Articolo metodologico

Preparazione del tessuto cerebrale Primate non umano per la pre-embedding immunoistochimica e microscopia elettronica

DOI:

10.3791/55397

⸱

3 aprile 2017

 , 
1Centre de recherche de l'Institut universitaire en santé mentale de Québec, Department of Psychiatry and Neuroscience, Université Laval, 2Centre de recherche du CHU Sainte-Justine

In questo articolo

Sommario

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Qui, forniamo un semplice, a basso costo, e in tempi rapidi protocollo fissiamo chimicamente tessuto cerebrale dei primati con acroleina fissativo, consentendo per la conservazione a lungo termine che è compatibile con pre-embedding immunoistochimica per microscopia elettronica a trasmissione.

Abstract

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Nonostante tutti i progressi tecnologici a livello microscopia ottica, microscopia elettronica rimane l'unico strumento in neuroscienze per esaminare e caratterizzare dettagli ultrastrutturali e morfologiche dei neuroni, come i contatti sinaptici. Buona conservazione del tessuto cerebrale di microscopia elettronica può essere ottenuta con metodi rigorosi crio-fissaggio, ma queste tecniche sono piuttosto costosi e limitare l'uso di immunomarcatura, che è cruciale per comprendere la connettività dei sistemi neuronali identificate. Metodi freeze-sostituzione sono stati sviluppati per consentire la combinazione di crio-fissazione con immunomarcatura. Tuttavia, la riproducibilità di questi approcci metodologici di solito si affida a dispositivi di congelamento costosi. Inoltre, ottenendo risultati affidabili con questa tecnica è molto tempo e abilità impegnativo. Quindi, il tradizionale cervello chimicamente fissa, in particolare con acroleina fissativo, rimane un metodo tempo efficiente ea basso costo per combinare elettronimicroscopia con immunoistochimica. Qui, forniamo un protocollo sperimentale affidabile usando fissazione acroleina chimico che conduce alla conservazione del tessuto cerebrale primati ed è compatibile con pre-embedding immunoistochimica e trasmissione di elettroni esame microscopico.

Introduzione

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Microscopio ottico, tra cui confocale e microscopia a due fotoni, ha dimostrato di essere uno strumento efficace per studiare in processi neuronali in vivo, tra le altre cose 1, 2. Anche se la risoluzione spaziale tipica a livello (LM) Luce microscopica è di circa 200 nm, i recenti progressi tecnologici utilizzando diverse sorgenti luminose, quali ultravioletti estremi e soft microscopia a raggi X, sono notevolmente aumentate presente risoluzione risoluzione spaziale quasi 10 nm 3 , 4, 5. Altri progressi tecnologici nel campo dell'imaging comprendono combinati risonanza magnetica con istologia e fornire un nuovo metodo per misurare lo spessore della guaina mielinica in vivo, un parametro che era tradizionalmente misurabile solo a livello Microscopio Elettronico (EM) 6, 7. although questi progressi a livello LM forniscono un eccellente strumento per studiare processi viventi, una vista dettagliata e caratterizzazione di strutture, come contatti sinaptici, potrebbero essere ottenuti soltanto con EM, che offre una risoluzione che può raggiungere 0,5 nm. Tuttavia, l'osservazione al livello EM richiede i campioni morto e alterato in qualche modo, con fissativi chimici e processi di disidratazione, al fine di preservare il citoarchitettura. Così, esaminando campioni biologici ad alta risoluzione può essere difficile a causa di danni da radiazione dal fascio di elettroni, basso contrasto, deviazioni strutturali delle membrane, o anche la presenza di artefatti che possono verificarsi in seguito alla disidratazione ed epossidico incorporamento 8, 9, 10.

