged con microscopia di fluorescenza⁸. Al giorno postnatale 15-21 c'è tessuto sufficiente per ogni coppia di tipo selvaggio testicoli per produrre 6-10 diapositive e più vecchi topi (compresi gli adulti) produrrà più diapositive. Tuttavia, topi wild type 6 settimane di età ed oltre anche resa più post-meiotiche cellule (cioè spermatidi) sui vetrini seguendo immunostaining. Inoltre, tutti i sottostadi della profase io posso essere osservato in topi giovanili e adulti. Testicoli da maschi a giorni postnatali 10 a 15 produrrà molti più cellule leptotene e zigotene. Topi oltre postnatale giorno 14 a 15 anni di età produrrà più nuclei di pachitene e diplotene.

Qui descriviamo e dimostrare un metodo ampiamente usato della preparazione di superficie-diffusione nuclei da spermatociti di mouse.

Protocollo

Tutti i metodi che coinvolgono topi utilizzati alti standard etici e benessere e sono stati approvati dal comitato di uso al Drexel University College of Medicine e istituzionali Animal Care.

1. preparazione di soluzioni e strumenti necessari

1. Preparare il tampone di estrazione ipotonico (EB) in 50 mL di acqua ultrapura laboratorio grado, pH 8,2-8,4 (tabella 1). Rendono la soluzione fresco ogni volta, tenere sul ghiaccio ed utilizzare entro 2 h di preparazione spread; Ciò è necessario per ottimizzare la riduzione e la proteasi inibendo attività di DTT e PMSF, rispettivamente. Utilizzare 10 mL di EB per ogni coppia di testicoli del topo.
2. Preparare una soluzione di saccarosio di 100mm (fresco ogni volta) aggiungendo 0,342 g di saccarosio a 10 mL di laboratorio ultrapura acqua di grado. Aggiustare il pH a 8.2
3. Preparare soluzione fissante (1% paraformaldeide (PFA), 0,15% Triton X-100, pH regolato a 9,2 con 1 N HCl o NaOH N 1) mensile fresco e store è a temperatura ambiente al riparo dalla luce. Diluire un 16% commercialmente PFA partenza stock disponibile al 4% in 1X PBS per uso come un magazzino di lavoro e quindi memorizzare 4% aliquote a-20 ° C.
   1. Per preparare la soluzione fissante, aggiungere 10 mL di soluzione al 4% PFA e 600 µ l di 10% Triton X-100 a 30 mL di 1X PBS, mescolare bene e regolare il pH a 9,2 con 1 N HCl o NaOH N 1. Conservare la soluzione fissativa in una provetta conica da 50 mL avvolta nella carta stagnola a temperatura ambiente (per non più di 4 settimane).
4. Preparare soluzioni di lavaggio (mentre scivoli stanno asciugando gli ultimi 30 minuti) con 200 Photo-Flo: 0,4% Photo-Flo 200/PBS (320 µ l di Photo-Flo 200 in 80 mL di 1X PBS) e 0,4% Photo-Flo 200/dH₂O (160 µ l di Photo-Flo 200 in 40 mL di acqua ultrapura laboratorio). Utilizzare una finestra di Coplin 50 mL riempita con 40 mL di soluzioni per lavare i vetrini 10 o meno in un momento.
5. Preparare i seguenti strumenti: 1 paio di forbici chirurgiche (di incidere la pelle), 1 paio di forbici chirurgiche punta fine (di incidere il peritoneo), 2 paia di pinze a punta dritto fine (per sezionare ogni testicolo), 1 lama di rasoio regolo (di incidere ogni testicolo), 2 paia di punta forcipe (per immobilizzare ogni testicolo e spremere i tubuli seminiferi) curvo, barattoli di Coplin 50ml, Teflon stampato 3 anello scivoli, 1 bisturi con lama taglia 11, camera umidificata, 100 x 15 mm piastre Petri, pennarello a punta fine o una matita e un shaker a piattaforma rotante.
   1. Premium posto uncharged vetrino smerigliato fine diapositive di vetro in posizione verticale in una vaschetta di Coplin 50 mL riempita con soluzione fissante fino all'utilizzo.
      Nota: La matita è comodo se diapositive verranno successivamente utilizzate nelle procedure che richiedono di etanolo, come l'ibridazione in situ di fluorescenza.

