Quantificazione assoluta di A? 1-42 In CSF Utilizzando un riferimento alla procedura di misurazione di massa spettrometrica

Summary

Viene descritta una procedura di misura di riferimento per la quantificazione assoluta di Aβ_1-42 nel liquido cerebrospinale umano basata sull'estrazione in fase solida e sulla spettrometria di massa tandem con cromatografia liquida.

Abstract

La malattia di Alzheimer (AD) è la malattia neurodegenerativa più comune tra gli anziani e rappresenta il 60-80% di tutti i casi di demenza. Attualmente, la diagnosi di AD si basa su test cognitivi ed esami dello stato mentale, ma il peptide amiloide-beta (Aβ) nel liquido cerebrospinale (CSF) è sempre più utilizzato negli studi clinici e in contesti. Come per la maggior parte dei biomarcatori proteici e peptidici, la quantificazione viene eseguita utilizzando tecniche basate su anticorpi, come il saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA). Tuttavia, la variabilità intra e inter-laboratorio di questi test ne ostacola l'uso come marcatore diagnostico nella routine clinica.

È stata sviluppata una procedura di misurazione di riferimento (RMP) indipendente dagli anticorpi basata sull'estrazione in fase solida (SPE) e sulla cromatografia liquida (LC)-spettrometria di massa tandem (MS/MS), in cui sono stati utilizzati peptidi Aβ stabili marcati con isotopi come standard interni, consentendo la quantificazione assoluta. Per le misurazioni è stato utilizzato uno strumento ibrido quadrupolo-orbitrap ad alta risoluzione. Il metodo consente la quantificazione del liquido cerebrospinale Aβ_1-42 tra 150-4.000 pg/mL.

Introduction

La malattia di Alzheimer (AD) è la forma più comune di demenza e colpisce circa 35 milioni di persone in tutto il mondo ^1. Le caratteristiche neuropatologici della malattia ampiamente creduto di essere al centro della patogenesi sono grovigli neurofibrillari intracellulari di hyperphosphorylated proteina tau ² e placche extracellulari costituito da (Ap) peptidi ³ aggregati beta-amiloide. In linea con questo, la valutazione della patologia placca in vivo da biomarcatori è stato recentemente inserito nei criteri diagnostici di ricerca per AD ^4. Per misurazioni CSF d....

Protocol

NOTA: Questo protocollo richiede aliquote di almeno 50 ml, con una concentrazione di 50 mg / ml per ciascun peptide Ap, come materiale di partenza. I peptidi Ap vanno dissolte in 20% acetonitrile (ACN) e il 4% di soluzione di ammoniaca concentrata in acqua deionizzata (v / v) e conservati a 80 ° C.

Attenzione: Vedi Tabella 1 per le informazioni di sicurezza.

1. preparazione delle soluzioni

1. Preparare 100 ml di 20% ACN e 4% ammoniaca concentrata in acqua deionizzata (v / v) diluendo 20 mL di ACN e 4 ml di ammoniaca concentrata (~ 25%) in acqua deionizzata. Regolare il volume finale a ....

Results

Il setup piatto in Figura 1 è utilizzato per un piatto pieno di campioni. Se un minor numero di campioni sconosciuti sono da analizzare, il secondo calibratore, set RF, e QC deve essere posto dopo la prima metà dei campioni sconosciuti.

Come si vede nella figura 2, i calibratori sono vicini alla linea di regressione, con basse deviazioni standard. Questo metodo ha un livello inferiore di quant.......

Discussion

Per il metodo descritto, invece di utilizzare una matrice surrogata, abbiamo usato il metodo surrogata analita ^{13, 14, 15, 16,} che consente la calibrazione in CSF umano. L'approccio analita surrogato coinvolge due diversi standard marcati con isotopi. Uno ⁽¹⁵ NAβ ₁₄₂₎ è utilizzato per generare la curva di calibrazione in CSF umano, mentre un altro ⁽¹³ CAβ <.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Provette per microcentrifuga Eppendorf Protein LoBind, 0,5 mL	Eppendorf	022431081
Eppendorf Protein LoBind, 1,5 mL	Eppendorf	022431081
Eppendorf Protein LoBind, 2 mL		Eppendorf
Eppendorf Protein LoBind, 5 mL	Eppendorf	0030 108.310
Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96	Eppendorf	951032905
Provette in polipropilene Micronic da 0,75 mL,	Micronic	utilizzate per la raccolta dell'eluato SPE, ma possono essere utilizzati altri dispositivi di raccolta, come le piastre a 96 pozzetti.
Tappo in TPE diviso Micronic per tubi da 96 pollici	MP53026	Micronic	per tubi Micronic.
Micronic Loborack-96 bianco con barra di copertura alta codificato	Micronic	MPW51015BC3	Holder per provette Micronic.
Puntali Biohit Optifit 1,2 mL	Sartorius	791210	Utilizzati per raggiungere il fondo delle piastre LoBind deepwell (96 pozzetti). Anche altri suggerimenti stretti potrebbero funzionare.
Waters Oasis MCX 96 pozzi &; Acque a placca di eluizione		186001830BA
Waters Piastra collettore	vassoio Waters	WAT058942
Waters Piastra di estrazione Collettore per Oasis Piastre a 96 pozzetti	Acque	186001831
Soluzione di idrossido di ammonio, puriss. ISO, reag. Ph. Eur., ~25% NH3 base	Sigma-Aldrich	30501-1L-D
Acetonitrile, grado di gradiente HPLC UV lontano, 2,5 L	Fisher Scientific	A/0627/17X
acido orto-fosforico 85%, ACS, ISO, Reag. Merck	Millipore	1005731000
Guanidina cloridrato, 500 g	Thermo Scientific	24110
Thermo Scientific Spettrometro di massa Orbitrap ibrido a quadrupolo Q-exactive Thermo	Scientific	IQLAAEGAAPFALGMAZR	Con Dionex Ultimate 3000 LC e autocampionatore in bundle.
Colonna monolitica Dionex ProSwift RP-4H (1,0 x 250 mm)	Dionex	066640
Albumina sierica bovina, polvere liofilizzata, adatta per (per biologia molecolare),	Sigma-Aldrich	B6917
(1-42), Ultra pura, TFA	rPeptide	A-1002-2
15N Beta-amiloide (1-42),	rPeptide	A-1102-2
uniformemente marcato13C Beta-Amiloide (1-42), Agitatori	rPeptide	A-1106-2
, TiMix 2	Edmund Bü HLER	6110 000