Viene descritta una procedura di misura di riferimento per la quantificazione assoluta di Aβ1-42 nel liquido cerebrospinale umano basata sull'estrazione in fase solida e sulla spettrometria di massa tandem con cromatografia liquida.
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Articolo metodologico
Quantificazione assoluta di A?
In questo articolo
Sommario
Abstract
La malattia di Alzheimer (AD) è la malattia neurodegenerativa più comune tra gli anziani e rappresenta il 60-80% di tutti i casi di demenza. Attualmente, la diagnosi di AD si basa su test cognitivi ed esami dello stato mentale, ma il peptide amiloide-beta (Aβ) nel liquido cerebrospinale (CSF) è sempre più utilizzato negli studi clinici e in contesti. Come per la maggior parte dei biomarcatori proteici e peptidici, la quantificazione viene eseguita utilizzando tecniche basate su anticorpi, come il saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA). Tuttavia, la variabilità intra e inter-laboratorio di questi test ne ostacola l'uso come marcatore diagnostico nella routine clinica.
È stata sviluppata una procedura di misurazione di riferimento (RMP) indipendente dagli anticorpi basata sull'estrazione in fase solida (SPE) e sulla cromatografia liquida (LC)-spettrometria di massa tandem (MS/MS), in cui sono stati utilizzati peptidi Aβ stabili marcati con isotopi come standard interni, consentendo la quantificazione assoluta. Per le misurazioni è stato utilizzato uno strumento ibrido quadrupolo-orbitrap ad alta risoluzione. Il metodo consente la quantificazione del liquido cerebrospinale Aβ1-42 tra 150-4.000 pg/mL.
Introduzione
La malattia di Alzheimer (AD) è la forma più comune di demenza e colpisce circa 35 milioni di persone in tutto il mondo 1. Le caratteristiche neuropatologici della malattia ampiamente creduto di essere al centro della patogenesi sono grovigli neurofibrillari intracellulari di hyperphosphorylated proteina tau 2 e placche extracellulari costituito da (Ap) peptidi 3 aggregati beta-amiloide. In linea con questo, la valutazione della patologia placca in vivo da biomarcatori è stato recentemente inserito nei criteri diagnostici di ricerca per AD 4. Per misurazioni CSF d....
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Protocollo
NOTA: Questo protocollo richiede aliquote di almeno 50 ml, con una concentrazione di 50 mg / ml per ciascun peptide Ap, come materiale di partenza. I peptidi Ap vanno dissolte in 20% acetonitrile (ACN) e il 4% di soluzione di ammoniaca concentrata in acqua deionizzata (v / v) e conservati a 80 ° C.
Attenzione: Vedi Tabella 1 per le informazioni di sicurezza.
1. preparazione delle soluzioni
- Preparare 100 ml di 20% ACN e 4% ammoniaca concentrata in acqua deionizzata (v / v) diluendo 20 mL di ACN e 4 ml di ammoniaca concentrata (~ 25%) in acqua deionizzata. Regolare il volume finale a ....
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Risultati
Il setup piatto in Figura 1 è utilizzato per un piatto pieno di campioni. Se un minor numero di campioni sconosciuti sono da analizzare, il secondo calibratore, set RF, e QC deve essere posto dopo la prima metà dei campioni sconosciuti.
Come si vede nella figura 2, i calibratori sono vicini alla linea di regressione, con basse deviazioni standard. Questo metodo ha un livello inferiore di quant.......
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Discussione
Per il metodo descritto, invece di utilizzare una matrice surrogata, abbiamo usato il metodo surrogata analita 13, 14, 15, 16, che consente la calibrazione in CSF umano. L'approccio analita surrogato coinvolge due diversi standard marcati con isotopi. Uno (15 NAβ 142) è utilizzato per generare la curva di calibrazione in CSF umano, mentre un altro (13 CAβ <.......
