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Articolo metodologico

Espressione di citochine esogene in Xenografts derivati ​​da pazienti mediante iniezione con una linea cellulare stromalica trasdotta a citocina

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DOI:

10.3791/55384

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10 maggio 2017

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1Department of Pathology and Human Anatomy, Loma Linda University, 2Department of Basic Sciences, Loma Linda University, 3Department of Medicine, Loma Linda University

In questo articolo

Sommario

Di seguito è descritto un metodo per produrre citochine esogene nei topi xenograft (PDX) derivanti dal paziente mediante iniezione intraperitoneale settimanale di una linea cellulare stromale trasfusa da citochine. Questo metodo amplia l'utilità di PDX e fornisce l'opzione per la consegna transiente o sostenuta della citochine esogena in una moltitudine di modelli PDX.

Abstract

I topi xenograft (PDX) derivati ​​dal paziente vengono prodotti trapiantando le cellule umane in topi immunitari deficienti. Questi modelli sono uno strumento importante per studiare i meccanismi di ematuria normale e maligna e sono il gold standard per identificare le chemioterapie efficaci per molte malattie maligne. I modelli PDX sono possibili perché molte delle citochine del mouse agiscono anche sulle cellule umane. Tuttavia, questo non è il caso di tutte le citochine, tra cui molti che sono critici per lo studio di ematuria normale e maligna nelle cellule umane. Le tecniche che ingegneranno i topi per produrre citochine umane (modelli transgenici e knock-in) richiedono una significativa spesa prima che sia stata dimostrata l'utilità del modello. Altre tecniche sono labor intensive (iniezione di citochine ricombinanti o lentivirus) e in alcuni casi richiedono elevati livelli di competenza tecnica (iniezione idrodinamica del DNA). Questo rapporto descrive un metodo semplice per la generazione di topi PDX che presentano una via umana esogenaTokine (TSLP, linfopoietina stromale stromico) mediante iniezione intraperitoneale settimanale di stroma che sono state trasdotte per sovraespressione di questa citochina. L'uso di questo metodo fornisce una sorgente in vivo di produzione continua di citochine che raggiunge livelli fisiologici della citochina umana circolante nel topo. I livelli plasmatici della citochina umana possono essere variati in base al numero di cellule stromali iniettate e la produzione di citochine può essere avviata in qualsiasi punto dell'esperimento. Questo metodo comprende anche i topi di controllo negativo di citochine che sono prodotti analogamente, ma attraverso l'iniezione intraperitoneale di stroma trasfusa con un vettore di controllo. Abbiamo dimostrato in precedenza che le cellule di leucemia raccolte da PDL che esprimono TSLP, rispetto al controllo PDX, presentano un modello di espressione genica più simile al campione originale del paziente. Insieme i topi PDX produttori e citochine-negativi prodotti da questo metodo forniscono un sistema di modello che abbiamo utilizzato con successo per studiareRuolo del TSLP in ematuria normale e maligna.

Introduzione

I xenografts derivati ​​da pazienti (PDX) sono un potente modello in vivo per studiare la produzione di cellule ematopoietiche normali e maligne in un ambiente mammifero nativo. Più spesso, PDX è prodotto produrre iniettando o trapiantando le cellule umane in topi immunitari deficienti. La produzione di PDX utilizzando normali cellule staminali ematopoietiche umane consente studi in vivo di sangue umano normale e sviluppo di cellule immunitarie. PDX prodotto da leucemia o da altre cellule tumorali consente di studiare meccanismi oncogeni e di identificare terapie efficaci nel contesto della gamma di paesaggi genetici e mutazioni presenti nella popolazione umana. 1 Di conseguenza, PDX è l'attuale standard oro per la ricerca biomedica di traduzioni per identificare terapie efficaci e un importante strumento per comprendere i meccanismi della progressione del cancro. I modelli PDX sono uno strumento essenziale per aiutare la ricerca sulle disparità di salute malattie dovute a specifiche Lesioni genetiche o qualsiasi malattia in cui le variazioni del paesaggio genetico di un paziente possano contribuire sostanzialmente all'operazione di oncogenesi e trattamento.

I modelli PDX del mouse-umano sono possibili perché molti citochine del mouse adeguatamente imitano i loro analoghi umani nell'attivare i recettori delle cellule umane mentre sono all'interno del mouse. Ad esempio, l'interleuchina-7 (IL-7) fornisce un segnale critico per lo sviluppo di cellule B umane. 2 In questo caso, il mouse IL-7 ha sufficiente omologia con l'umano IL-7 che la citocina del mouse stimola i percorsi di segnalazione nei precursori di cellule B umani. 2 , 3 , 4 Tuttavia, questo non è il caso del linfopoetina stromale tromico (TSLP), 5 , 6 che tra le altre citochine (IL-3, fattore stimolante colonia del granulocyte-macrofago (GM-CSF), fattore di cellule staminali (SCF) ,Ref "> 7 è importante per la produzione di cellule ematopoietiche umane normali e maligne Quando le citochine del mouse e dell'uomo mostrano una bassa omologia le citochine del mouse non attivano i rispettivi recettori sulle cellule umane Per superare questo ostacolo sono state utilizzate varie strategie Per progettare l'espressione di citochine umane nei topi PDX, tra cui l'iniezione di citochine umane ricombinanti, l'iniezione idrodinamica del DNA, l'espressione lentivirale, l'espressione transgenica e la sostituzione del gene knockin.7 Questo rapporto descrive un metodo per la progettazione di PDX per la produzione di citochina umana tramite stromal media Citochine ( Figura 1 ).

