La valutazione simultanea di Emodinamica cerebrale e Light Scattering proprietà del In Vivo Cervello del cervello usando l'imaging di riflessione diffusa multispettrale

Summary

La valutazione simultanea dell'emodinamica cerebrale e delle proprietà di scattering della luce del tessuto cerebrale in vivo è dimostrata usando un sistema di diffusione multispectrale a riflessione diffusa.

Abstract

La valutazione simultanea dell'emodinamica cerebrale e delle proprietà di diffusione della luce del tessuto cerebrale di ratto in vivo è dimostrata utilizzando un sistema di imaging a riflettanza diffusa multispettrale convenzionale. Questo sistema è costituito da una sorgente di luce bianca a banda larga, una ruota portafiltri motorizzata con una serie di filtri di interferenza a banda stretta, una guida di luce, una lente di raccolta, un obiettivo zoom video e una telecamera monocromatica con dispositivo ad accoppiamento di carica (CCD). Una finestra cranica ellissoidale viene realizzata nell'osso del cranio di un ratto in anestesia con isoflurano per catturare in vivo immagini di riflettanza diffusa multispettrale della superficie corticale. La regolazione della frazione di ossigeno inspirato mediante un dispositivo di miscela di gas consente l'induzione di diversi stati respiratori come la normossia, l'iperossia e l'anossia. Viene quindi eseguita un'analisi di regressione multipla basata su simulazione Monte Carlo per le immagini di riflettanza diffusa multispettrale misurate a nove lunghezze d'onda (500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730 e 760 nm) per visualizzare le mappe bidimensionali dell'emodinamica e le proprietà di diffusione della luce del cervello di ratto in vivo.

Introduction

La formazione di riflessioni diffusive multispectrali è la tecnica più comune per ottenere una mappa spaziale di segnali ottici intrinseci (IOS) nel tessuto corticale. IOS osservati nel cervello in vivo sono principalmente attribuiti a tre fenomeni: varianti di assorbimento e dispersione della luce dovute all'emodinamica corticale, variazione dell'assorbimento a seconda della riduzione o ossidazione dei citocromi nei mitocondri e variazioni nelle proprietà di dispersione della luce indotte da alterazioni morfologiche ¹ .

La luce nel visibile (VIS) ad infrarosso vicino (NIR) gamma spettrale è efficacemente assorbita e dispersa dal tessuto biologico. Lo spettro di riflessione diffusa del cervello in vivo è caratterizzato da spettri di assorbimento e dispersione. I coefficienti di dispersione ridotti μ _s ' del tessuto cerebrale nella gamma di lunghezze d'onda VIS-NIR portano ad una mostra monotona di spettro di dispersioneing grandezze più piccole a lunghezze d'onda più lunghe. Il ridotto coefficiente di diffusione spettro μ _s '(λ) può essere approssimata essere nella forma della funzione di legge di potenza ^{2, 3} come μ _s' (λ) = a × λ ^-b. La potenza della dispersione b è correlata alla dimensione del scatterers biologici nel tessuto ^{2, 3} vivente. Alterazioni morfologiche del tessuto e riduzione della vitalità del vivente tessuto corticale possono influenzare la dimensione dei diffusori biologici ^{4, 5, 6, 7, 8, 9.}

Un sistema ottico per l'imaging multispettrale riflettanza diffusa può essere facilmente costruito da un li incandescenzafonte combattere, componenti ottici semplici, e un dispositivo monocromatico carica-(CCD). Pertanto, vari algoritmi e sistemi ottici per l'imaging multispettrale riflettanza diffusa sono stati utilizzati per valutare l'emodinamica corticali e / o morfologia tissutale ^{10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18.}

Il metodo descritto in questo articolo è usato per visualizzare sia la proprietà di diffusione della luce di tessuto cerebrale di ratto in vivo usando un sistema di imaging riflettanza multispettrale diffusa convenzionale emodinamica e. I vantaggi di questo metodo rispetto tecniche alternative sono la capacità di valutare le variazioni spazio-temporali in entrambi emodinamica cerebrale e tessuto corticalemorfologia, così come la sua applicabilità a vari modelli animali disfunzione cerebrale. Pertanto, il metodo sarà opportuno per le indagini di lesione traumatica cerebrale, crisi epilettiche, ictus e ischemia.

Protocol

La cura degli animali, la preparazione e i protocolli sperimentali sono stati approvati dal Comitato di Ricerca sugli Animali dell'Ateneo di Tecnologia e Tecnologia di Tokyo. Per questa metodologia, il ratto è alloggiato in un ambiente controllato (24 ° C, 12 h ciclo luce / scuro), con alimenti e acqua disponibile ad libitum.