Conservando campioni nella loro forma nativa per l'analisi strutturale può essere ottenuto utilizzando "Cryo EM di sezioni vetrificati" o CEMOVIS, un approccio che sezionamentocoinvolge rapidamente congelamento e incorporare il campione in ghiaccio vitreo ed esaminando sezioni sotto EM ad una temperatura criogenica 11, 12. Questa procedura permette l'esame di campioni mentre sono ancora solido e completamente idratata, eliminando artefatti causati da disidratazione quindi elabora 13. Tuttavia, questo metodo richiede dispositivi aggiuntivi per crio-ultramicrotomia, nonché dispositivi aggiuntivi standard EM, al fine di consentire questa osservazione a temperature molto basse, che generano notevoli costi aggiuntivi. Inoltre, l'approccio CEMOVIS preclude l'uso di tecniche immunomarcatura, poiché gli anticorpi solito devono essere incubate a temperatura ambiente. In alternativa, è possibile combinare analisi ultrastrutturale con procedure immunoistochimiche utilizzando un approccio di congelamento-sostituzione, durante il quale i campioni crio-fissa sono lentamente scongelati mentre immerso nella chimica crio-protettivo e sono then incorporato in resine speciali, come ad esempio Lowicryls. Post-embedding immunomarcatura può quindi essere eseguita su tale materiale 12. Tuttavia, le tecniche di congelamento-sostituzione e crio-fissaggio sono in termini di tempo. Essi richiedono l'installazione di apparecchiature supplementari e richiedono ancora campioni esposti a solvente organico e un agente chimico che può alterare il citoarchitettura, nonostante l'uso di una bassa temperatura 14, 15. Quindi, nonostante tutti i progressi tecnologici sia a livello LM e EM, fissaggio chimico del tessuto cerebrale, in particolare con acroleina, rimane un metodo a basso costo e in tempi rapidi per combinare immunoistochimica con EM 16.

Negli ultimi decenni, molti tentativi sono stati fatti per trovare una miscela di aldeidi che forniscono la migliore conservazione dei tessuti. Prima di 1960, l'unico agente chimico che ha dato risultati accettabili per EM era tetrossido di osmio. Tuttavia, tetrossido di osmio è altamente tossico e costoso, precludendo il suo utilizzo attraverso il sistema vascolare per riparare organi come il cervello. Acroleina è stato introdotto alla fine del 1950 come un metodo affidabile per la conservazione dei tessuti animali adatto per EM osservazione delle strutture cellulari 17. Esso penetra il tessuto più profondamente e reagisce più rapidamente rispetto ad altri aldeidi quando utilizzate per il fissaggio mediante immersione e consente una buona conservazione dei componenti citoplasmatici, con minimo ritiro del tessuto 17. Tale caratteristica conferisce acroleina fissazione un evidente vantaggio rispetto ad altre aldeidi quando usato in tessuto fresco, permettendo una localizzazione più accurata di composti molecolari, come gli enzimi e altre proteine 18 vivente. Infatti, è stato convalidato attraverso gli anni come un metodo semplice, efficace e di basso costo di fissazione per visualizzazione a livello EM in molte specie, tra anfibi e roditori, come efficientemente stabiliZES peptidi e proteine, mantiene antigenicità e fornisce ultrastruttura relativamente intatto quando usato in combinazione con un altro aldeide fissativo 16, 18, 19, 20, 21. Protocolli per acroleina fissazione in roditori sono da allora stati standardizzati e ampiamente utilizzati, in particolare dal gruppo Pickel, per attuare doppio immunomarcatura per EM 16, 22. Alcuni gruppi hanno usato la fissazione acroleina nel tessuto cerebrale dei primati non umani 23. Tuttavia, a nostra conoscenza, non v'è un solo protocollo pubblicato che descrive in modo efficiente fissazione chimica con acroleina nei primati non umani che è compatibile con EM immunomarcatura 24.

In questo articolo, mettiamo a disposizione un metodo semplice e affidabile per risolvere in modo efficiente chimicamente non-humun cervello primati con acroleina, consentendo una conservazione a lungo termine potenzialmente insieme con pre-embedding immunomarcatura e EM trasmissione esame.

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Protocollo

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Etica Dichiarazione: Tutti i protocolli che coinvolgono gli animali sono stati approvati dal Comité de Protection des Animaux de l'Université Laval e sono stati realizzati in conformità con il Consiglio Canadese Guida di cura degli animali per la cura e l'uso di animali sperimentali (Ed. 2). Il protocollo qui descritto è stato ottimizzato per animali adulti di circa 800 g. I volumi di fissativo devono essere regolati in base alle dimensioni dell'animale.