Nel metodo mostrato qui, i topi PDX sono progettati per esprimere la citocina umana, TSLP, o per servire come controlli negativi per la citochina. PDX che esprimono TSLP sono ottenute mediante iniezioni intraperitoneali settimanali di cellule stromali che sono state trasdotte per esprimere elevati livelli di TSLP umani.I topi di controllo "PDX" negativi per citochine sono costruiti similmente; Sebbene lo stroma di controllo venga trasduzione con un vettore di controllo. Questo metodo raggiunge i normali livelli fisiologici del TSLP umano in topi PDX iniettati con lo stroma TSLP +. Nessun TSLP rilevabile è osservato nei topi PDX che ricevono lo stroma citochina-negativo. Abbiamo scelto la linea cellulare HS-27A per i nostri studi, perché cresce robustamente in coltura e presenta un livello molto basso di produzione di citochine che non supporta la proliferazione di cellule progenitrici isolate nelle coculture. 8 Per l'espressione TSLP umana, lo stroma è stato trasdritto con un vettore lentivirale auto-inattivo di una generazione avanzata derivato da una spina dorsale precedentemente descritta 9 e comprende l'elemento cPPT / cts e l'elemento regolatore post-trascrizionale dell'epatite di legno (WPRE) per aumentare l'espressione di transgene. Il gene TSLP umano è stato costruito in questo vettore sotto il controllo del fattore di allungamento-1(EF-1) alfa promotore per ottenere un'espressione robusta, costitutiva e a lungo termine.

L'ingegnerizzazione di questo modello PDX migliorato per via umana-citochina è costituito da 4 fasi principali. Innanzitutto, lo stroma transdurato viene ampliato in vitro e valutato mediante un test immunosorbente enzimatico (ELISA) per una stabile produzione di citochine ad alto livello. In secondo luogo, l'attività della citochina umana prodotta dalle cellule stromali trasdurate (e la mancanza di attività di citochine da uno stroma di controllo) viene verificata usando citometria a fosfo-flusso. Le linee cellulari note per essere sensibili alla citochina di interesse (in questo caso, TSLP) vengono incubate con il surnatante di cellule stromali e sono state analizzate per la fosforilazione indotta da citocina. In terzo luogo, i topi vengono iniettati con lo stroma umano trasduttore e poi il plasma del topo viene valutato mediante ELISA per livelli di citochina umana su base settimanale. Quarta, le cellule ematopoietiche umane vengono trapiantate e gli effetti funzionali in vivo della citochina umana vengono valutati su un bersaglio noto ( Ad esempio. Popolazione cellulare).

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Figura 1: Modello PDX progettato per produrre citochina umana esogena nei topi. ( 1A ) Eseguire esperimenti di progettazione e ottenere cellule stromali umane trasdurate ( 1B ) Ottenere cellule umane (cellule staminali ematopoietiche, cellule di leucemia, ecc .) Per generare PDX (topi derivanti da xenograft). ( 2A ) Iniettare lo stroma progettato e ( 2B ) trapianto di cellule umane in topi immuni deficienti secondo il programma sperimentale. ( 3A-B ) Monitorare le concentrazioni di citochine nel supernatante dello stroma e nel plasma del topo mediante ELISA. ( 4 ) Raccogliere le cellule umane e valutare gli effetti funzionali in vivo della citochina umana presente nel PDX. Per favore clicca quiPer visualizzare una versione più grande di questa figura.

La consegna della citochina umana tramite cellule stromali offre vantaggi e svantaggi rispetto ad altri metodi di erogazione / produzione di citochine umane nei topi PDX. 7 Rispetto all'iniezione della citochina umana ricombinante, la somministrazione di stroma-mediata è generalmente meno costosa (il costo della coltura cellulare stromale è minore del costo della citochina ricombinante) e meno intensivo di lavoro (una iniezione a settimana rispetto a più iniezioni a settimana). Anche il problema della breve emivita di citochine è mitigato dal momento che lo stroma produce continuamente la citochina esogena. La somministrazione di citochina tramite iniezione idrodinamica del DNA può essere meno costosa della consegna tramite lo stroma. Tuttavia, è allo stesso modo transitorio e può richiedere più abilità tecnica rispetto alla semplice iniezione intraperitoneale settimanale richiesta per la somministrazione di stroma-mediata. L'espressione genica lentivirale nel topo può fornire una traccia minoreMetodo nsient di consegna della citochine; Tuttavia, nelle nostre mani non sono stati raggiunti livelli fisiologici di TSLP. Inoltre, questo metodo è intenso per il lavoro, che richiede la produzione continua di vettore lentivirale. I topi transgenici o knock-in offrono una stabile espressione a lungo termine della citochina e possono essere progettati per un'espressione specifica del tessuto, che può essere un vantaggio. D'altra parte, l'espressione transgenica del gene citocinico umano sullo sfondo del mouse immunitario deficiente richiesto per i topi PDX richiede un investimento immenso di risorse prima che il valore del modello sia stato stabilito. Inoltre, i modelli transgenici in genere non consentono l'opzione di variare la tempistica dell'iniziazione della citochina o del livello della produzione di citochine in vivo . Questi possono essere ottenuti con consegna mediata da stroma semplicemente cambiando il punto di tempo per l'inizio dell'iniezione di cellule stromali o la dose di cellule stromali iniettate.

