Rilevamento e l'arricchimento di Rare antigene-specifiche cellule B per l'analisi del fenotipo e funzione

Sommario

Un metodo semplice ma efficace che si avvale di nanoparticelle magnetiche per rilevare e arricchire le cellule B antigene-reattiva per l'analisi funzionale e fenotipica è descritto.

Abstract

Le cellule B reattive con un antigene specifico di solito si verificano con una frequenza del <0,05% dei linfociti. Per decenni, i ricercatori hanno cercato metodi per isolare e arricchire queste cellule rare per studi sul loro fenotipo e biologia. Gli approcci si basano inevitabilmente sul principio che le cellule B riconoscono l'antigene nativo in virtù di recettori di superficie cellulare che sono rappresentativi in specificità degli anticorpi che verranno eventualmente secreti dalle loro figlie differenziate. Forse l'approccio più ovvio al problema prevede l'uso di antigeni coniugati con fluorocromo in combinazione con la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS). Tuttavia, l'utilità di questi metodi è limitata dalla frequenza delle celle e dal tasso raggiungibile di analisi e isolamento mediante smistamento elettronico. Viene descritto un nuovo metodo per arricchire rare cellule B antigene-specifiche utilizzando nanoparticelle magnetiche che si traduce in un arricchimento ad alta resa di cellule B reattive all'antigene da grandi popolazioni di cellule iniziali. Questo metodo consente un migliore monitoraggio del fenotipo e della biologia delle cellule reattive all'antigene prima e dopo l'incontro con l'antigene in vivo, ad esempio dopo l'immunizzazione o durante lo sviluppo dell'autoimmunità.

Introduzione

Diluizione limite analisi di frequenza precursore cellule che secernono anticorpi hanno suggerito che le cellule B reattive ad un particolare antigene tipicamente si verificano ad una frequenza da 0,05 a 0,005% nel repertorio normale, a seconda dello stato di vaccinazione e dimensione / numero di epitopi presenti sul antigene. La bassa frequenza di queste cellule ha reso difficile per studiare i cambiamenti della loro situazione durante lo sviluppo di risposte immunitarie, ad esempio dopo la vaccinazione o l'esposizione ad un antigene estraneo, o durante lo sviluppo di autoimmunità. In precedenza, i ricercatori hanno intrapreso isolamento delle cellule B antigene-reattiva utilizzando tecniche che variano da piastre rivestite con antigene o adsorbenti colonne, per l'antigene rivestite riarmo globuli rossi, alla cella di smistamento ^{1, 2, 3, 4, 5, 6} fluorescenza attivato. though queste tecniche sono riusciti ad identificare e isolare cellule B antigene-reattiva, i risultati hanno variato in termini di resa, purezza e scalabilità. Recentemente abbiamo sviluppato un nuovo metodo per rilevare sia e arricchire rari sottopopolazioni di linfociti B utilizzando nanoparticelle magnetiche. Il metodo consente di arricchimento relativamente elevata resa e purezza da grandi popolazioni di partenza, ed è compatibile con l'analisi di risposte alla antigene. Arricchendo da popolazioni di cellule in sospensione, il metodo elimina vincoli associati con la geometria delle lastre o colonne antigene rivestite e produttività limite. Infine, poiché le cellule arricchiti rimangono associate antigene e un reporter fluorescente, possono essere ulteriormente purificati mediante FACS ordinamento. Come descritto qui abbiamo usato questo approccio per lo studio delle cellule B periferiche tetano sangue tetanico-reattiva, prima e dopo l'immunizzazione di soggetti umani, così come le cellule B autoantigenici-reattiva da soggetti con varie autoidisturbi mmune, tra cui diabete di tipo 1, malattia di Graves ', e la malattia di Hashimoto ^7. Il metodo funziona ugualmente bene in topo e umano, ed è compatibile con l'analisi di cellule B antigene-reattiva da una varietà di tessuti (manoscritto in preparazione).