1. Preparazione di soluzioni per transcardiac perfusione

  1. Preparare 1 L di una soluzione 50 mM sodio fosfato tamponata salina (PBS) secondo le seguenti fasi. Preparare la soluzione al massimo 24 ore prima perfusione e mantenere a 4 ° C fino al momento dell'uso.
    1. Misurare 800 ml di acqua distillata in un becher 1 L. Aggiungere 5,87 g di fosfato di sodio anidro bibasico (Na 2 HPO 4), 1,20 g di fosfato monobasico monoidrato sodio (NaH 2 PO 4 · H 2 O), e 9 gdi cloruro di sodio (NaCl). Mescolare per sciogliere.
    2. Regolare il pH a 7,4 aggiungendo gradualmente 5 N NaOH. Aggiungere acqua distillata per raggiungere un volume totale di 1 L.
      ATTENZIONE: NaOH è un composto chimico corrosivo. Indossare la adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI;. Camice da laboratorio, guanti, occhiali protettivi, ecc).
  2. Preparare 2 L di 4% paraformaldeide (PFA) secondo le seguenti fasi. Questa soluzione deve essere preparata al massimo 24 ore prima dell'intervento e mantenuto a 4 ° C fino al momento dell'uso.
    1. Misurare 1,5 L di acqua distillata in un 2-L becher. Aggiungere 23.48 g di fosfato di sodio anidro bibasico (Na 2 HPO 4) e 4,80 g di fosfato monobasico monoidrato sodio (NaH 2 PO 4 · 2 O H). Mescolare per sciogliere. Aggiungere acqua distillata per raggiungere un volume totale di 2 L.
    2. Riscaldare la soluzione sotto una cappa sfiato fino a quando la temperatura raggiunge circa 45 - 55 ° C. Non riscaldare a oltre 60 ° C.
    3. Aggiungere gradualmente 80 g di PFA alla soluzione e agitare fino a completa dissoluzione (circa 30 - 60 min). Continuare a monitorare la temperatura di tenerlo sotto i 60 ° C.
      ATTENZIONE: PFA è altamente volatile nella sua forma di polvere. E 'altamente tossico se a contatto con occhi e pelle ed è pericoloso in caso di inalazione o ingestione. Indossare PPE e utilizzare con cautela sotto una cappa sfiato.
    4. Raffreddare la soluzione fino a 4 ° C ed il filtro. Conservare a 4 ° C.
  3. Preparare 1 L di 3% acroleina in 0,1 M tampone fosfato (PB) secondo le seguenti fasi. La soluzione PB deve essere preparata al massimo 24 ore prima perfusione.
    ATTENZIONE: L'acroleina è altamente tossico se inalato e può produrre danni immediati. E 'anche corrosivo e altamente tossico se assorbito attraverso la pelle. E 'agente cancerogeno e mutageno. Indossare PPE appropriata e utilizzare sotto una cappa sfiato.
    1. Misurare 800 ml di acqua distillata. Aggiungere 8,66 g di fosfato di sodio anidro bibasico (Na 2 HPO 4) e 5,38 g di fosfato monobasico monoidrato sodio (NaH 2 PO 4 · H 2 O). Mescolare fino a quando tutti i sali si dissolvono. Aggiungere acqua distillata per raggiungere un volume totale di 1 L. Mantenere la soluzione a 4 ° C.
    2. Prima dell'intervento chirurgico, trasferire 900 mL della soluzione PB di un contenitore di vetro 1 L e aggiungere 30,94 ml di soluzione di acroleina 97% sotto una cappa sfiato. Aggiungere la soluzione PB di raggiungere un volume totale di 1 L e mescolate. Filtrare la soluzione e la tiene a 4 ° C.