Metodo di somministrazione della citocina mediata dalle cellule stromaliOd dettagliata qui è stata usata per sviluppare PDX per valutare il ruolo di TSLP nello sviluppo normale delle cellule B umane 4 e 6 e nella leucemia linfoblastica acuta a cellule B ad alto rischio. 6 Questo metodo fornisce un metodo alternativo di somministrazione della citocina per l'impiego nella generazione di modelli simili con citochine umane diverse da TSLP. Questo modello può anche essere utile per la generazione di dati preliminari che possano aiutare a determinare se il valore di un modello PDX di tipo cromosomico o citochinico per citochine sarebbe degno dell'investimento sostanziale del tempo e del denaro.

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Protocollo

Gli studi sono stati condotti in conformità con i protocolli approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) e dal consiglio d'amministrazione istituzionale di Loma Linda (IRB) e secondo tutte le linee guida federali.

ATTENZIONE: PDX e tessuti umani devono essere trattati secondo procedure di sicurezza per evitare la trasmissione di patogeni derivanti dal sangue.

1. La cultura e l'espansione delle cellule stromali transdestinate da citochine

NOTA: Ogni volta che il stroma viene passato, raccogliere il supernatante della coltura (aliquota 1 mL) e conservare a -80 ° C per la quantificazione futura del livello della citocina mediante il dosaggio ELISA.

  1. Preparare il mezzo di coltura R10 e il mezzo di congelamento come descritto nella Tabella dei Materiali.
  2. Generare 10 , 11 o ottenere lo stroma di controllo (trasduttore con vettore vuoto) e lo stroma della produzione di citochine (TSLP +)."> 6 Conservare in azoto liquido (LN 2 ) fino all'uso.Puotare le cellule stromali come descritto 12 e placcarle in 5 ml di mezzo R10 in bolle separate per la coltura T-25. Cellule di coltura in un incubatore a 37 ° C con il 5% CO 2. Questo è il post-scongelamento "passaggio # 1".
  3. Una volta che lo stroma è confluente (24-48 h), le cellule di passaggio da trypsinizzazione utilizzando 1 × triptofina EDTA (0,25%) e ri-placcatura in una tazza di coltura T-150. Questo è il post-scongelamento "passaggio # 2".
  4. Quando lo stroma raggiunge confluenza nelle tazze T-150 (3-4 giorni più tardi), passaggio le cellule da trypsinizzare. Utilizzare questa sospensione cellulare per esigenze sperimentali.
    1. Espansione cellulare a più fiaschi
      1. Distribuire le cellule raccolte tra tre tazze T-150 e la cultura fino a confluire. Ripetere questo passaggio se è necessaria un'espansione dello stroma. Il numero di cellule stromali umane (HS-27A) a confluenza in un pallone T-150 è di ~ 5 x 10 6 .
    2. Cellula sessa in riserva
      1. Trasferire la sospensione delle cellule raccolte in un tubo conico e centrifugare a 500 xg per 5 minuti, decantare il surnatante e risospendere le cellule in mezzo di congelamento. Bloccare e conservare in LN 2 ~ 1.5 x 10 6 cellule per flaconcino.
    3. Per le iniezioni di stroma intra-periotoneale nei topi, procedere al punto 4.1.

2. Saggi ELISA per monitorare la produzione di citochine in vitro da Stromo transdetto

  1. Acquistare un kit di analisi ELISA commercialmente disponibile per rilevare la citochina di interesse.
  2. Sostituire il supernatante di cellule stromali dal controllo e la stroma prodotta da citochine (TSLP +) raccolti nei passaggi primi, medi e tardivi ( Figura 2 ).
  3. Determinare la concentrazione di TSLP nei campioni di supernatante usando un kit ELISA secondo le istruzioni del produttore. 13 Compilare questi dati seriali per monitorare la stabilità della produzione di citochine durante il coltura cellulare E ( Figura 2A-B ).
    1. Identificare e scartare lo stroma produttivo di citochine con espressione citochina ridotta o non ottimale, nonché qualsiasi fiale corrispondente in deposito ( Figura 2A-B ).
    2. Identificare e mantenere stroma produttrice di citochine che dimostrano concentrazioni stabili e elevate di citochine. Usare queste sbavature per esperimenti.
  4. Utilizzare il kit ELISA per monitorare periodicamente lo stroma per tutta la durata della coltura cellulare (almeno una volta durante i passaggi di post-scongelamento iniziali, medi e tardi) per garantire una produzione stabile della citocina o, nel caso dello stroma di controllo, l'assenza di produzione di citochine .