1. Costruzione di un sistema di immagini riflessione diffusa multispettrale convenzionale

1. Montare nove filtri di interferenza ottica a banda stretta con lunghezze d'onda centrali di 500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730 e 760 nm ai fori filtranti della ruota filtro motorizzata.
2. Costruire un sistema di imaging multispectral utilizzando una sorgente luminosa a banda larga a banda larga, una ruota filtrante motorizzata con l'insieme di filtri a interferenza a banda stretta, una guida leggera, una lente di raccolta, un obiettivo di zoom video e una fotocamera CCD monocromatica. La disposizione dei componenti ottici, mostrata in Figura 2 , può essere indicata per la thè procedura costruzione.
   NOTA: L'angolo di illuminazione è di circa 45 ° rispetto alla superficie del campione.
3. Attivare la sorgente luminosa lampada alogena per illuminare la superficie del campione attraverso un filtro di interferenza, la guida di luce, e la lente di collezione.
4. Aprire il software operativo della camera CCD.

2. Preparazione animale

NOTA: In questo protocollo, il ratto non è stato utilizzato per i futuri esperimenti ed è stato sacrificato subito dopo le misurazioni di immagini multispettrali.

1. Collegare la porta di ingresso di una camera di induzione per la luce di uscita di una macchina di anestesia con un tubo. Collegare la porta di uscita della camera di induzione alla porta di ingresso della macchina per anestesia con un secondo tubo.
2. Posizionare il topo nella camera di induzione e indurre l'anestesia con isoflurano 5,0%. Mantenere l'anestesia ad una profondità tale per cui il ratto non risponde al pizzichi punta. Lower al 2,0% isoflurano mediante una manopola sulla macchina per anestesia.
3. Fissare la testa ratto in un telaio stereotassico. Allegare un boccaglio per l'anestesia al telaio stereotassico.
4. Collegare la luce di ingresso del boccaglio alla luce di uscita della macchina di anestesia con un tubo. Collegare la porta di uscita del boccaglio alla porta di ingresso della macchina per anestesia con un tubo.
5. Radere la regione testa al di là del sito di incisione prospettico utilizzando tosatrici fino a quando appare la superficie della pelle.
6. Eseguire un'incisione longitudinale di circa 20 mm, lungo la linea mediana della testa con un bisturi chirurgico (Figura 1 (a)) ed esporre il tessuto connettivo sottocutaneo (Figura 1 (b)).
7. Rimuovere il tessuto connettivo sottocutaneo utilizzando una curette tagliente o una pinza e tirarlo su entrambi i lati della testa per esporre l'osso del cranio (Figura 1 (c)).
8. Scavare un fosso ellissoidale con l'osso del cranio all'interno della Sutur cranicaes (sutura coronale, sutura sagittale, e sutura lambdoidea) utilizzando un trapano ad alta velocità (Figura 1 (d)).
9. Lentamente e omogeneamente scavare l'osso del cranio all'interno del fosso di usare il trapano ad alta velocità.
10. Premere leggermente sulla superficie del cranio assottigliato con la punta della pinza per stimare lo spessore e forza ossea dopo appare un vaso sanguigno cerebrale. Se la regione cranio assottigliata deprime facilmente, interrompere la riduzione delle ossa del cranio con il trapano ad alta velocità.
11. Tagliare la linea di confine ellissoidale del cranio assottigliata frammentario usando la punta della pinza o piccole forbici chirurgiche.
12. Rimuovere il cranio assottigliato dalla superficie del cervello lentamente e delicatamente con la pinza.
13. bagnare delicatamente la finestra del cranio con soluzione salina fisiologica e coprire con una lastra di vetro trasparente spessore di circa 0,1 mm.

3. Regolando la frazione di ossigeno inspirato

NOTA: Il Condi respiratoriazione può essere modificato regolando la frazione di ossigeno inspirato _(FiO2).

1. Utilizzando un tubo, collegare la prima porta di un connettore tubo a forma di Y (connettore 1) alla prima porta di un altro connettore tubo a forma di Y (connettore 2).
2. Collegare la luce di ingresso del boccaglio alla seconda porta del connettore del tubo 1.
3. Utilizzando un tubo, collegare la terza porta del connettore tubo 1 ad un dispositivo di monitoraggio ossigeno concentrazione.
4. Con un tubo, collegare la seconda porta del connettore tubo 2 all'apertura di uscita di una macchina per anestesia.
5. Utilizzando un tubo, collegare la terza porta del connettore tubo 2 verso l'uscita di un dispositivo di miscela di gas.
6. Collegare una luce di ingresso del dispositivo di miscela di gas ad alta pressione 95% O ₂ - 5% di CO ₂ bombola di gas utilizzando un tubo.
7. Collegare l'altra apertura di entrata del dispositivo di miscela di gas ad alta pressione 95% N ₂ - 5% bombola di CO ₂ utilizzando un tubo.
8. Modificare le portate di gas of O ₂ e N ₂ utilizzando le manopole rotanti sul dispositivo miscela di gas.
9. Controllare e regolare la FiO ₂ utilizzando il dispositivo di ossigeno del monitor concentrazione.