Nel suo formato di base, cellule mononucleate del sangue periferico vengono prima incubate con l'antigene biotinilato con anticorpi di cella antigeni di superficie richiesti per l'analisi fenotipica. Questa fase di etichettatura è seguita da lavaggio e fissaggio, e l'aggiunta di streptavidina accoppiata al colorante rosso lontano fluorescente per il rilevamento della cellule vincolante biotinilato-antigene (Figura 1). Precedenti studi hanno identificato cellule B antigene-specifiche in modo simile, ma utilizzando antigeni direttamente coniugato ad un fluorocromo ^{8, 9, 10, 11.} Anche se questo è un degnoapproccio, l'uso di antigeni biotinilati in combinazione con streptavidina consente una maggiore amplificazione del segnale (quindi una migliore differenziazione delle cellule vincolanti e non vincolanti), in particolare quando gli antigeni sono piccole ^{12, 13, 14.} Un'ulteriore considerazione è l'uso di streptavidina invece di avidina perché streptavidina è deglicosilata, diminuendo legame non specifico. Inoltre, usiamo colorante far-rosso fluorescente come il fluorocromo a causa della sua fotostabilità, rendimento quantico (luminosità), e le sue piccole dimensioni (~ 1,3 KD). Fluorocromi proteine come ficoeritrina (~ 250 kD) e allophycocyanin (~ 105 kD) ¹⁵ non sono ottimali perché contengono potenzialmente molti epitopi antigenici. Uso di un piccolo colorante fluorescente biologico composto di un singolo epitopo, come colorante rosso lontano fluorescente, riduce la complessità della popolazione di cellule isolate.

Una volta che le cellule sono biotinilati-antigen e adsorbito lontano-rosso-colorante fluorescente-streptavidina, sono arricchiti con anti-far-rosso-fluorescenti nanoparticelle magnetiche colorante coniugato. Nanoparticelle singole non vengono rilevati dalla maggior parte dei citometri a flusso e quindi non devono essere rimossi prima di purificazione per FACS ordinamento e saggi a valle ^16. Selezione magnetico per cellule B antigene-specifiche arricchisce la popolazione di interesse, eliminando i tempi ei costi di classificare gli eventi rari usando un citometro a flusso.

Qui di seguito vi mostriamo i risultati rappresentativi di arricchimento delle cellule B-specifici tetano-tetanico un soggetto prima e sette giorni dopo tetano richiamo di immunizzazione. Abbiamo scelto questa particolare applicazione come esempio per dimostrare la capacità di questo metodo per arricchire cellule B antigene-specifiche seguenti acuta nella stimolazione vivo. Una volta accoppiato con citometria a flusso, questo metodo è in grado di arricchire e differenziare antigene-specifica naive, la memoria, ecellule plasmablast B e consente al ricercatore di seguire i cambiamenti nella loro frequenza nel corso del tempo. Inoltre, includiamo un'altra possibile test a valle, ad esempio, un saggio ELISPOT, il che dimostra che le cellule mantengono la capacità di secernere anticorpi a seguito di arricchimento. Un'altra applicazione di questo metodo potrebbe comportare il trasferimento adottivo di cellule arricchite in un ospite. Abbiamo precedentemente dimostrato cellule mantengono la capacità di agire come cellule presentanti l'antigene alle cellule T antigene-specifiche seguenti isolamento e di trasferimento (dati non riportati). Quindi, ci sono una serie di possibili saggi a valle che potrebbero essere accoppiati al metodo, che informa insieme la comprensione della risposta immunitaria antigene-specifica. Abbiamo descritto il metodo di seguito, inclusi i controlli per determinare la resa complessiva, la purezza, la specificità delle cellule, e piegare-arricchimento.