3. Analisi della citometria di fosforo per valutare l'attività della citochina prodotta da Stroma

NOTA: Valutare il surnatante da uno stroma progettato prima del primo esperimento per verificare la pertinente bioattività della citochina generata da stroma per un singolo esperimento.Ef "> 6 Una volta che il stroma progettato è convalidato, ulteriori test non è necessario a meno che non venga introdotto lo stroma che è stato prodotto con un nuovo vettore.

  1. Acquistare linee cellulari di leucemia MUTZ5 e / o MHH-CALL4 (TSLP reattive), 14 citochine umane ricombinanti e anticorpi approvati per l'impiego in saggi di citometria a flusso fosforico per rilevare appropriati obiettivi di fosforilazione a valle.
  2. Sciogliere il supernatante raccolto dal controllo dello stroma esprimente la citochina.
  3. Piattare le linee delle cellule di leucemia nel mezzo R20 (vedere tabella dei materiali ) ad una concentrazione di 0,2 x 10 6 cellule per pozzetto in una piastra di coltura da tessuto da 96 pozzetti. Piatti 3 pozzetti per condizione per consentire i dosaggi triplicati. Incubare per 2 ore a 37 ° C. Questa volta consente la perdita di qualsiasi fosforilazione che si è verificata durante le condizioni di coltura precedenti.
    NOTA: 12 pozzetti per linea cellulare forniscono i dosaggi triplicati per ogni condizione sperimentale mostrata nel passaggio 3.4.
    4. <Dopo 2 ore di coltura, trasferire le cellule da ogni pozzetto per separare i tubi da 4 mL e centrifugare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decanta il sovranatante.
    1. Riposizionare le cellule in 200 μl per ciascuna delle seguenti condizioni sperimentali (eseguire i dosaggi in triplice copertura): 1) solo mezzo di controllo negativo, 2) supporto di controllo positivo con citochina ricombinante a concentrazioni saturanti (TSLP a 15 ng / Ml, ecc .), 3) controllo dello stroma-supernatante da stroma di controllo, e 4) supernatante citochina-stroma da stroma produttrice di citochine.
  4. Incubare le cellule per la durata specificata da specifici fosfomi commerciali ( es. 30 min per fosfo-STAT5 in MUTZ5 o MHH-CALL4 in risposta a TSLP).
  5. Centrifugare a 500 xg per 5 min a 4 ° C e decantare il surnatante.
  6. Eseguire la colorazione della citometria a flusso fosforico per protocollo del produttore e raccogliere dati di citometria a flusso. 15
  7. Analizzare i dati della citometria a flusso. 15
    1. Porta su cellule intatte basate su avanzamento (FSC, indica la dimensione cellulare) e lato (SSC, indica granularità cellulare) scatter luce.
    2. Determinare l'intensità fluorescente media (MFI) delle cellule intatte in ciascun campione. Confronta l'MPI media ottenuta dai valori triplicati del supernatante di cellule stromali a quella dei controlli medi e positivi negativi.

4. Iniezione di stroma transdestinata da citochine nei topi

NOTA: Lo stroma della cultura HS-27A per un minimo di 3 passaggi post-scongelamento prima di iniettarli in topi per garantire le cellule sane e un'adeguata produzione di citochine.

  1. Preparazione dello stroma
    1. Trasferire la sospensione delle cellule stromali raccolte in un tubo conico e una aliquota di 10 μL per il conteggio dell'emocitometro; Ottenere il numero di cellule vive usando tripan blu. 16 Centrifugare il ce rimanenteLl sospensione a 500 xg per 5 min.
    2. Aspirare il surnatante dalle cellule pelletate e riposizionare delicatamente le cellule nel volume necessario di salina fosfata tamponata sterile (PBS) per l'iniezione del mouse (a seconda del numero di topi da iniettare).
      NOTA Concentrazione tipica di cellule stromali per l'iniezione del mouse: 0,5 x 10 6 -5 x 106 cellule per mouse in 200 μl di PBS.
    3. Tenere la sospensione della cellula stromale a 4 ° C (o in ghiaccio) fino immediatamente prima dell'iniezione. Assicurarsi che la sospensione cellulare sia almeno a temperatura ambiente (~ 25 ° C) per l'iniezione dei topi.
  2. Iniezione di cellule Stromal
    1. Disinfettare la cappa di bio-sicurezza, assemblare i materiali per le iniezioni e quindi posizionare la gabbia del mouse all'interno.
    2. Mescolare delicatamente la sospensione cellulare per inversione prima di preparare 200 μL in una siringa tubercolina.
    3. Utilizzando tecniche standard di iniezione intra-peritoneale, 17Frenare il topo e somministrare la sospensione cellulare di 200 μl nella cavità peritoneale. Dettagli sono stati precedentemente dimostrati da Machholz et al. 18