4. Acquisizione della riflettanza immagini multispettrali Diffuse

1. Acquisizione di immagini di riferimento
   NOTA: I componenti ottici utilizzati in questo esperimento, come la sorgente luminosa, fibra ottica, e rilevatori hanno le loro caratteristiche spettrali. Pertanto, l'intensità della luce passata attraverso questi componenti dovrebbe essere registrata come immagine di riferimento. L'immagine di riferimento è un'immagine presa con diffusore bianco standard illuminato con la luce dalla sorgente luminosa.
   1. Mettere il diffusore bianco standard sulla scena orizzontalmente.
   2. Fuoco l'obiettivo della videocamera sulla superficie del diffusore bianco ruotando la ghiera zoom sulla canna.
   3. Regolare il tempo di integrazione della fotocamera selezionando il valore appropriato dalladiscesa dei tempi di integrazione nel software operativo della telecamera in modo che la maggior quantità di luce produce un segnale che è circa il 75% dei conteggi massimi. Osservando l'istogramma dei valori di pixel, regolare il tempo di integrazione finché il livello di intensità del segnale è di circa il 75% dei conteggi massimi.
   4. Selezionare il comando "Salva" dal menu File per salvare l'immagine in un file.
   5. Modificare la posizione del filtro ruotando la ruota portafiltri.
   6. Salvare un'immagine alle altre lunghezze d'onda secondo il procedimento sopra descritto. Il nome del file deve identificare il campione e la lunghezza d'onda utilizzata (ad esempio, W500, W520, W540 ... W760).
2. Acquisizione di immagini di esempio
   Nota: Le immagini di intensità della luce riflessa diffusamente di cervello di ratto esposto a nove lunghezze d'onda vengono acquisite e memorizzate sul disco rigido di un personal computer utilizzando le stesse condizioni di acquisizione.
   1. Posizionare delicatamente la rSul palco e regolare lentamente il livello della scena in modo che la fotocamera possa concentrarsi sulla superficie del cervello del ratto.
   2. Selezionare il comando "salva" dal menu file per salvare un'immagine in un file.
   3. Cambiare la posizione del filtro ruotando la ruota del filtro.
   4. Salvare un'immagine alle altre lunghezze d'onda secondo il processo descritto in precedenza. Il nome del file deve identificare il campione e la lunghezza d'onda ( es. R500, R520, R540 ... R760).
3. Acquisizione di immagini scure
   NOTA: La telecamera CCD può generare un'intensità luminosa in risposta ad un segnale elettrico. Tuttavia, c'è qualche uscita minore dovuta al rumore nei circuiti elettrici e nei rivelatori, anche se la luce non entra nel rilevatore; Questo è chiamato rumore corrente scuro. Per misurare con precisione l'intensità spettrale della luce, il componente della corrente scura dovrebbe essere registrato come un'immagine scura e quindi sottratta dal segnale misurato. L'immagine scura è un'immagineN con il percorso della luce bloccato.
   1. Spegnere la sorgente luminosa della lampada alogena.
   2. Bloccare il percorso della luce al sistema di telecamere CCD utilizzando una piastra di schermatura.
   3. Selezionare il comando "salva" dal menu file per salvare un'immagine in un file. Il nome del file deve identificare il campione ( ad esempio, Dark).

5. Visualizzazione del contenuto di emoglobina e del parametro di scattering della luce

NOTA: Un insieme di immagini a riflessione diffusa multispettrale viene salvato sul disco rigido di un personal computer e analizzato in modalità non in linea. Viene quindi eseguita un'analisi multipla di regressione supportata da una simulazione di Monte Carlo ¹⁹ delle immagini a riflessione diffusa multispectrale a nove lunghezze d'onda (500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730 e 760 nm) per visualizzare la dimensione bidimensionale Mappe di concentrazione dell'emoglobina ossigenata, concentrazione dell'emoglobina deossigenata, concentrazione totale di emoglobina, saturazione cerebrale di ossigeno regionale e scatTering potere. L'algoritmo dettagliato è stato pubblicato nelle letterature ^{17, 18.}