2. i nuclei di spermatocita diffusione

1. Eutanasia di un topo maschio secondo le linee guida istituzionali (ad es., dislocazione cervicale con o senza CO₂ asfissia).
2. Utilizzare P10 - P20 maschi per valutare meiotiche celle nella prima ondata della spermatogenesi; Utilizziamo abitualmente P15 - P17 maschi per ottenere cellule da tutti i sottostadi della Profase I. adulti testicoli fornirà cellule da Profase I troppo, ma anche essi produrranno più postmeiotiche cellule, quali spermatidi.
3. Raccolto e pesare i testicoli (registrare i pesi associati); quindi inserirli in una piastra Petri contenente poche gocce di freddo HEB per tenerli umidi.
4. Tenere testicolo contro il fondo del piatto con una pinza a punta ricurva e utilizzare una lama di rasoio regolo per fare un'incisione del midline verticale piccolo attraverso la capsula del testicolo. Mentre ancora in mano il testicolo contro il fondo del piatto con un forcipe, utilizzare un secondo set di pinze punta ricurva o lama di rasoio regolo per spremere delicatamente i tubuli seminiferi dal testicolo.
   1. Inserire i tubuli in una provetta conica da 15 mL contenente 10 mL di HEB freddo, avendo cura di evitare di mettere i pezzi della capsula nel tubo. Ripetere la procedura con il secondo testicolo.
5. Incubare i tubuli seminiferi decapsulato nel tubo conico contenente HEB in ghiaccio per 30-60 min, a seconda delle dimensioni dei testicoli. Incubare i tubuli seminiferi da un paio di testicoli pesa 30 mg o meno per 30 min, tubuli da un paio di testicoli pesatura 31 a 50 mg per 30-45 minuti e testicoli più grandi per 60 minuti. Non alterare i tempi per un solo testicolo.
   Nota: Il tempo di incubazione ottimali può variare a seconda dell'esperienza di sperimentatore, i reagenti utilizzati e i topi analizzati.
6. Mentre i tubuli seminiferous sono incubando in EB, è possibile utilizzare un pennarello o una matita per etichettare le estremità glassate di vetrino diapositive con mouse numero, data e numero della diapositiva. Quindi è possibile porre i vetrini pre-puliti in una vaschetta di Coplin contenente la soluzione fissante.
7. A seguito di incubazione, versare tubuli ed EB in una capsula Petri pulita e tubuli separate in circa ciuffi di diametro di 3 mm. Ogni ciuffo produce 2 scivoli e il numero di diapositive ha reso dipende dalla dimensione dei testicoli.
   Nota: Possiamo ottenere 8 scivoli da wild-type e 6 diapositive da subfertile Chtf18-null testicoli P16 (che sono più piccoli a causa di numeri in diminuzione delle cellule di germe meiotica e mitotica⁸). Un testicolo adulto pesa 100 mg o più dovrebbe produrre 16 vetrini.
8. Posto 23 µ l di soluzione di saccarosio di 100 mM in un anello di Teflon stampato, 3 anello scorrevole e aggiungere un ciuffo di tubuli seminiferi sul ring.  Quindi usando curve suggerimento pinze per tenere il ciuffo, delicatamente tritare i tubuli con una lama di rasoio taglia 11 fino a quando la soluzione diventa torbida.
   Nota: Non overmince come questo si tradurrà in cromosomi frammentati. Si noti che cromosomi frammentati potrebbero anche essere indicativi di un fenotipo mutante.
9. Rimuovere i detriti, aggiungere un altro 23 µ l di soluzione di saccarosio e utilizzare una micropipetta delicatamente dispensazione la miscela su e giù un paio di volte per aiutare a separare le cellule in sospensione.
10. Rimuovere un vetrino ammollo nel Vaso Coplin contenente soluzione fissante e inclinare la diapositiva sopra il vaso, in modo che una gocciolina generosa raccoglie nell'angolo inferiore della diapositiva.
    1. Pipettare 20 µ l di sospensione cellulare saccarosio dall'anello della diapositiva stampata 3 anello Teflon in fissativa gocciolina su un premio glassato di vetrino e dispensare la sospensione su e giù per 2 - 3 volte.
       Nota: La goccia fissativa deve essere abbastanza grande nel volume affinché aggiunta di 20 μL della sospensione delle cellule di saccarosio ad esso permette la copertura attraverso l'intera diapositiva quando la miscela è diffuso (Vedi 2.11 qui sotto).
11. Lentamente inclinare la diapositiva al lato opposto la goccia per diffondere la sospensione cellulare lungo la lunghezza della diapositiva. Poi lentamente inclinare la diapositiva torna a diffondere la sospensione cellulare lungo la larghezza della diapositiva per coprirlo completamente. Evitare di diffondere la sospensione sulla stessa area della diapositiva più di una volta altrimenti che le celle si sovrappongono tra loro.
12. Immediatamente porre il vetrino in una camera umidificata e ripetere i passaggi da 2.8 a 2.11 fino a quando tutti i grumi di tubuli seminiferi sono stati utilizzati per rendere diapositive. È importante non spostare la camera umidificata durante il processo di essiccazione per evitare lo strappo e la sovrapposizione di cellule.
13. Lasciare i vetrini Incubare in una camera umidificata coperta a temperatura ambiente per 2,5 h in modo che si asciugano lentamente e non completamente. Umidità elevata e lenta essiccazione in questo passaggio sono importanti per garantire un'adeguata diffusione della cromatina. Quindi rimuovere il coperchio dell'alloggiamento e vetrini asciugare completamente altri 30 min.
14. Mettere i vetrini (retro o in un modello di zigzag) in una vaschetta di Coplin contenente 0,4% di soluzione di Photo-Flo 200/1 X PBS e lavare i vetrini due volte, 5 minuti ciascuno, agitando delicatamente la Coplin jar su una piattaforma rotante shaker. Utilizzare la soluzione fresca per ogni lavaggio e mantenere diapositive da diversi topi in vasi separati per ciascuno dei lavaggi.
15. Lavare i vetrini in una vaschetta di Coplin contenenti 0,4% Photo-Flo 200/dH2O soluzione per 5 min una volta durante l'agitazione.
16. Rimuovere diapositive dal Coplin jar (ultimo lavaggio), accuratamente pulire i bordi e le parti inferiori delle diapositive per eliminare il liquido in eccesso e mettere i vetrini in una posizione angolata, quasi-montante ad asciugare. Uno sperimentatore che è abile in questa tecnica può elaborare e preparare i nuclei superficie-diffusione dai topi di 4 o 5 in un giorno.
17. Una volta asciutto (15-20 min), processo diapositive immediatamente per immunofluorescenza o conservare a-80 ° C in una scatola di diapositive ben chiuso al riparo dalla luce per un massimo di 3 settimane (a seconda delle proteine bersaglio valutandi; risultati ottimali possono essere ottenuti se macchiato lo stesso giorno o entro 2 settimane).
    1. Se conservati a-80 ° C, quindi lasciare vetrini a temperatura ambiente e lavare in una vaschetta di Coplin contenente 1 X PBS o blocco per 5 min prima della colorazione.
       Nota: Molti protocolli di colorazione di immunofluorescenza diversi fornirà buoni risultati; per un protocollo di immunostaining⁸, fare riferimento a Berkowitz et al.