5. Sorveglianza di serie e monitoraggio del plasma per la citochina umana esogena nei topi

  1. Raccolta del sangue attraverso il taglio della coda
    1. Disinfettare il cappuccio di biosicurezza e assemblare il dispositivo di ritenzione del topo, forbici e altri attrezzi / forniture per la procedura.
    2. Posizionare il mouse in un dispositivo di ritenzione e fissare il tubo per minimizzare il movimento del mouse.
    3. Disinfettare la coda e le forbici chirurgiche con alcool isopropilico. Applicare la crema anestetica topica sulla coda.
    4. Utilizzando forbici chirurgiche molto taglienti tagliate fuori circa 0,5-1 mm della punta della coda del mouse. Raccogliere circa 80 μL di sangue periferico usando tubi capillari eparinizzati.
      NOTA: Se il sangue verrà raccolto con questo metodo più di sei tiMes, la rimozione della coda dovrebbe essere conservatrice rispetto alla quantità di coda rimossa. Mentre gli snips avanzano nella coda, il diametro aumenta, emorragia più velocemente e la guarigione richiede più tempo.
  2. Separazione del plasma
    1. Trasferire il sangue usando una siringa a bulbo (per espellerla dai tubi capillari) in un tubo a microelemento K 2 EDTA etichettato; Invertire 20 volte per prevenire la coagulazione.
      NOTA: generalmente la coagulazione del sangue dalla coda della coda è veloce. Tuttavia, se la emorragia persiste per più di ~ 2 minuti usa una matita / polvere di stitichezza per aiutare la coagulazione.
    2. Centrifugare i tubi di raccolta del sangue secondo le istruzioni del produttore e allontanare il plasma per lo stoccaggio (-20 ° C) fino a quando è pronto per il test ELISA.
    3. Se i dati del cimerismo di cellule umani e umani sono necessari dal sangue del mouse, quindi trattare il pellet rimanente come descritto nella fase 6.3.1. Altrimenti, scartare il pellet di cellule del sangue.
  3. ELISA modificata per micro-volUmie del plasma del topo
    NOTA: La procedura ELISA del produttore è stata modificata dal volume di campione raccomandato da 100 μL a un volume di 40 μL per accogliere i micro-volumi raccolti dai topi. Non è possibile eseguire campioni di plasma al plasma in vivo in triplice con questi volumi limitati. Alla fine dell'esperimento vengono raccolti ~ 500 μL di sangue post-mortem mediante puntura cardiaca. Le concentrazioni di citochine valutate in 100 μL di plasma di eutanasia vengono utilizzate per convalidare i dati in vivo di 40 μL per ogni topo.
    1. Eseguire campioni di plasma congelati.
    2. Diluire seriamente le norme ELISA e piattarle in tripple a 40 μL per pozzetto.
    3. Aggiungere 40 μL di ogni campione di plasma del mouse alla piastra ELISA.
      NOTA: Se un campione del mouse è inferiore a 40 μL, portare il volume fino a 40 μL con il buffer ELISA. Registrare questo volume diluente e utilizzarlo per calcolare un fattore di diluizione per ciascun campione diluito. quandoL'analisi dei dati ELISA moltiplica la concentrazione del campione diluito per il fattore di diluizione del campione per determinare la reale concentrazione di citochina nel campione originale.
    4. Completare il dosaggio ELISA secondo le istruzioni del produttore.