1. Sottrarre l'immagine scura sia l'immagine di riferimento e l'immagine campione a ciascuna lunghezza d'onda.
2. Normalizzare l'immagine campione l'immagine di riferimento per ogni lunghezza d'onda λ. Il trattamento dell'immagine normalizzata come il diffuso immagine riflettanza R.
3. Calcolare l'assorbanza (densità ottica) immagine A prendendo il logaritmo del reciproco del diffuso immagine riflettanza R ad ogni lunghezza d'onda λ:
   (1)
4. Generare una matrice tridimensionale impilando le immagini assorbanza nell'ordine della loro lunghezza d'onda, dove x - piano y mostra le informazioni strutturali ottenute per la superficie del cervello e z -axis mostra le informazioni spettrali.
5. PeRformare un'analisi multipla di regressione per lo spettro di assorbanza A ( λ ) ad ogni coordinata xy.
6. Utilizzare lo spettro di assorbanza A ( λ ) come variabile dipendente e gli spettri di coefficiente di estinzione molare dell'emoglobina ossigenata ε _HbO ( λ ) e dell'emoglobina deossigenata ε _HbR ( λ ) come variabili indipendenti per la fase 5.5 (valori pubblicati per ε _HbO ( λ ) E ε _HbR ( λ ) sono fornite nella tabella 1 ).
7. Controllare le mappe bidimensionali (immagini) dei tre coefficienti di regressione multipla un _HbO , un _HbR e un ₀ .
8. Generare una matrice tridimensionale impilando le immagini dei coefficienti di regressione multipla nell'ordine un _HbO , un _HbR e un ₀ , dove il y mostra le informazioni strutturali ottenute per la superficie del cervello e la z -axis propone i molteplici coefficienti di regressione.
9. Calcolare la concentrazione ossigenata emoglobina C _HbO, il deossigenato concentrazione di emoglobina C _HBr, e la potenza di dispersione b dal set di regressione multipla coefficienti a _HbO, un _HBr, e uno ₀ ad ogni xy coordinate utilizzando le seguenti formule empiriche (ha valori di β _{HbO, i,} β _{HBr, i,} e β _{0, i} (i = 0,1,2,3) sono fornite nella Tabella 2):
   (2)
   (3)
   (4)
10. Controllare le mappe bidimensionali (immagini) della concentrazione di emoglobina ossigenata C _HbO, la concentrazione di emoglobina deossigenata C _HBr, e il potere di scattering b.
11. Calcolare una mappa bidimensionale del totale concentrazione di emoglobina C _HbT sommando C _HBO e C _HBr in ogni x - coordinata y.
12. Calcolare una mappa bidimensionale della saturazione dell'ossigeno cerebrale regionale RSO ₂ dividendo la concentrazione di emoglobina ossigenata C _HbO dalla totale concentrazione di emoglobina C _HbT in ogni x - coordinata y.

Results

Immagini spettrali rappresentative di riflettanza diffusa acquisito da cervelli di ratto in vivo sono mostrati in Figura 3. Le immagini a 500, 520, 540, 560, 570, e 580 nm visualizzare chiaramente una fitta rete di vasi sanguigni nella corteccia cerebrale. Il deterioramento del contrasto tra vasi sanguigni e il tessuto circostante osservata nelle immagini a 600, 730 e 760 nm riflette il minor assorbimento della luce da parte dell'emoglobina a lunghezze d'onda pi...

Discussion

Il passo più critico in questo protocollo è la rimozione della regione sottile di cranio per rendere la finestra cranica; Questo deve essere eseguito attentamente per evitare sanguinamenti imprevisti. Questo passo è importante per ottenere immagini di riflessione diffusa multispettrale di alta qualità con alta precisione. L'uso di uno stereomicroscopio è raccomandato per la procedura chirurgica, se possibile. Piccoli pezzi di spugna di gelatina sono utili per l'emostasi.

Il sistema o...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sorgente luminosa con lampada alogena da 150 W	Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tokyo, Giappone	LA-150SAE
Guida di luce	Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tokyo, Giappone	LGC1-5L1000
Lente di raccolta	Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tokyo, Giappone	SH-F16
Filtri di interferenza l@ 500 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Giappone	#65088
Filtri interferenziali l@ 520 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Giappone	#65093
Filtri interferenziali l@ 540 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Giappone	#65096
Filtri interferenziali l@ 560 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Giappone	#67766
Filtri interferenziali l@ 570 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Giappone	#67767
Filtri interferenziali l@ 580 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Giappone	#65646
Filtri interferenziali l@ 600 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Giappone	#65102
Filtri interferenziali l@ 730 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Giappone	#65115
Filtri interferenziali l@ 760 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Giappone	#67777
Ruota portafiltri motorizzata	Andover Corporation, NH, USA	FW-MOT-12.5
Telecamera CCD monocromatica a 8 bit	THE IMAGINGSOURCE, Germania	DMK21BU618. H
Obiettivo zoom video	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Giappone	VZMTM300i
Spectralon bianco standard con riflettanza diffusa del 99%	Labsphere Incorporated, North Sutton, NH, USA	SRS-99-020