Protocollo

1. Isolamento di PBMC umani

1. Raccogliere 30-50 ml di sangue utilizzando provette per il prelievo del sangue eparinizzate.
   NOTA: La quantità di sangue usato dipende dalla particolare domanda sperimentale e la frequenza nel sangue di cellule B antigene-specifiche di interesse. sangue eparinizzato può essere lavorato immediatamente o cullò dolcemente notte a temperatura ambiente per l'elaborazione del giorno successivo. Il ritardo nell'elaborazione ha poco effetto sulla efficienza di arricchimento ed è associata con una minima perdita di vitalità.
2. Mescolare sangue intero 1: 1 con una soluzione sterile, magnesio temperatura ambiente e calcio libero tampone fosfato salino (PBS).
3. In un tubo da 50 ml sterile, aggiungere 10 ml di soluzione di gradiente di densità temperatura ambiente. Conservare le bottiglie gradiente di densità aperte al buio a 4 ° C, ma caldo a temperatura ambiente prima dell'uso.
4. Se possibile impostare la pistola pipetta all'impostazione lento e / o applicare molto poco, ma omogeneo, pressione trigger lentamentestrato 30-35 ml di sangue diluito in cima al gradiente di densità, facendo attenzione a non mescolare i due.
   NOTA: Posizionare la punta della pipetta contro il bordo dei 50 ml conica, mentre l'aggiunta del sangue diluito contribuirà a garantire un flusso costante coerente.
5. Centrifugare a 400 xg per 30 min a 20 ° C con il freno disattivato.
6. Rimuovere lo strato superiore, che contiene plasma e piastrine, facendo attenzione a non disturbare lo strato di cellule mononucleate di seguito.
7. Usando una pipetta sterile, raccogliere lo strato di cellule mononucleate (buffy coat) e posto in una sterile tubo da 50 ml a parte.
8. Aggiungere PBS alla sospensione cellulare ad un volume di 50 ml. Centrifugare a 400 xg per 10 min a 20 ° C con freno.
9. Rimuovere il surnatante e sospendere nuovamente le cellule pellet in 10 ml di PBS. Contare le celle e determinare la vitalità usando un emocitometro o contatore di cellule automatizzato.
10. Risospendere le cellule a 10 ⁷ cellule / ml e posto su ghiaccio fino al momento per ulteriori elaborazioni.

