Un metodo semplice ma efficace che si avvale di nanoparticelle magnetiche per rilevare e arricchire le cellule B antigene-reattiva per l'analisi funzionale e fenotipica è descritto.
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Articolo metodologico
Rilevamento e l'arricchimento di Rare antigene-specifiche cellule B per l'analisi del fenotipo e funzione
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule B reattive con un antigene specifico di solito si verificano con una frequenza del <0,05% dei linfociti. Per decenni, i ricercatori hanno cercato metodi per isolare e arricchire queste cellule rare per studi sul loro fenotipo e biologia. Gli approcci si basano inevitabilmente sul principio che le cellule B riconoscono l'antigene nativo in virtù di recettori di superficie cellulare che sono rappresentativi in specificità degli anticorpi che verranno eventualmente secreti dalle loro figlie differenziate. Forse l'approccio più ovvio al problema prevede l'uso di antigeni coniugati con fluorocromo in combinazione con la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS). Tuttavia, l'utilità di questi metodi è limitata dalla frequenza delle celle e dal tasso raggiungibile di analisi e isolamento mediante smistamento elettronico. Viene descritto un nuovo metodo per arricchire rare cellule B antigene-specifiche utilizzando nanoparticelle magnetiche che si traduce in un arricchimento ad alta resa di cellule B reattive all'antigene da grandi popolazioni di cellule iniziali. Questo metodo consente un migliore monitoraggio del fenotipo e della biologia delle cellule reattive all'antigene prima e dopo l'incontro con l'antigene in vivo, ad esempio dopo l'immunizzazione o durante lo sviluppo dell'autoimmunità.
Introduzione
Diluizione limite analisi di frequenza precursore cellule che secernono anticorpi hanno suggerito che le cellule B reattive ad un particolare antigene tipicamente si verificano ad una frequenza da 0,05 a 0,005% nel repertorio normale, a seconda dello stato di vaccinazione e dimensione / numero di epitopi presenti sul antigene. La bassa frequenza di queste cellule ha reso difficile per studiare i cambiamenti della loro situazione durante lo sviluppo di risposte immunitarie, ad esempio dopo la vaccinazione o l'esposizione ad un antigene estraneo, o durante lo sviluppo di autoimmunità. In precedenza, i ricercatori hanno intrapreso isolamento delle cellule B antigene....
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Protocollo
1. Isolamento di PBMC umani
- Raccogliere 30-50 ml di sangue utilizzando provette per il prelievo del sangue eparinizzate.
NOTA: La quantità di sangue usato dipende dalla particolare domanda sperimentale e la frequenza nel sangue di cellule B antigene-specifiche di interesse. sangue eparinizzato può essere lavorato immediatamente o cullò dolcemente notte a temperatura ambiente per l'elaborazione del giorno successivo. Il ritardo nell'elaborazione ha poco effetto sulla efficienza di arricchimento ed è associata con una minima perdita di vitalità. - Mescolare sangue intero 1: 1 con una soluzione sterile, magnesio temperatura ambiente e c....
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Risultati
Analisi di purezza, la resa, e piegare-arricchimento mediante citometria a flusso
Popolazioni arricchite come sopra descritto inevitabilmente contenere cellule contaminanti che non sono legate colorante streptavidina far-rosso fluorescente, ma sono intrappolati nella matrice. Queste impurità possono essere rimossi da popolazioni arricchito da FACS ordinamento. Per stimare la purezza delle popolazioni arricchiti, cancello su cellu.......
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Discussione
Qui si descrive un nuovo metodo per realizzare l'isolamento e arricchimento delle cellule B antigene vincolante da sangue periferico umano. Il metodo è facilmente applicabile a topi e ad altri tessuti, come i milza e nei linfonodi, ed è compatibile con l'analisi post-arricchimento del fenotipo cellulare e funzione (manoscritto in preparazione).
L'utente deve essere a conoscenza di un certo numero di variabili che possono influenzare il successo di questa procedura. Per esperienza.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni della JDRF (1-2008-994, 27-2012-450) e del National Institutes of Health (R01DK096492-05, R21AI124488-01, T32OD012201 e F30OD021477).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Antigene di interesse | variabile | variabile Almeno 100 μ g per biotinilare facilmente; se si utilizzano proteine, provare a utilizzare proteine che sono state convalidate da ELISA. Deve essere portatore senza proteine. | |
| Biotina per l'etichettatura; es. EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotina | Thermo Scientific | 21335 | La biotina è disponibile in diverse formulazioni, come quelle contenenti distanziatori di varie lunghezze, quindi il tipo utilizzato dovrebbe essere determinato dal ricercatore |
| Streptavidin-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | S21374 | Può ottenere da altri fornitori. |
| Microsfere Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 Colonne | Miltenyi Biotech | 130-091-395 | |
| LS Separatori | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MACS Formaldeide | |||
| Diluire al 2% con PBS; opzionale se il test a valle richiede PBS su cellule vive | |||
| senza calcio e magnesio | |||
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Sangue intero in provette | |||
| Tampone FACS (PBS + 1% BSA + 0,01% sodio azide) | |||
| Tampone di separazione (PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA) | |||
| Provette | |||
| Provette | |||
| Eppendorf da 1,5 ml | |||
| Anticorpi reattivi per marcatori di superficie, blocco Fc, colorante discriminante vivo/morto, se necessario | |||
| forniture ELISPOT, se necessario |
Riferimenti
- de Wildt, R. M., et al. A new method for the analysis and production of monoclonal antibody fragments originating from single human B cells. J Immunol Methods. 207 (1), 61-67 (1997).
- Edelman, G. M., Rutishauser, U., Millette, C. F.
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Ristampe e permessi
Tag
Arricchimento mediante nanoparticelle magneticheSelezione cellulare attivata da fluorescenzaCellule mononucleate del sangue perifericoLegame con antigene biotinilatoAnticorpo coniugato con streptavidinaBlocco del recettore FcgammaCentrifugazione su gradiente di densitàSeparazione tramite colonna magneticaAntigene tossode tossico tetanico