6. Trapianto di cellule ematopoietiche nei topi

  1. Irradiazione subletale per la cura del midollo osseo per il trapianto
    NOTA: L'Università Loma Linda (LLU) utilizza una sorgente di radiazioni Cobalt-60. Gli animali sono collocati in un contenitore a torta, posizionato a 80 cm dalla sorgente di radiazione in un campo di 20 x 20 cm e con uno strato di Lexan di 0,5 cm in cima al restriente. Il tempo di esposizione è calcolato per raggiungere una dose di 225 cGy basata sulla più recente calibrazione della sorgente (attualmente 2-3 min per questa sorgente).
    1. I topi irradiati sotto letale (dose totale di irradiazione del corpo di 225 cGy massimo per topi immunitari deficienti).
    2. Le cellule ematopoietiche del trapianto ~ 24 h più tardi tramite </ Em> iniezione endovenosa per via endovenosa.
  2. Trapianto di cellule ematopoietiche intra-venose
    1. Preparare le sospensioni di cellule umane per il trapianto in un volume di 200 μl di PBS sterile per mouse: CD34 + cellule staminali ematopoietiche (HSC): 1 x 10 5 a 5 x 10 5 cellule per le cellule di leucemia e del mouse e campioni di pazienti: 1 x 10 6 a 5 x 10 6 cellule per mouse.
    2. Tenere le cellule a 4 ° C (trasporto su ghiaccio) fino a subito prima del trapianto. Assicurarsi che le cellule siano almeno a RT prima del trapianto.
    3. Disinfettare la cappa di bio-sicurezza e preparare l'area del cappuccio per le iniezioni di trapianto.
    4. Posizionare il mouse nella gabbia di riscaldamento per almeno 5 minuti per consentire la dilatazione delle vene della coda.
    5. Mescolare delicatamente la sospensione cellulare e prelevare 200 μL in una siringa tubercolina. Posizionare l'ago in modo sicuro dove rimarrà sterile.
    6. Posizionare il mouse in un contenitore e disinfettare la coda con alcool isopropilico/ Li>
    7. Utilizzando tecniche standard di iniezione endovenosa, 17 iniettare la sospensione delle cellule umane in vena della coda del topo.
      NOTA: Le iniezioni delle vene di coda possono richiedere diversi tentativi, in particolare per un gestore animale novizio. Kovacscics e il video Joaver 19 di Raper fornisce una dimostrazione dettagliata di questa tecnica animale.
    8. Monitoraggio del recupero del mouse per ~ 5 min. Registrare eventuali eventi avversi durante l'iniezione ( ad es. Le cellule versate, la grave emorragia, il trauma eccessivo della coda).
  3. Analisi del cimerismo delle cellule umane nel sangue periferico del mouse
    1. Ottieni il pellet di cellule del sangue che rimane nel tubo del microtainer dopo la separazione del plasma (punto 5.2.3).
    2. Per la lisi di globuli rossi (RBC), risospendere il pellet di sangue restante in un volume di PBS pari al plasma rimosso (per sostituire il volume del plasma) e mescolare bene (vortex / pipetta).
    3. Trasferire ogni campione di sangue sospeso in un tubo di 4 ml etichettatoE quindi aggiungere un tampone di lisi RBC a ciascun tubo in un rapporto 1: 9 (900 μl di tampone di lisi RBC per 100 μL di sospensione sospesa). Incubare per 5 minuti a RT. Centrifugare (5 min, 500 xg) e decanta.
    4. Eseguire l'incubazione secondo buffer del lysis di RBC (5 min a RT). Centrifugare e decantare come prima.
    5. Lavare le altre cellule in ~ 1 mL di PBS. Centrifugare e decantare come prima.
    6. Riposizionare il pellet in un volume di PBS appropriato per la colorazione standard di citometria a flusso (questo varia a seconda del produttore e dei singoli protocolli di laboratorio). Utilizzare gli anticorpi immunofenotipo convalidati per il cyotmeter di flusso per identificare le cellule del mouse (mouse CD45 +) e le cellule umane (umano CD45 +) 6 , 21 Così come ulteriori marcatori di leucociti umani specifici del linfatico cellulare di interesse.
      NOTA: Si raccomanda di prendere un piccolo volume (5 μL-20 μL) da ciascun campione del mouse per creare "campioni aggregati"; Da utilizzare per i campioni di controllo non conservati, di redditività ed isotipi. È pratica migliore avere controlli non conservati e isotipo per ogni condizione sperimentale.