2. transcardiac Perfusione e cervello dissezione

  1. Mantenere soluzioni sul ghiaccio durante l'intera procedura chirurgica. Preparare la pompa inserendo il tubo nella prima soluzione da usare (PBS; 50 mM) e ruotando la pompa fino aria rimane nel tubo. Per la perfusione transcardiaca di una scimmia macaco, utilizzare un ago G 21 e impostare il deflusso a circa 80 ml / min.
  2. Anestetizzare l'animale con un'iniezione intramuscolare di un mixture di ketamina (20 mg / kg), xilazina (4 mg / kg), e acepromazine (0,5 mg / kg). Mantenere l'animale sotto isoflurano (3%) sedazione.
  3. Fissare arti dell'animale a una tabella di sfiato.
  4. Con un bisturi, togliere la pelle fino alle ascelle. Tagliare i muscoli addominali. Utilizzare forbici pesanti chirurgiche per tagliare le nervature lateralmente evitando accuratamente gli organi vitali.
  5. Tagliare il diaframma con le forbici chirurgiche e sollevare la gabbia toracica per esporre il cuore. Una volta che il diaframma è tagliato, procedere rapidamente, poiché il cuore smetterà di battere in pochi minuti.
  6. Rimuovere il pericardio con una lama di bisturi e inserire l'ago nel ventricolo sinistro. Con un bisturi, fare attenzione un piccolo escissione all'atrio destro. avviare rapidamente la pompa a 72 ml / min e tenere l'ago in posizione. Se possibile, inclinare l'animale in modo da avere la sua testa su un livello più basso rispetto al cuore.
    NOTA: Fare attenzione a non forare il setto interventricolare quando si inserisce l'ago.
    1. Rinse il sangue con circa 300 ml di PBS fino a quando i polmoni sono bianchi e il sangue non esce l'atrio destro.
  7. Fermare la pompa, trasferire rapidamente il tubo / tubo alla soluzione acroleina 3%, e ricominciare la pompa. Aumentare gradualmente la velocità di pompaggio a 80 ml / min, una volta il cuore ha smesso di battere. Profumato circa 500 ml di soluzione di acroleina.
  8. Fermare la pompa, trasferire rapidamente il tubo alla soluzione PFA 4%, e ricominciare la pompa. Questo passaggio richiede circa 1 L di PFA.
    NOTA: Il fissaggio è completa quando gli arti anteriori sono rigidi e il collo è rigido.
  9. Tagliare la testa e sezionare con cura il cervello fuori dal cranio. Fare attenzione a non danneggiare il cervello con gli strumenti chirurgici. La perfusione è ottimale quando il cervello è pallido (senza tracce di sangue) e rigida (Figura 1A).
  10. Immergere il cervello intatto nel 4% PFA per 1 ora a 4 ° C.
  11. Serialmente tagliare il cervello con un raffreddamento vibratomo (4 ° C)nel piano desiderato in 50 sezioni micron di spessore e raccoglierli in PBS (0,1 M) (Figura 1B).
    NOTA: Questa fase può essere effettuata in vari modi secondo il protocollo desiderato. Emisferi possono essere separati prima vibratome taglio, o tutto mantenuto. Se il cervello è troppo grande per la piattaforma vibratome, può essere tagliato in blocchi più piccoli. Dopo questo passo, le sezioni possono essere conservati per un lungo periodo di tempo a -30 ° C in una soluzione antigelo in 40% PB (50 mM), 30% glicerolo, e il 30% di glicole etilenico.

Immunoistochimica 3. Pre-incorporamento (Figura 1C)

