Uso di dispositivi microfluidici misurare la durata della vita e cellulare fenotipi in singole cellule di lievito in erba

Sommario

Questo articolo presenta un protocollo ottimizzato per la produzione di chip microfluidici e la configurazione degli esperimenti microfluidici per misurare la durata di vita e fenotipi cellulari delle singole cellule di lievito.

Abstract

Il lievito in erba Saccharomyces cerevisiae è un importante organismo modello nella ricerca sull'invecchiamento. Gli studi genetici hanno rivelato molti geni con effetti conservati sulla durata della vita in tutte le specie. Tuttavia, le cause molecolari dell'invecchiamento e della morte rimangono sfuggenti. Per ottenere una comprensione sistematica dei meccanismi molecolari alla base dell'invecchiamento del lievito, abbiamo bisogno di metodi ad alto rendimento per misurare la durata della vita e quantificare vari fenotipi cellulari e molecolari in singole cellule. In precedenza, abbiamo sviluppato dispositivi microfluidici per tracciare le cellule madri di lievito in erba per tutta la loro durata di vita, eliminando le cellule figlie appena nate. Questo articolo presenta un metodo per la preparazione di chip microfluidici e per l'impostazione di esperimenti microfluidici. È possibile utilizzare più canali per tracciare contemporaneamente le cellule in condizioni diverse o da diversi ceppi di lievito. Una configurazione tipica può tracciare centinaia di cellule per canale e consentire l'imaging al microscopio ad alta risoluzione per tutta la durata della vita delle cellule. Il nostro metodo consente anche una caratterizzazione dettagliata della durata della vita, dei marcatori molecolari, della morfologia cellulare e della dinamica del ciclo cellulare delle singole cellule. Inoltre, il nostro dispositivo microfluidico è in grado di intrappolare una quantità significativa di cellule madri fresche che possono essere identificate mediante analisi delle immagini a valle, rendendo possibile misurare la durata della vita con maggiore precisione.

Introduzione

Erba lievito è un potente organismo modello nella ricerca sull'invecchiamento. Tuttavia, un test di durata della vita convenzionale nel lievito si basa su microdissezione, che non è solo lavoro intensivo, ma anche a basso throughput di ^{1, 2.} Inoltre, l'approccio tradizionale microdissezione non fornisce una vista dettagliata di varie caratteristiche cellulari e molecolari nelle cellule madri singole che invecchiano. Lo sviluppo di dispositivi microfluidici ha permesso una procedura automatizzata per misurare durata lievito nonché a seguire marcatori molecolari e diversi fenotipi cellulari per tutta la durata delle cellule madri ^{3, 4, 5, 6, 7, 8.} Dopo che le cellule di lievito vengono caricati in un dispositivo microfluidico, possono essere monitorati sotto un microscopio utilizzando temporali giri automaticie di imaging. Con l'aiuto di strumenti di elaborazione di imaging, diversi fenotipi cellulari e molecolari possono essere estratti ^{3, 6, 8,} compresa durata, dimensioni, reporter fluorescente, morfologia cellulare, le dinamiche del ciclo cellulare, ecc, molti dei quali sono difficili o impossibili da ottenere utilizzando il metodo microdissezione tradizionale. Dispositivi microfluidici hanno assunto un rilievo nella ricerca affinamento sui lieviti in quanto il loro sviluppo di successo di qualche anno fa ^{3, 4, 6, 7.} Diversi gruppi hanno pubblicato successivamente sulle variazioni dei disegni precedenti ^5, e molti laboratori di lievito hanno impiegato dispositivi microfluidici per il loro studio.

In una cultura di cellule in fase di crescita esponenziale, il numero di cellule madri di età compresa tra che sono disponibili per l'osservazione è miniscule. Pertanto, il principio di progettazione generale del dispositivo microfluidica per le misure di durata della vita è quello di mantenere le cellule madre e per rimuovere le cellule figlie. Uno di questi disegni si avvale del fatto che il lievito subisce divisione cellulare asimmetrica. Le strutture a cellule madri trappola dispositivo volontà grandi e permettono cellule figlie piccole per essere lavato via. Il chip microfluidico descritto in questo articolo utilizza un tampone morbido polidimetilsilossano (PDMS) (colonne pensili verticali) per intrappolare cellule madri (Figura 1). Dispositivi di tipo analogo sono stati riportati precedentemente ^{3, 4, 6, 7.} Questo protocollo utilizza una procedura semplice da fabbricare dispositivi microfluidici e un metodo cella di carico semplice che è ottimizzato per gli esperimenti time-lapse imaging. Uno dei parametri chiave del dispositivo microfluidico è la larghezza delle pastiglie PDMS utilizzati per cellule madri trappola. Il nostro device usa pastiglie più ampi che possono tenere più cellule madri sotto ogni pad, tra cui una frazione significativa di cellule madri fresche che possono essere monitorati per tutta la loro durata di vita. Oltre alle misurazioni durata della vita, questo protocollo è utile per esperimenti di imaging singola cellula time lapse quando le cellule devono essere monitorati per molte generazioni o quando un'osservazione tutta la durata della vita è necessaria.