7. Valutazione funzionale dell'attività in vivo di citochine

  1. Eutanasia del mouse e raccolta dei tessuti
    1. Eutanizzare i topi attraverso l'asfissia del CO 2 nel punto sperimentale designato.
    2. Raccogliere il sangue attraverso la puntura cardiaca e raccogliere il plasma come nei passaggi 5.2.1-5.2.2.
      NOTA: raccogliere il sangue prima di altri tessuti perché inizia a coagulare immediatamente dopo la morte.
    3. Processare il sangue del mouse, l'aliquota e memorizzare il plasma come nel punto 5.2.2.
      1. In un secondo momento, valutare la concentrazione di citochine esogena nel plasma ottenuto in eutanasia tramite ELISA secondo il protocollo del produttore. Valutare e confrontare le concentrazioni di citochine esogene nel plasma del topo dalla serie in vivoLa raccolta del sangue ei campioni di plasma di eutanasia (descritti nel paragrafo 5.3).
    4. Aggiungere PBS al residuo campione di sangue per sostituire il volume e il processo del plasma come descritto nei passaggi 6.3.1 e 6.3.2. Effettuare immediatamente i test di citometria a flusso o risospendere le cellule in mezzo di congelamento per lo stoccaggio LN 2 .
  2. Raccogliere midollo osseo (BM) e milza da topi PDX e preparare sospensioni singole cellule come precedentemente descritto. 22
  3. Ottieni i conteggi di cellule per ogni campione di tessuto del mouse PDX utilizzando l'acido acetico del 3% con blu metilene (membrane delle cellule di lisi e RBC lasciando nuclei intatti di cellule viventi) in una diluizione 1: 1 e contare le cellule utilizzando un emocitometro. Tabulare il numero totale di cellule per i campioni di midollo osseo e milza per ciascun animale.
  4. Centrifugare le cellule (500 xg, 15 min) e decantare il surnatante. Eseguire test di flusso-citometria di midollo osseo e / o cellule della milza immediatamente o riposizionare in mezzo di congelamento per LN 2 stoccaggio.
    NOTA: congelare 10 aliquote BM (per i prossimi dosaggi biochimici) e ~ 5 aliquote della milza (per i futuri trapianti PDX) per mouse.
  5. Immunofenotipizzazione per identificare effetti funzionali in vivo
    1. Preparare un master-mix (MM) di anticorpi di citometria a flusso di immunopenotipo popolazione popolazione ematopoietica responsabile alla citochina di interesse e un secondo MM degli anticorpi di controllo isotipo ( Figura 5 e Tabella dei Materiali).
    2. Aliquote del tessuto PDX di scavo (bagno di perle di 37 ° C) preparato al punto 7.4.
    3. Lavare le cellule scongelate trasferendole in un tubo conico e aggiungendo almeno 3 volte il volume di PBS. Centrifugare (500 xg, 5 min) e decantare il surnatante.
    4. Ripetere il passo di lavaggio (7.5.3).
    5. Creare aliquote poolate prendendo ~ 10 μL-20 μL di ciascun campione PDX per il controllo non conservato, il controllo della vitalità e i controlli isotipici (vedere la nota 6.4.6). Macchiare tutti i campioni, tranne l'uControllato con un colorante di vitabilità fisso (marcatore a cellule morte), incubare e lavare secondo il protocollo del produttore.
    6. Macchiare ogni campione di cellule PDX con fenotipizzazione-MM secondo il protocollo standard di colorazione della citometria a flusso; Allo stesso modo macchiare i campioni di controllo isotipo poolato con l'isotipo-MM. Incubare tutti i campioni, lavare con PBS e fissare i campioni ri-sospendere in 1% di paraformaldeide.
    7. Raccogliere i dati della citometria a flusso e analizzare i dati utilizzando una strategia di gating appropriata per le popolazioni di cellule interessate ( Figura 5 ). Un cancello tipico è il seguente:
      1. Definire le celle intatte tracciando una porta FSC e SSC che esclude i detriti.
      2. Identificare la popolazione delle cellule viventi gating sulle cellule che sono negativi per il marker di cellule morte (questa è la "cellula vivente totale").
      3. Utilizzare sottocanne all'interno delle "cellule viventi totali" per definire le popolazioni cellulari con l'immunofenotipo desiderato (vedere la Figura 5).
      4. Ottenere ilFrequenza delle popolazioni di cellule sub-cellule entro il numero totale di cellule viventi dall'analisi della citometria a flusso. 6 , 21
    8. Calcolare il numero di cellule bersaglio in ciascun tessuto moltiplicando la frequenza del sottoinsieme di cellule B entro le cellule viventi totali (ottenute nel passaggio 7.5.6.4) dai conteggi totali di cellule vive per tessuto ottenuto nel passaggio 7.3 (sottoinsieme di cellule% B " Conteggio delle cellule emocitometriche ", vedi tabella 1 )
    9. Confronti i conteggi delle cellule delle popolazioni di cellule target tra topi PDX e topi PDX esprimenti citocina (TSLP +) per determinare gli effetti funzionali in vivo della citochina umana esogena ( Tabella 1 ).

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Risultati

Una panoramica del modello è mostrata in Figura 1 . Una volta ottenuti la produzione di citochine (TSLP + stroma) e lo stroma di controllo, vengono ampliati nella coltura. Prima dell'iniezione di stroma nei topi, il supernatante di cellule stromali viene valutato mediante ELISA per verificare la produzione di citochine ( Figura 2 ) e la citometria a fosfocondensazione (protocollo n. 3) per verificare l'attività della citochina prodotta dallo stro...