  1. Preparare una 4 L soluzione stock di Tris-Buffered Saline (TBS, 50 mM, pH 7.6) come segue.
    1. Misurare 2L di acqua distillata in un becher 4 L, aggiungere 24,23 g di trihydroxymethyl aminomethane (THAM; C 4 H 11 NO 3), e mescolare per sciogliere.
    2. Regolare il pH a 7,6 con circa 148 ml di 1 N HCl. L'acido deve essere aggiunto con Cautiper evitare di raggiungere un pH inferiore a 7,6. Il volume totale dovrebbe essere 4 L.
      ATTENZIONE: HCl è altamente corrosivo. Indossare i DPI appropriato.
  2. Seleziona sezioni (dal punto 2.11) contenente la regione di interesse per essere trattati per immunoistochimica EM.
  3. Lavare le sezioni libero di fluttuare 3x in PBS (0,1 M, pH 7,4) per 5 min a temperatura ambiente per sciacquare la soluzione antigelo.
  4. Preparare una soluzione allo 0,5% di NaBH 4 diluito in PBS.
    1. Pesare 0,05 g di NaBH 4 e diluire in 10 ml di PBS. Non coprire. Preparare questa soluzione al momento dell'uso.
  5. Incubare le sezioni nella soluzione appena preparata NaBH 4 per 30 minuti a RT. Agitare delicatamente. Non coprire.
  6. Lavare 3x in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente, a dondolo energicamente fino a nessuno dei gas di reazione rimane.
  7. Preparare una soluzione di blocco per EM con 2% appropriato siero normale e 0,5% gelatina di pesce freddo diluito in PBS.
    NOTA: La quantità should essere calcolato in modo da avere abbastanza per le seguenti tre fasi. Utilizzare un siero a base di una stessa specie animale ospitano l'anticorpo secondario. Evitare l'uso di metodi di recupero antigene o aggiunta di piccole quantità di Triton (per aumentare la penetrazione di anticorpi), in quanto tali metodi compromettono significativamente la qualità del tessuto.
  8. Incubare le sezioni nella soluzione bloccante per 1 ora a RT. Agitare delicatamente.
  9. Preparare la soluzione di anticorpo primario diluito nella soluzione di blocco.
    NOTA: La concentrazione dell'anticorpo primario è di solito uguale per LM immunoistochimica, ma si consideri che effettuano prove con diverse concentrazioni di anticorpi prima, come alcuni anticorpi primari possono non funzionare con acroleina. Se è così, è possibile utilizzare una combinazione di glutaraldeide (0,1-2%) e il 4% PFA per transcardiac perfusione e di ottenere risultati simili. Ottimizzare il tempo di incubazione e la temperatura pure.
  10. Incubare le sezioni in soluzione di anticorpo primariouna notte a RT con dolce dondolio. Utilizzare un tempo di incubazione precedentemente testato e la temperatura.
  11. Lavare le sezioni 3x in PBS per 5 minuti a temperatura ambiente con dolce dondolio.
  12. Preparare una soluzione 1: 1.000 di anticorpo secondario biotinilato diluito in soluzione di blocco.
    NOTA: L'anticorpo secondario deve essere sollevata contro la specie ospite utilizzati per generare l'anticorpo primario.
  13. Incubare le sezioni in soluzione di anticorpo secondario per 1,5 ore a temperatura ambiente. Agitare delicatamente.
  14. Preparare una soluzione di avidina-biotina-perossidasi (ABC) almeno 60 minuti prima della fine dell'incubazione anticorpo secondario.
    1. Utilizzare una pipetta calibrata per misurare 8,80 microlitri / ml delle soluzioni A e B e diluite in PBS.
    2. Oscillare leggermente per almeno 60 minuti a temperatura ambiente per consentire il legame tra le molecole avidina e biotina completa.
  15. Dopo l'incubazione in soluzione di anticorpo secondario, lavare 3x in PBS per 10 minuti a RT.
  16. Incubare le sezioni in modo da ABCluzione 1 ora a RT. Agitare delicatamente.
  17. Lavare una volta in PBS e due volte in TBS per 10 minuti a RT con dolce dondolio.
  18. Preparare una soluzione fresca di 0,05% 3,3'-diaminobenzidina (DAB) con 0,005% H 2 O 2 diluito in TBS.
    1. Pesare 12,5 mg di DAB e diluirlo in 25 ml di TBS freddo. Proteggere dalla luce.
      ATTENZIONE: La polvere DAB è altamente volatile e nocivo se inalato. Si è cancerogeno e teratogeno. Così, le donne incinte o che allattano non devono maneggiare il prodotto, anche se diluito. Utilizzare una maschera N95, quando la manipolazione e l'usura DPI.
    2. Filtrare la soluzione e aggiungere 4,5 ml di 30% H 2 O 2 al momento dell'uso.
  19. Incubare sezioni nella soluzione DAB per 3 a 7 minuti a temperatura ambiente. Agitare delicatamente.
    NOTA: Il precipitato marrone non deve essere troppo scura per evitare un elevato livello di colorazione di fondo. Il tempo di incubazione deve essere ottimizzato conseguenza.
  20. Arrestare la reazione lavando due volte in rapidaa freddo TBS, poi due volte per 10 min in TBS fredda a temperatura ambiente, seguito da due volte per 10 minuti in PB, con oscillazione lieve.
    NOTA: L'uso di PB (e non PBS) è critica per eliminare eventuali tracce di NaCl, come sarebbe reagire con cristalli osmio e forma.