Risultati

La capacità di questo metodo per fornire un numero elevato di superficie sviluppa nuclei che contengono gli omologhi intatti dipende da tre fattori principali: 1) tempo di incubazione appropriato di tubuli seminiferi in buffer ipotonico (cioè EB) per ottenere adeguatamente si gonfiò spermatocita i nuclei che scoppiano ma non si disintegrano da prolungata incubazione in EB, 2) micropipetting le goccioline di saccarosio di cellule per ottenere una sospensione separata dei nuclei che non son...

Discussione

Per ottenere un numero elevato di nuclei spermatocita ben diffusa, di buona qualità, le fasi più critiche del presente protocollo includono il tempo di incubazione appropriato dei tubuli seminiferi in EB, appropriata macinazione dei tubuli seminiferi, e la tecnica impiegata per si sono diffuse la sospensione cellulare di saccarosio attraverso le diapositive rivestite con fissativa. Noi incubare tubuli seminiferi dai testicoli dei maschi di tipo selvaggio che vanno da postnatale giorno 15 all'età adulta in EB per 45 min, ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Photo-Flo 200	Kodak	1464510
16% Paraformaldeide (soluzione acquosa di formaldeide)	Microscopia elettronica RT	15710	Diluire la soluzione al 16% in stock di lavoro al 4% con aliquote 1X PBS e congelare a -20 ° C
Vetrini a 3 anelli stampati in teflon Microscopia	elettronica Scienze	63418-11
Vetrini terminali in vetro smerigliato non caricati di alta qualità Diverse	marche		Pulire i vetrini in alcool etilico o isopropilico e lasciarli sgocciolare prima dell'uso; etichettare i vetrini sull'estremità smerigliata con un pennarello indelebile o una matita a seconda dell'uso successivo dei vetrini
Forbici chirurgiche (punte affilate e smussate)	scienze	14001-12	Funzioneranno marche diverse di un tipo simile
Forbici chirurgiche a punta fine (punte affilate)	Strumenti per le scienze	14058-11	Funzioneranno marche diverse di un tipo simile
Pinze a punta fine dritte	Strumenti per le scienze fini	11050-10	Funzioneranno marche diverse di un tipo simile
Pinze curve a punta media	Fisher	16100110	Funzioneranno
marche diverse di un tipo simileManico del bisturi	Fine Science Tools	10003-12	Funzionerà una marca diversa di tipo simile
Topo anti-SYCP3	Abcam	ab97672	Uso in scala 1:300
Proteina anti-centromero (derivata dal siero umano del paziente CREST)	Anticorpi incorporati	15-234-0001	Uso in scala 1:50
Camera			Utilizziamo piastre di coltura quadrate Nunc da 500 cm2/pozzetto con carta inumidita asciugamani
Microscopio a campo largo con epifluorescenza	Microsistemi		Qualsiasi modello standard
Barattoli Coplin Diverse	marche		Capacità di 50 ml; diametro di 40 mm (1,6 pollici), contiene 10 vetrini (schiena contro schiena)
Piastre di Petri	Diverse marche		100 x 15 mm di diametro, polistirene sterile non trattato

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