Meiosi sono il processo di sviluppo da cui i gameti sono formate attraverso un singolo ciclo di replicazione del DNA e due successivi turni di segregazione del cromosoma. Meiosi mammiferi possono essere esaminate utilizzando una tecnica per preparare cromosomici meiotica. Qui, noi dimostrare un metodo di preparazione di superficie-diffusione nuclei da spermatociti di mouse.
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Articolo metodologico
Preparazione del cromosoma meiotico si diffonde da Mouse spermatociti
In questo articolo
Sommario
Abstract
Meiosi nei mammiferi sono un processo di sviluppo dinamico che si verifica nelle cellule germinali e possa essere studiato e caratterizzato. Utilizzando un metodo per diffondere i nuclei sulla superficie delle diapositive (piuttosto che farli cadere da un'altezza), dimostriamo una tecnica ottimizzata su spermatociti del mouse che è stato descritto nel 1997. Questo metodo è ampiamente usato nei laboratori per lo studio dei mammiferi meiosi perché produce una pletora di nuclei di alta qualità in fase di sottostadi della profase I. seminiferi tubuli si inserisce in una soluzione ipotonica a gonfiarsi spermatociti. Poi spermatociti vengono rilasciati in una soluzione di saccarosio per creare una sospensione cellulare e i nuclei sono sparsi su vetrini imbevuta di fissativo. A seguito di immunostaining, può essere esaminata una diversità delle proteine attinente a processi meiotici. Ad esempio, proteine del complesso synaptonemal, una struttura tripartita che collega i cromosoma assi e nuclei degli omologhi insieme possono essere facilmente visualizzate. Proteine di ricombinazione meiotic, che sono coinvolti nella riparazione di rotture a doppio filamento del DNA tramite la ricombinazione omologa, possono anche essere immunostained per valutare la progressione della Profase I. Qui descriviamo e dimostrare dettagliatamente una tecnica ampiamente utilizzata per lo studio dei mammiferi meiosi in spermatociti da topo maschio giovanile o adulta.
Introduzione
Topi sono utilizzati estesamente come organismo modello per lo studio di meiosi nei mammiferi. Possono essere valutati sia i normali processi di sviluppo e difetti che si verificano durante la meiosi. La linea temporale e la progressione delle caratteristiche salienti che si verificano durante la profase I e sottostadi, come pure una moltitudine di specifiche proteine coinvolte in processi cruciali per la regolazione della meiosi può essere caratterizzati in wild type e topi mutanti. Diversi processi specializzati che si verificano durante la meiosi che ho posso essere studiato in dettaglio (rivisto in Handel e Schimenti1). Questi includono la ....
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Protocollo
Tutti i metodi che coinvolgono topi utilizzati alti standard etici e benessere e sono stati approvati dal comitato di uso al Drexel University College of Medicine e istituzionali Animal Care.
1. preparazione di soluzioni e strumenti necessari
- Preparare il tampone di estrazione ipotonico (EB) in 50 mL di acqua ultrapura laboratorio grado, pH 8,2-8,4 (tabella 1). Rendono la soluzione fresco ogni volta, tenere sul ghiaccio ed utilizzare entro 2 h di preparazione spread; Ciò è necessario per ottimizzare la riduzione e la proteasi inibendo attività di DTT e PMSF, rispettivamente. Utilizzare 10 mL di EB per ogni coppia di testicoli del ....
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Risultati
La capacità di questo metodo per fornire un numero elevato di superficie sviluppa nuclei che contengono gli omologhi intatti dipende da tre fattori principali: 1) tempo di incubazione appropriato di tubuli seminiferi in buffer ipotonico (cioè EB) per ottenere adeguatamente si gonfiò spermatocita i nuclei che scoppiano ma non si disintegrano da prolungata incubazione in EB, 2) micropipetting le goccioline di saccarosio di cellule per ottenere una sospensione separata dei nuclei che non son.......
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Discussione
Per ottenere un numero elevato di nuclei spermatocita ben diffusa, di buona qualità, le fasi più critiche del presente protocollo includono il tempo di incubazione appropriato dei tubuli seminiferi in EB, appropriata macinazione dei tubuli seminiferi, e la tecnica impiegata per si sono diffuse la sospensione cellulare di saccarosio attraverso le diapositive rivestite con fissativa. Noi incubare tubuli seminiferi dai testicoli dei maschi di tipo selvaggio che vanno da postnatale giorno 15 all'età adulta in EB per 45 min, .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori riconoscono l'assistenza tecnica di Abigail Harris. Essi riconoscono anche Paula Cohen e Kim Holloway per aiutare ad ottimizzare il protocollo di preparazione di superficie-diffusione nuclei da spermatociti di mouse. Gli autori hanno anche apprezzano la lettura critica del manoscritto da Karen Schindler.
Questo lavoro è stato supportato da NIH R01 GM106262 a K.M.B.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Photo-Flo 200 | Kodak | 1464510 | |
| 16% Paraformaldeide (soluzione acquosa di formaldeide) | Microscopia elettronica RT | 15710 | Diluire la soluzione al 16% in stock di lavoro al 4% con aliquote 1X PBS e congelare a -20 ° C |
| Vetrini a 3 anelli stampati in teflon Microscopia | elettronica Scienze | 63418-11 | |
| Vetrini terminali in vetro smerigliato non caricati di alta qualità Diverse | marche | Pulire i vetrini in alcool etilico o isopropilico e lasciarli sgocciolare prima dell'uso; etichettare i vetrini sull'estremità smerigliata con un pennarello indelebile o una matita a seconda dell'uso successivo dei vetrini | |
| Forbici chirurgiche (punte affilate e smussate) | scienze | 14001-12 | Funzioneranno marche diverse di un tipo simile |
| Forbici chirurgiche a punta fine (punte affilate) | Strumenti per le scienze | 14058-11 | Funzioneranno marche diverse di un tipo simile |
| Pinze a punta fine dritte | Strumenti per le scienze fini | 11050-10 | Funzioneranno marche diverse di un tipo simile |
| Pinze curve a punta media | Fisher | 16100110 | Funzioneranno |
| marche diverse di un tipo simileManico del bisturi | Fine Science Tools | 10003-12 | Funzionerà una marca diversa di tipo simile |
| Topo anti-SYCP3 | Abcam | ab97672 | Uso in scala 1:300 |
| Proteina anti-centromero (derivata dal siero umano del paziente CREST) | Anticorpi incorporati | 15-234-0001 | Uso in scala 1:50 |
| Camera | Utilizziamo piastre di coltura quadrate Nunc da 500 cm2/pozzetto con carta inumidita asciugamani | ||
| Microscopio a campo largo con epifluorescenza | Microsistemi | Qualsiasi modello standard | |
| Barattoli Coplin Diverse | marche | Capacità di 50 ml; diametro di 40 mm (1,6 pollici), contiene 10 vetrini (schiena contro schiena) | |
| Piastre di Petri | Diverse marche | 100 x 15 mm di diametro, polistirene sterile non trattato |
Riferimenti
- Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).
- Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spre....
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Ristampe e permessi