4. Osmification and Embedding per Electron osservazione al microscopio

  1. Preparare una soluzione di 1% tetrossido di osmio (OsO 4) diluito in PB. Proteggere dalla luce.
    ATTENZIONE: Osmio è altamente tossico e non deve entrare in contatto con la pelle, gli occhi o la bocca e non deve essere inalato. Può causare la morte se ingerito. Dovrebbe essere usato soltanto sotto una cappa sfiato e con DPI appropriato.
  2. Incubare le sezioni in OsO 4 soluzione per 30 min a temperatura ambiente sotto il cofano sfiato (senza agitazione) e coprire con un foglio di alluminio per proteggere dalla luce. Completamente appiattire le sezioni prima di aggiungere la soluzione OsO 4.
    NOTA: Le sezioni diventano molto buio e riGID e deve essere manipolato con cura seguendo questo passo.
  3. Preparare resine epossidiche idrorepellente durante l'osmification.
    1. Aggiungere adeguate quantità di ciascun componente della miscela di resina epossidica (20 g di resina epossidica, 20 g di catalizzatore, 0,6 g di acceleratore e 0,4 g di plastificante) per una grande tazza di plastica. Mescolare con un bastone di legno o di pipetta di plastica fino ad ottenere un colore marrone omogeneo.
      NOTA: E 'fondamentale utilizzare la proporzione esatta di ogni componente.
    2. Trasferimento uguali quantità di tazze di alluminio di dimensioni appropriate, a seconda del numero di sezioni da processare. Lasciare riposare.
  4. Lavare le sezioni osmificated 3x in PB per 10 minuti a temperatura ambiente con bassa velocità a dondolo.
  5. Disidratare sezioni nel seguente serie di etanolo graduata per 2 minuti ogni 2 volte in 35% di etanolo; 1 volta ciascuno, 50, 70, 80, 90, e 95% di etanolo; e 3 volte in 100% di etanolo.
  6. Trasferire le sezioni per fiale di vetro per completare le dehydratiil processo incubando le sezioni 3 volte per 2 minuti in ossido di propilene.
    ATTENZIONE: L'ossido di propilene è un solvente organico volatile e altamente tossico. Può causare gravi danni agli occhi o la pelle in caso di contatto o se inalato o ingerito. È stato classificato come sostanza cancerogena di grado 2. Dovrebbe essere usato soltanto sotto una cappa sfiato e con DPI. E 'anche altamente infiammabile e deve essere tenuto lontano da qualsiasi fonte di calore.
    NOTA: Prima di questo passaggio, sezioni devono essere attentamente trasferiti in fiale di vetro, poiché l'ossido di propilene è un solvente organico ed è incompatibile con la plastica. A questo punto, le sezioni sono molto fragili e devono essere manipolati con cura. Le sezioni possono essere alternativamente trasferiti in fiale di vetro prima della fase 4.5.
  7. sezioni Trasferire accuratamente, uno per uno, nelle tazze in alluminio ed evitare il contatto con l'aria il più possibile. TV a incorporare sezioni in resina epossidica idrorepellente precedentemente miscelata e incubare una notte sotto la Venting cappa a RT.
    NOTA: A questo punto, le sezioni sono completamente disidratati e molto fragile e deve essere manipolato con cura.
  8. Utilizzo di olio minerale, preparare vetrini grasso rivestite assieme coprioggetto plastica unte.
  9. Ammorbidire la resina incubando tazze alluminio a 60 ° C per 12-15 minuti al massimo. appiattire attentamente le sezioni sul lato unta del vetrino. Posizionare il vetrino unta e con attenzione spingere fuori l'aria rimasta.
  10. Incubare i campioni a 60 ° C per 48 h.
    NOTA: E 'fondamentale per non superare i 48 h tempo di incubazione, come la resina diventerà troppo duro.
  11. Rimuovere il vetrino plastica.