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Dichiarazioni
JP e EP non riferiscono alcuna divulgazione. HZ ha fatto parte dei comitati consultivi di Roche Diagnostics, Eli Lilly e Pharmasum Therapeutics. KB ha lavorato come consulente o nei comitati consultivi di Fujirebio Europe, IBL International e Roche Diagnostics. HZ e KB sono co-fondatori di Brain Biomarker Solutions a Göteborg AB, una società di piattaforme basata su GU Venture presso l'Università di Göteborg.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato svolto per conto del Gruppo di Lavoro della Federazione Internazionale di Chimica Clinica sulle Proteine CSF, che ha la seguente composizione: Kaj Blennow (Presidente) e Henrik Zetterberg, Università di Göteborg, Svezia; Les Shaw e Magdalena Korecka, Università di Filadelfia, PA, USA; Ingrid Zegers, Istituto per i materiali e le misure di riferimento, Geel, Belgio; Piotr Lewczuk, Universitätsklinikum Erlangen, Germania; e Rand Jenkins, PPD Bioanalytical Laboratory, Richmond, VA, USA; Randall Bateman, Università di Washington, MO, Stati Uniti; e H Vanderstichele, Innogenetics NV, Gand, Belgio. Questo lavoro è stato anche parte del Global Consortiu....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette per microcentrifuga Eppendorf Protein LoBind, 0,5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Eppendorf Protein LoBind, 1,5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Eppendorf Protein LoBind, 2 mL | Eppendorf | ||
| Eppendorf Protein LoBind, 5 mL | Eppendorf | 0030 108.310 | |
| Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96 | Eppendorf | 951032905 | |
| Provette in polipropilene Micronic da 0,75 mL, | Micronic | utilizzate per la raccolta dell'eluato SPE, ma possono essere utilizzati altri dispositivi di raccolta, come le piastre a 96 pozzetti. | |
| Tappo in TPE diviso Micronic per tubi da 96 pollici | MP53026 | Micronic | per tubi Micronic. |
| Micronic Loborack-96 bianco con barra di copertura alta codificato | Micronic | MPW51015BC3 | Holder per provette Micronic. |
| Puntali Biohit Optifit 1,2 mL | Sartorius | 791210 | Utilizzati per raggiungere il fondo delle piastre LoBind deepwell (96 pozzetti). Anche altri suggerimenti stretti potrebbero funzionare. |
| Waters Oasis MCX 96 pozzi &; Acque a placca di eluizione | 186001830BA | ||
| Waters Piastra collettore | vassoio Waters | WAT058942 | |
| Waters Piastra di estrazione Collettore per Oasis Piastre a 96 pozzetti | Acque | 186001831 | |
| Soluzione di idrossido di ammonio, puriss. ISO, reag. Ph. Eur., ~25% NH3 base | Sigma-Aldrich | 30501-1L-D | |
| Acetonitrile, grado di gradiente HPLC UV lontano, 2,5 L | Fisher Scientific | A/0627/17X | |
| acido orto-fosforico 85%, ACS, ISO, Reag. Merck | Millipore | 1005731000 | |
| Guanidina cloridrato, 500 g | Thermo Scientific | 24110 | |
| Thermo Scientific Spettrometro di massa Orbitrap ibrido a quadrupolo Q-exactive Thermo | Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | Con Dionex Ultimate 3000 LC e autocampionatore in bundle. |
| Colonna monolitica Dionex ProSwift RP-4H (1,0 x 250 mm) | Dionex | 066640 | |
| Albumina sierica bovina, polvere liofilizzata, adatta per (per biologia molecolare), | Sigma-Aldrich | B6917 | |
| (1-42), Ultra pura, TFA | rPeptide | A-1002-2 | |
| 15N Beta-amiloide (1-42), | rPeptide | A-1102-2 | |
| uniformemente marcato13C Beta-Amiloide (1-42), Agitatori | rPeptide | A-1106-2 | |
| , TiMix 2 | Edmund Bü HLER | 6110 000 |
Riferimenti
- Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer's disease. N Engl J Med. 362 (4), 329-344 (2010).
- Braak, H., Braak, E. Evolution of the neuropathology of Alzheimer's disease. Acta Neurol Scand Suppl. 165, 3-12 (1996).
- Blennow, K., de Leon, M. J., Zetterberg, H. Alzheimer's disease. L....
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Ristampe e permessi