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Discussione

Questo manoscritto descrive un metodo semplice, veloce e relativamente conveniente per progettare PDX per esprimere la citochina umana esogena. La strategia qui descritta si basa su iniezioni intraperitoneali settimanali di una linea cellulare stromale trasfusa per esprimere la citocina umana, TSLP. Prima di eseguire i metodi qui descritti, sono stati generati stromi progettati per esprimere livelli elevati della citochina di interesse (TSLP) e dello stroma di controllo simile. Nei protocolli qui presentati, lo stroma v...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato da NIH R21CA162259, NIH R01CA209829, NIH P20 MD006988, NIH 2R25 GM060507, una borsa di studio Hyundai Hope on Wheels Hope, il Dipartimento di Patologia e Anatomia Umana, il Dipartimento di Scienze di Base e il Centro per le Disparità Sanitarie e la Medicina Molecolare presso la Loma Linda University School of Medicine e da una sovvenzione per promuovere la ricerca collaborativa e traslazionale della Loma Linda University (KJP). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del NIH.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagenti da laboratorio umidi 
T-25 Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks, capacità di 7 ml, area di coltura di 25 cm²Thermo Scientific / Fisher156367
T-75 Falcon Tissue Culture Treated Flask, capacità di 250 mL, area di coltura di 75 cm& sup2; e tappo ventilatoCorning Inc. / Fisher353136
Pallone trattato per colture tissutali T-150 Falcon, capacità 600 mL, 150 cm² area culturale & Tappo ventilatoCorning Inc. / Fisher355001
Pipette sierologiche da 10 mL Falcon357551
Provette coniche in polipropilene da 15 mLFisher05-539-12
Provette in polistirene a fondo tondo da 5 mLFalcon352054
Provette coniche in polipropilene da 50 mLFalcon352098
fiale criogeniche da 2,0 mL, filettati esternamenteCorning Inc. / Fisher4230659
Puntali per pipette da 1 mLFisher2707509
200 μ L puntali per pipette Denville ScientificP3020-CPS
10 μ L puntali per pipetteDenville ScientificP-1096-CP
con membrana SFCA, Nalgene Rapid-FlowFisher09-740-28D
2 NH2SO4  BioLegend423001
Dulbecco' s soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) senza calicium e magnesio, 1&Corning cellgro/ Mediatech21-031-CV
Human TSLP ELISA Max Deluxe SetBioLegend434204
3% acido acetico con blu di metileneStemcell Technologies7060
Trypan Blue Corning25-900-Cl
"Tripsina" 1x 0,25% Tripsina 2,21 mM EDTA in HBSSThermoFisher25-053
TWEEN 20 BioXtraSigma-AldrichP-7949
" R10" terreno di coltura cellulare, % del volume totale (per 565 ml)--Ricetta di laboratorio
RPMI, 88,5% (500 ml) Mediatech10-040-CV   
FBS, 9,9% (56 ml) Mediatech35-011-CV
L-glutammina, 0,99% (5,6 mL) Mediatech25-005-Cl
Penicillina-Streptomicina, 0,50% (2,8 mL) Mediatech30-002-Cl
2-Mercaptoetanolo, 0,10% (560 &; L) MP190242
" R20" terreno di coltura cellulare, % del volume totale (per 195 ml)--Ricetta di laboratorio
        RPMI, 76,84% (150  mL)vedi sopravedi sopra
        FBS, 20,49% (40 ml)vedi sopravedi sopra
        2 mM di L-glutammina, 1,02% (2 mL)vedi sopravedi sopra
        1 mM di Na piruvato, 1,02% (2 mLvedi sopravedi sopra
        Penicillina-Streptomicina,  0,51% (1 ml)vedi sopravedi sopra
        2-mercaptoetanolo, 0,10% (0,1 M),  0,10% (200 µ L)vedi sopravedi sopra
" Mezzo di congelamento", % del volume totale--Ricetta di laboratorio
" R10" medio, 45%vedi ricetta "R10"-
FBS, 20%vedi sopra35-011-CV
DMSO, 10%Corning25-950-CQC
D(-)(+)-Trealosio diidrato, 5%Fisher ScientificBP2687-100
NomeCompanyCatolog Number Commenti
Biologics 
"HS-27" HS-27A linea stromale umanaATCCCRL-2496
"CALL-4" MHH-CALL-4 linea cellulare, leucemia precursore delle cellule B umaneDSMZACC 337
" Topi NSG" ANNUIRE. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, maschio o femmina, età 6 – 8 settimaneJAX Mice # 005557
Linea cellulare MUTZ-5, leucemia umana da precursore delle cellule BDSMZACC 490
Proteina TSLP umana ricombinanteR & D Systems1398-TS-010
NomeAziendaCatolog NumeroComments
Flow cytomery antibodies (clone)*
Anti-mouse CD45 FITC (30F11)Miltenyi Biotec130-102-778
CD127 PE (MB15-18C9) (nome alternativo è IL-7Rα)Miltenyi Biotec130-098-094
CD34 APC (8G12)BD Biosciences340667
CD45 PE-Cy7  (HI30)eBioscience25-0459
"FVD" Colorante di vitalità fissabile  eFluor 780 eBioscience65-0865
Ig κ catena leggera FITC  (G20-193)BD Pharmingen555791
Ig λ catena leggera FITC (JDC-12)BD Pharmingen561379
IgD PE (IA6-2)BioLegend348203
IgM PE-Cy5 (G20-127)BD Biosciences551079
pSTAT5 PE,  topo anti-STAT5 (pY694)BD PhosphoFlow612567
Name AziendaCatolog NumeroComments
Altri materiali e attrezzature 
Transponder nano impiantabile per animali con canulaTrovan ID-100B(1.25)
Crema anestetica alla lidocaina EMLA (ottenere per prescrizione presso la struttura per la cura degli animali)prescrizione
BD ½ cc LO-DOSE U-100 Siringa da insulina 28G½  BD#329461
BD Provette Microtainer con K2EDTABD #365974
CentrifugaBeckman ColtroAlegra X-15R 
Tubi capillari FisherBrand (eparinizzati)Emocitometro Fisher Scientific22-260-950
Fisher02-671-6
MACSQuant Analyzer 10Miltenyi Biotec130-096-343
Gabbia per torta di topoBraintree Scientific, Inc.MPC-1
Illuminatore di coda di topo RecintoBraintree Scientific, Inc.MTI STD
Impianto Impugnatura PistolaTrovan IM-300 (1,25)
& micro; Quant Strumenti Bio-Tek Inc.MQX200
FlowJo FlowJo, LLCVersione 10
*Tutti gli anticorpi sono anti-umani se non diversamente specificato.
Unità filtranti monouso sterili ) Software di analisi per citometria a flusso

Riferimenti

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