5. Preparazione del campione per ultrasottile Sezioni e osservazione usando un microscopio elettronico a trasmissione

  1. Utilizzare binocolo per trovare la regione di interesse e tagliare un piccolo pezzo quadrangolare di circa 1 mm 2 con un bisturi.
  2. Depositare la punta di un blocco di resina ed incollare la qupiece adrangular su di esso (Figura 1C). Lasciare che la colla si asciughi per almeno 1 ora o durante la notte prima di sezionamento.
  3. Utilizzando un ultramicrotomo, tagliare il pezzo quadrangolare in 80 sezioni micron di spessore (Figura 1D).
    1. Posizionare il blocco di resina in una piattaforma ultramicrotomo in posizione verticale e, usando una lama di rasoio affilata, gradualmente tagliare ogni lato del blocco di resina per formare un trapezio con pareti lisce.
    2. Portare il piatto in posizione orizzontale e ruotare il blocco finché il lato più lungo del trapezio è rivolto verso il basso.
    3. Utilizzare un utensile di taglio di diamante o un coltello per tagliare vetro sulla superficie del pezzo quadrangolare. Impostare l'ultramicrotomo di taglio 300 um sezioni spesse a 1 mm / s. Regolare il coltello per essere verticalmente parallelo al pezzo quadrangolare e visualizzare un piccolo angolo orizzontale di circa 1 °.
      NOTA: Questo angolo consente all'utente di avvicinarsi il tessuto quasi parallela alla superficie del bbloccare, dove gli elementi immunolabeled hanno maggiori probabilità di essere trovati. Quando si utilizzano questi parametri con l'utensile di taglio di diamante, la resina mostra un colore bianco lucido. Quando viene tagliato il tessuto, si trasforma in un colore viola o verde.
    4. Utilizzare un diamante coltello 45 ° ultra dotato di una barca riempita con acqua distillata per tagliare 80 sezioni micron di spessore, lisciare sezioni passando sopra con un pezzo di carta assorbente punta in xilene, e raccogliere sezioni seriali sulle slot griglie Formvar rivestite con nichel o nude 150 griglie di rame maglia (Figura 1E).
  4. Posizionare le griglie in un contenitore griglia.
  5. Macchiare le griglie con citrato di piombo.
    1. Utilizzare una siringa da 5 ml e un filtro a siringa da 0,2 pm per preparare una soluzione 1: 1 di filtrato magazzino soluzione di citrato di piombo e acqua distillata filtrata. Proteggere dalla luce.
      NOTA: La soluzione stock di citrato di piombo deve essere fatta fresca ogni mese per evitare la formazione di Depos solidisuo. Vedere la scheda tecnica del materiale per lo stock di ricetta. Inoltre, se hanno bisogno di essere macchiato molte serie di griglie, cambiare la soluzione diluita quando diventa lattiginoso.
    2. Posizionare ogni griglia su una goccia della soluzione diluita, con la sezione a contatto con la soluzione. Incubare per 3 min.
    3. Utilizzare pinzette per tenere la griglia e sciacquare in due bicchieri contenenti acqua distillata.
    4. Rimuovere l'acqua in eccesso delicatamente con carta assorbente. Conservare le griglie in una scatola di griglia. Attendere 30 minuti prima di esaminare sezioni di microscopia elettronica a trasmissione (TEM; Figura 1F).

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Risultati

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In questa sezione, presentiamo risultati rappresentativi che sono stati ottenuti dopo l'osservazione, a livello EM trasmissione, di immunoistochimica tessuto cerebrale primate chimicamente fissato con una miscela del 3% acroleina e 4% PFA. Abbiamo raggiunto buona conservazione della ultrastruttura, come indicato dalla guaina mielinica relativamente intatto e la visualizzazione ordinata di doppi membrane (Figura 2A). Contatti sinaptici, oltre ad elementi neuronali dal mic...