2. colorazione delle cellule

1. Rimuovere 1-2 x 10 ⁶ cellule per ogni compensazione della fluorescenza / controllo FMO necessario, se applicabile. restante Centrifugare delle cellule a 400 xg per 10 min a 4 ° C con freno.
2. Risospendere le cellule in sterile filtrata, tampone freddo FACS (PBS + 1% di albumina sierica bovina (BSA) + 0,01% di sodio azide) a 3-6 x 10 ⁷ cellule / ml (rimuovono in una provetta da 1,5 ml centrifuga). Assicurarsi che il buffer di FACS è freddo e tenerlo in ghiaccio per tutta la procedura di colorazione.
   1. Dividere la popolazione di cellule in quarti (AD), quando l'ottimizzazione del dosaggio. Utilizzare frazione A arricchire cellule B antigene-specifiche di interesse, usare le frazioni B e C per determinare la specificità di arricchimento / colorazione (vedi 2.5 e 2.6), e l'uso frazione D per determinare la frequenza e il numero di cellule antigene-specifiche in la popolazione non arricchito per consentire il calcolo del rendimento e piega-arricchimento.
3. Aggiungere FcγR blocco re umanoagente per le frazioni dC sul ghiaccio per evitare il legame degli anticorpi ai recettori Fc.
   NOTA: Seguire le istruzioni del produttore per le condizioni appropriate.
4. Aggiungere gli anticorpi coniugati a fluorocromi alla cella antigeni di superficie di interesse per le frazioni dC per 30 min in ghiaccio al buio, facendo attenzione a non includere fluorocromi che possono attraversare reagire con gli anticorpi anti-dye far-rosso-fluorescenti accoppiate a nanoparticelle magnetiche.
   NOTA: Questi includono anticorpi coniugati a colorante fluorescente vicino IR, Cy5, Cy5.5, e Cy7. Eventuali macchie di vitalità che vengono aggiunti devono essere compatibili con l'uso di un fissativo. Se non si intende analizzare le cellule utilizzando FACS, ma determinano la frequenza secernono anticorpi, per esempio, da ELISPOT, colorazione della superficie con anticorpi è inutile.
5. Per verificare la specificità del test, incubare Frazione B con sufficiente quantità di antigene non marcato per 30 min in ghiaccio, tale che la maggior parte dei recettori con un'affinità di almeno10 ^-6 M sono bloccate.
   NOTA: in genere, una buona concentrazione di partenza è un 50-100 volte superiore alla quantità di antigene considerato sufficiente a 2.6 (ad esempio 50-100 micron). Questo dovrebbe bloccare le cellule B con una elevata affinità per l'antigene non marcato di legarsi all'antigene biotinilato, che viene aggiunto nel passaggio 2.6, consentendo così la conferma della specificità delle cellule arricchito. Questo passaggio può essere completato in combinazione con al punto 2.4.
6. Aggiungere antigene biotinilato a frazioni A, B, e D. Incubare in ghiaccio per 30 min.
   NOTA: concentrazione dell'antigene biotinilato deve essere titolata per determinare la quantità ottimale necessaria per garantire un'adeguata individuazione e la separazione delle cellule vincolante da cellule bystander non specifici. In genere una buona concentrazione di partenza per test è 1-5 micron.
   NOTA: per frazioni A e D, questo passo può essere eseguito contemporaneamente al precedente punto 2.4. Per Frazione B, questo passo dovrebbe essere fatto dopo passo 2.5 (lavaggio in betwpassi een non è necessaria).
7. Omettere antigene biotinilato dalla frazione C, al fine di determinare l'eventuale legame di cellule B ad altri reagenti nel protocollo, come streptavidina tintura far-rosso fluorescente e le sfere magnetiche.
8. Lavare le cellule due volte da sospensione di cellule in 1 ml di tampone FACS per 5 x 10 ⁷ cellule e centrifugazione a 400 xg per 5 minuti a 4 ° C.
9. Dopo l'ultimo lavaggio, diluire sospensione di cellule concentrato in 1 ml di 2% di formaldeide per 5 x 10 ⁷ cellule e lasciate riposare nel buio in ghiaccio per 5 min.
   NOTA: Fixation delle celle a questo punto assicura che l'antigene biotinilato rimane vincolato alla BCR per il restante della procedura. Per le cellule vitali - per l'analisi a valle, come ad esempio in ELISPOTs o trasferimenti adottivi, omettere il passo di fissaggio.
10. Lavare le cellule due volte con 1 ml di tampone FACS per 5 x 10 ⁷ cellule e centrifugare a 400 xg per 5 minuti a 4 ° C. Risospendere in 1 ml FACS freddi tampone per 5 x 107 cellule.
11. Aggiungere colorante 1-2 mg streptavidina-far-rosso fluorescente / ml e incubare su ghiaccio per 20 minuti al buio. Titolare la quantità di streptavidina per ogni applicazione.
12. Lavare le cellule due volte con 1 ml di tampone freddo FACS per 5 x 10 ⁷ cellule e centrifugare a 400 xg per 5 minuti a 4 ° C. preparazione Frazione D è completato a questo punto come non subirà arricchimento con le biglie magnetiche.
    NOTA: Questo esempio verrà utilizzato per determinare la frequenza e il numero di cellule B antigene-specifiche nel campione. Questo verrà utilizzato per determinare la resa e piegare-arricchimento raggiunti da arricchimento.

3. Arricchimento nanoparticelle a base di Magnetic

1. Risospendere le cellule da campioni AC in 1 ml di tampone a freddo di separazione (PBS + 0,5% BSA + 2mM EDTA) per 5 x 10 ⁷ cellule e passare attraverso un filtro 40 micron per eliminare eventuali grumi che potrebbero ostruire la colonna.
2. Aggiungere Anti-Cy5 / Anti-far-rosso-fluorescenti nanoparticelle colorante. for risultati ottimali, la concentrazione di nanoparticelle deve essere titolata per ogni uso, ma un buon punto di partenza è 50 sospensione pl per 5 x 10 ⁷ cellule / ml. Ruotare al buio a 4 ° C per 10 min.
3. Lavare due volte con 1 ml di tampone di separazione freddo a 400 xg per 5 minuti a 4 ° C. Risospendere le cellule in 1 ml di tampone di separazione freddo per 5 x 10 ⁷ cellule.

