Analizzando dendritiche Morfologia in colonne e strati

Summary

Qui mostriamo come analizzare dendritica instradamento dei neuroni midollo Drosophila in colonne e strati. Il flusso di lavoro comprende una tecnica di imaging dual-view per migliorare la qualità delle immagini e strumenti computazionali per tracciare, registrare mandrini dendritiche alla matrice di colonna di riferimento e per analizzare le strutture dendritiche nello spazio 3D.

Abstract

In molte regioni del sistema nervoso centrale, come le mosche lobi ottici e corteccia vertebrato, circuiti sinaptici sono organizzati in strati e colonne per facilitare il cablaggio cervello durante lo sviluppo e l'elaborazione delle informazioni in animali sviluppati. neuroni post-sinaptici dendriti elaborati nei modelli specifici del tipo a livelli specifici di sinapsi con opportuni terminali presinaptici. Il neuropil mosca midollare è composto da 10 livelli e circa 750 colonne; ogni colonna è innervato dal dendriti di oltre 38 tipi di neuroni midollo, che corrispondono con i terminali degli assoni di alcuni 7 tipi di afferenze in maniera specifica per tipo. La presente relazione illustra le procedure per l'immagine e analizzare dendriti dei neuroni midollo. Il flusso di lavoro prevede tre sezioni: (i) la sezione di imaging dual-view combina due pile immagine confocale raccolti a orientamenti ortogonali ad alta risoluzione di immagini 3D di dendriti in; (Ii) il dendrite tracciamento e la sezione di registrazione tracce dendritichepergole in 3D e registri tracce dendritiche nella matrice colonna di riferimento; (Iii) la sezione di analisi dendritica analizza i modelli dendritiche rispetto alle colonne e strati, tra cui la direzione di terminazione e la proiezione planare specifico strato di gazebo dendritiche, e deriva stime di frequenze ramificazione e terminazione dendritiche. I protocolli utilizzano plug-in personalizzati costruiti sulla MIPAV open-source (Medical Imaging elaborazione, l'analisi e la visualizzazione) di piattaforma e personalizzati toolbox nella lingua di laboratorio della matrice. Insieme, questi protocolli forniscono un flusso di lavoro completo per analizzare l'instradamento dendritica di Drosophila neuroni midollo in strati e colonne, per identificare i tipi di cellule, e determinare difetti di mutanti.

Introduction

Durante lo sviluppo, i neuroni dendriti elaborati in complesse ma stereotipati modelli ramificati per formare sinapsi con i loro partner presinaptici. modelli di ramificazioni dendritiche correlano con l'identità e le funzioni dei neuroni. Le posizioni di pergole dendritiche determinano il tipo di ingressi presinaptiche che ricevono, mentre il dendritica ramificazione complessità e dimensioni del campo governano il numero di input. Così, dendritiche proprietà morfologiche sono fattori determinanti per la connettività sinaptica e computazione neuronale. In molte regioni del cervello complessi, come le mosche lobi ottici e retina dei vertebrati, circuiti sinaptici ....

Protocol

Nota: Il protocollo contiene tre sezioni: dual-view di imaging (sezioni 1 - 3), tracciamento dendritiche e registrazione (sezioni 4 - 6), e l'analisi dendritiche (sezione 7 - 9) (Figura 1). I codici e file di esempio sono riportati nella Tabella dei materiali / attrezzature.

1. Dual-Image Acquisition

NOTA: Questo passaggio è progettato per acquisire due pile di immagini del neurone di interesse in orientamenti due ortogonali (orizzontali e frontali).

1. Preparare cervelli mosca che contengono scarsamente etichettati neuroni midollo (~ 10 cellule / cervello lobo) co....

Results

Utilizzando la procedura di imaging dual-view qui presentato, un cervello mosca contenente neuroni TM20 scarsamente etichettati è stato ripreso in due direzioni ortogonali. Prima di imaging, il cervello era macchiato di appropriati anticorpi primari e secondari per la visualizzazione GFP e fotorecettori assoni membrana-tethered. Per l'imaging, il cervello è stato montato prima secondo un orientamento orizzontale (Figura 2A, B). Un neurone TM20 GFP-etichettati e le circos.......

Discussion

Qui, mostriamo come immagine e analizzare pergole dendritiche di neuroni midollo Drosophila. La prima sezione, dual-view di imaging, descrive la deconvoluzione e la combinazione di due pile di immagine in una pila alta risoluzione. La seconda sezione, dendriti tracciamento e la registrazione, descrive il tracciamento e la registrazione dei dendriti dei neuroni midollo nella matrice colonna di riferimento. La terza sezione, analisi dendritica, descrive l'uso di script personalizzati per analizzare i modelli .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Huygens Professional	Scientific Volume Imaging	versione 16.05	per la deconvoluzione delle immagini (https://svi.nl).  software commerciale
MIPAV		versione 7.3.0	per la ricombinazione e la registrazione delle immagini (http://mipav.cit.nih.gov/); plugin MIPAV freeware
: PlugInDrosophila Plug-in	MIPAV freeware
: PlugInDrosophilaStandard ColumnRegistration.class			freeware
Imaris	Bitplane		per il tracciamento di neuriti e l'assegnazione di punti di riferimento per la registrazione delle immagini (http://www.bitplane.com); software commerciale
Vaa3D			per la visualizzazione di file swc ( https://github.com/Vaa3D/release/releases/); freeware
Matlab	Mathworks	R2014b	per l'analisi morfometrica dei dendriti (http://www.mathworks.com); software commerciale
Matlab toolbox: TREES1.14		v1.14	per l'analisi dei parametri morfometrici dendritici (http://www.treestoolbox.org/download.html);
freeware Matlab toolbox: Dendritic_Tree_Toolbox		v1.0	Per il calcolo dei parametri morfometrici (https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration). Freeware
Name	Company	Numero di catalogo	Comments
Sample files
SWC http://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html di definizione			del
fileI codici e i file di esempio per la combinazione di immagini e la registrazione			https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration
esempio di punto di riferimento			https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&modificationDate= 1471880596000&api=v2
Name	Company	Numero catalogo	Comments
Sistema informatico
MS Windows Windows 7 x64 o Macintosh OS X 10.7 o successivo			Processore quad-core a 64 bit da 3 GHz, RAM 16G (minima)
Opzionale: Quadro4000  Scheda grafica (o superiore)	Nvidia		per la visualizzazione stereografica dei dendriti.
Opzionale: NVIDIA 3D vision2	Nvidia		http://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html
Opzionale: display LCD a 120 Hz per NVIDIA 3D vision2			http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Reagenti per l'imaging
24B10 anticorpo	The Developmental Studies Hybridoma Bank	24B10
GFP Tag Antibody	Thermofisher Scientific	G10362
Goat anti-Rabbit (H+L), Alexa Fluor 488	Thermofisher Scientific	A11034
Goat anti-Mouse (H+L), Alexa Fluor 568	Thermofisher Scientific	A21124
VECTASHIELD Montaggio Antifade Medium	Vector Laboratories	H-1000
Montaggio  Argilla	Fisher	S04179
70% glicerolo in 1x PBS
Occhiali, alte prestazioni, D = 0,17  mm	Zeiss	474030-9000-000