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Discussione

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In questo articolo, presentiamo un protocollo affidabile per transcardiac perfusione di primati non umani e immunoistochimica pre-embedding adatto per l'esame del campione EM. Sebbene tipico crioconservati EM, come CEMOVIS, fornisce una buona conservazione della ultrastruttura cervello, limita anche l'uso di immunoistochimica 12. Altre tecniche, tra cui crio-sostituzione e tecnica Tokuyaso, consentono post-embedding immunoistochimica, ma queste tecniche sono costose a causa di ulteriori d...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio è stato sostenuto dalle scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada (NSERC, 401.848-2.011 a MP). MP ha ricevuto un premio alla carriera dal Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S). LE è stato il destinatario di una borsa di studio di dottorato dalle FRQ-S (FRQ-S 14D 29441). Ringraziamo Marie-Josée Wallman per l'assistenza tecnica.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Fosfato di sodio monoidrato bibasico anidro (Na2HPO4)Fisher scientificS374-500
Fosfato di sodio monobasico monobasico (NaH2PO4· H2O)EMScienceSX0710-1
Cloruro di sodio (NaCl)Fisher scientificS271-3
Idrossimetilamminometano (THAM)Fisher scientificT370-500
HCl EMDHX0603-3Diluizione 1 N. Il prodotto è corrosivo. Utilizzare con una protezione adeguata.
NaOHEMDSX0590-1Diluizione 5 N. Il prodotto è corrosivo. Utilizzare con una protezione adeguata.
Paraformaldeide (PFA)SigmaP6148diluizione al 4%. Il prodotto è altamente volatile nella sua forma di polvere e altamente tossico. Utilizzare con cautela sotto una cappa di ventilazione con protezione adeguata.
Acroleina (90%)Sigma110221diluizione del 3%. Il prodotto è altamente tossico. Utilizzare sotto una cappa di ventilazione con protezione adeguata.
Tavolo di sfiato per autopsiaMopecCE400
Pompa di perfusione elettronicaparmer cole masterflexL/S 7523-90
Ago (perfusione)terumo NN-1838R18 G 11/2
Agoterumo NN-2713R21 G 1/2
Ketamina20 mg/kg
Xilazina4 mg/kg
Acepromazina0,5 mg/kg
Bisturi
Lame per bisturiPiuma                   lancia201011                    J9913No.22 per chirurgia e No. 11 per
EM Forbici
Rongeurs
VibratomeLeicaVT 1200SCalibrare la lama prima di ogni utilizzo, quando il dispositivo lo consente
Vibratome lama di rasoioGilletteGIN 642107
GliceroloFisher scientificoG33-4diluizione del 30%
Glicole etilenicoFisher scientificE178-4diluizione al 30%
Boroidruro di sodio (NaBH4)SigmaS-9125
Siero di cavallo normale (NHS)Jackson immunoResearch Laboratories008-000-121Diluizione al 2%
Gelatina di pesce freddoAurion900.033Diluizione allo 0,5%. Il prodotto originale è concentrato al 40%
di anticorpi primari, SERTSanta Cruz biotechnologySC-14581/500 diluizione
Anticorpo primario, ChATChemicon (Millipore)AB144P1/25 diluizione
Anticorpo primario, THImmunoStar229411/1.000 diluizione
Anticorpo secondario biotinilato, capraVector laboratoriesBA-95001/1.000 diluizione
Anticorpo secondario biotinilato, topoVector laboratoriesBA-20001/1.000 diluizione
Vectastain elite ABC kitVector laboratoriesPK61008.8 &; L/mL di A e B ciascuno
3,3'-diaminobenzidina (DAB)SigmaD5637diluizione 0,05%. Il prodotto è altamente volatile nella sua forma di polvere e tossico. Non gettare i rifiuti nel lavandino.
Perossido (H2O2) 30%Fisher scientificH-3230,005% diluizione
Tetrossido di osmio (OsO4)Scienzamicroscopica elettronica2% 19152
4% 19150
La soluzione originale può essere 2 o 4%. Prestare attenzione a quale viene utilizzato per calcolare la diluizione finale dell'1%. Il prodotto è molto sensibile alla luce. L'osmio è altamente tossico. Utilizzare solo sotto una cappa di ventilazione con una protezione adeguata.
Resina epossidica idrorepellente DurcupanSigmaA: M resina epossidica (44611)
B: indurente 964 (44612)
C: acceleratore 960 (DY 060) (44613)
D: plastificante (44614) 		Polimerizzare 48 ore a 58 ° C prima di gettare i rifiuti.
Tazze in alluminioScienza microscopica elettronica70048-01
Alcoli commercialidi etanolo1019CDiluire in acqua distillata con concentrazione appropriata
Ossido di propileneScienza microscopica elettronica20401Solvente organico. Altamente volatile e tossico. Utilizzare sotto una cappa di ventilazione.
Vetrini in vetro medio non rivestiti laboratori diricerca sul cervello3875-FRSuperficie grassa con olio minerale
Film plastico (film di inclusione Aclar)Scienza microscopica elettronica50425-25Superficie grassa con olio minerale
UltramicrotomoLeica UC7EM UC7
Strumento di rifilatura del diamante (ultratrim)Diatomo UT 1081Può utilizzare il coltello di vetro in alternativa
Ultra 45° Coltello diamantatoDiatome Diatome MC13437dotato di una barca
XylenesFisher scientificX5SK-4
Griglie in rame da 150 maglie Scienzamicroscopica elettronicaG150-cu
grid-boxScienza microscopica elettronica71138Può memorizzare fino a 100 griglie
Citrato di sodioAnachemia81983
Nitrato di piomboSigmaL-6258Fare una soluzione madre di citrato di piombo composta da 1,33  g di nitrato di piombo e 1,76  g di citrato di sodio diluito in 42  mL di acqua distillata prebollita e raffreddata a cui 8  mL di 1  N NaOH vengono aggiunti dopo che la conversione da nitrato di piombo a citrato di piombo è completa. Il pH dovrebbe essere di circa 12. Conservare la soluzione in una bottiglia di plastica ermetica e proteggerla dalla luce.
Siringaterumo SS-05L5 mL
Filtro per siringaCorning4312220,2 &; micro; m
Carta assorbente (carta bibulosa)Scienza microscopica elettronica70086-1
ParafilmPellicola da laboratorioPM-999
Olio mineraleSigmaM5904
chirurgiche

Riferimenti

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