4. Arricchimento magnetica Utilizzando LS o colonne LD

1. Inserire tre LS o colonne LD nel campo magnetico di un separatore magnetico e aggiungere 3 ml di tampone di separazione per bagnare le colonne (vedi descrizione prodotto per determinare quale tipo di colonna è più adatto). Consentire a tutti i 3 ml di passare attraverso la colonna e scartare dopo la raccolta.
   NOTA: Sebbene la separazione delle cellule nanoparticelle magnetiche marcato può essere realizzato utilizzando uno qualsiasi dei dispositivi di separazione magnetica che sono disponibili in commercio, il laboratorio ha avuto più successo con l'uso di colonne LS, in terms di rendimento, la purezza e l'efficienza di arricchimento.
2. Posizionare i tubi tre 15 ml coniche con l'etichetta "Frazione A / (B) / (C) negativo", per le celle selezionate negativamente, sotto la colonna. Aggiungere la particella magnetica cellule marcate alla loro rispettiva colonna e consentire l'intero volume di passare attraverso.
3. Aggiungere 3 ml di tampone di separazione freddo sulla parte superiore, e permettere questo di passare attraverso la colonna e ripetere con 2 ml. Raccogliere le cellule negativamente selezionati e mettere da parte in ghiaccio.
4. Rimuovere la colonna dal campo magnetico e posizionare su di un tubo da 15 ml etichettata "Frazione A / (B) / (C) positivo", per le celle selezionate positivamente.
5. Riempire la colonna all'inizio con circa 6 ml di tampone di separazione e subito immergere questo volume attraverso la colonna per raccogliere le cellule che erano legati al campo magnetico usando lo stantuffo disponibile.
6. Per aumentare la purezza, le celle selezionate positivamente possono essere ulteriormente arricchito con una seconda colonna pulita, ripetendo il proceDure.
7. Spin entrambe le frazioni negativamente e positivamente selezionate a 400 xg per 10 min a 4 ° C e sospendere in volume finale desiderato. Procedere con l'analisi a valle, come ad esempio FACS, ELISPOT o trasferimento adottivo.

Risultati

Analisi di purezza, la resa, e piegare-arricchimento mediante citometria a flusso

Popolazioni arricchite come sopra descritto inevitabilmente contenere cellule contaminanti che non sono legate colorante streptavidina far-rosso fluorescente, ma sono intrappolati nella matrice. Queste impurità possono essere rimossi da popolazioni arricchito da FACS ordinamento. Per stimare la purezza delle popolazioni arricchiti, cancello su cellu...

Discussione

Qui si descrive un nuovo metodo per realizzare l'isolamento e arricchimento delle cellule B antigene vincolante da sangue periferico umano. Il metodo è facilmente applicabile a topi e ad altri tessuti, come i milza e nei linfonodi, ed è compatibile con l'analisi post-arricchimento del fenotipo cellulare e funzione (manoscritto in preparazione).

L'utente deve essere a conoscenza di un certo numero di variabili che possono influenzare il successo di questa procedura. Per esperienza...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Antigene di interesse	variabile		variabile Almeno 100 μ g per biotinilare facilmente; se si utilizzano proteine, provare a utilizzare proteine che sono state convalidate da ELISA. Deve essere portatore  senza proteine.
Biotina per l'etichettatura; es. EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotina	Thermo Scientific	21335	La biotina è disponibile in diverse formulazioni, come quelle contenenti distanziatori di varie lunghezze, quindi il tipo utilizzato dovrebbe essere determinato dal ricercatore
Streptavidin-Alexa Fluor 647	Invitrogen	S21374	Può ottenere da altri fornitori.
Microsfere Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 Colonne	Miltenyi Biotech	130-091-395
LS Separatori	Miltenyi Biotech	130-042-401
MACS Formaldeide
			Diluire al 2% con PBS; opzionale se il test a valle richiede PBS su cellule vive
senza calcio e magnesio
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	17-1440-02
Sangue intero in provette
Tampone FACS (PBS + 1% BSA + 0,01% sodio azide)
Tampone di separazione (PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA)
Provette
Provette
			Eppendorf da 1,5 ml
Anticorpi reattivi per marcatori di superficie, blocco Fc, colorante discriminante vivo/morto, se necessario
forniture ELISPOT, se necessario