Protocollo

1. Silicon Wafer Mold Fabrication

NOTA: La fotomaschera è stato progettato con il software AutoCAD e prodotto da una società commerciale. Questo disegno contiene tre strati di diversi modelli ( File supplementare 1 ). Le altezze di primo, secondo, e terzo strato sono circa 4 pm, 10 pm e 50 um, rispettivamente. Lo stampo wafer di silicio è stata creata dalla fotomaschera mediante litografia soft ^{9, 10.}

1. Cuocere un wafer di silicio a 200 ° C per 10 minuti per evaporare il vapore acqueo. cappotto centrifuga fotoresist negativo SU-8 sul wafer di silicio.
   NOTA: coat Spin SU-8 3005 a 5.000 giri al minuto per 30 s per generare il primo strato, SU-8 2010 a 3.000 rpm per 30 s per generare il secondo strato, e SU-8 3025 a 2.000 giri al minuto per 30 s per generare il terzo strato.
2. Soft-cuocere il wafer rivestito prima di tegli trasferimento modello. Allineare e esporre il wafer in modalità "contatto diretto" utilizzando un allineatore maschera.
   NOTA: Soft-cuocere il wafer per 2 min a 95 ° C per il primo strato, 3 min a 95 ° C per il secondo strato, e 15 min a 95 ° C per il terzo strato. Utilizzare la dose di esposizione a 100 mJ / cm ² per il primo strato, 130 mJ / cm ² per il secondo strato, e 200 mJ / cm ² per il terzo strato.
3. Dopo l'esposizione, post-cuocere il wafer e sviluppare utilizzando SU-8 sviluppatore. Essiccare il wafer utilizza una pistola N ₂ e duro-cuocere il wafer a 200 ° C per 30 min.
   NOTA: Lo stampo wafer di silicio è fissata a 15 cm di diametro plastica Petri piatto con del nastro adesivo, con il lato rivolto verso l'alto modello. Solitamente, abbiamo messo diverse strutture identiche di chip sullo stesso stampo che permette a più chip microfluidici per essere fabbricati contemporaneamente. Ogni stampo può essere riutilizzato molte volte per fabbricare chip microfluidici.

2. Microfluidicfabbricazione di chip

1. Mettere una barca pesa pulita su una bilancia e tarare la bilancia. Versare 50 g di base di PDMS nella barca pesare.
2. Aggiungere 5 g di PDMS agente di indurimento alla barca pesare (w / w rapporto di 1:10 alla base PDMS).
   NOTA: Questo volume è basato su 15 cm con piastra Petri con lo stampo. Regolare la quantità di reagente se si utilizza una piastra di Petri di dimensioni diverse.
3. Mescolare la base PDMS e l'agente di indurimento con una pipetta monouso. Iniziare dal bordo della barca di pesatura e si muovono lentamente verso l'interno. Mescolare accuratamente per alcuni minuti fino formano piccole bolle nella miscela; accurata miscelazione è essenziale per PDMS polimerizzazione.
4. Versare il composto lentamente nella capsula di Petri; la miscela deve coprire completamente lo stampo wafer di silicio.
5. Porre la capsula di Petri in un vuoto per 10 minuti per rimuovere tutte le bolle d'aria dalla miscela PDMS. Se le bolle rimangono sulla superficie della miscela, utilizzare una pipetta per far saltare fuori.
6. Incubare il siliciostampo wafer con PDMS in un forno a 75 ° C per circa 2 ore.
7. buccia delicatamente lo strato di PDMS polimerizzate fuori stampo wafer di silicio, evitando danni alla costruzione dello stampo wafer. In alternativa, tagliare il PDMS direttamente dallo stampo wafer di silicio con un margine minimo di 5 mm intorno al pattern usando una lama di rasoio industriale singolo bordo; buccia delicatamente lo strato PDMS dallo stampo wafer.
8. Posizionare il livello PDMS sul banco con il lato rivolto verso l'alto modello. Asportare accuratamente il chip individuo con una lama di rasoio industriale singolo bordo, mantenendo un adeguato margine dal bordo di ogni singolo chip per evitare danni costruzione.
9. Con il lato rivolto verso l'alto modello, utilizzare una penna punzone (ID 0,75 mm) per perforare verso il basso attraverso i cerchi ingresso e di uscita su ciascun lato dei canali.
   NOTA: Questi fori creano il percorso per il passaggio del fluido. Pertanto, è fondamentale passare attraverso i cerchi e punzone tutto il percorso attraverso lo strato PDMS. Assicurati cherimuovere le colonne PDMS dal foro.
10. Controllare ogni buco perforato inserendo di nuovo l'ago penna pugno nel foro. Assicurarsi che l'ago può uscire dall'altra parte, che indica che non v'è alcun blocco. Applicare del nastro alla superficie del modello, quindi rimuovere delicatamente il nastro per pulire le particelle di polvere. Ripetere questa operazione almeno tre volte. Lascia un pezzo pulito di nastro adesivo sui PDMS per mantenere la sterilizzazione.
11. Ripetere questa procedura sul lato opposto delle PDMS e lasciare l'ultimo pezzo di nastro adesivo sulla pure.
12. Preparare un vetro di copertura 24 mm x 30 mm con uno spessore di 0.13-0.17 mm. Spruzzare etanolo al 70% sul vetro e secco con depolveratore per sterilizzare la superficie; Inoltre, il vetro può essere lavato con acqua ed essiccato in autoclave con depolveratore.
13. Trasferire il vetrino coprioggetto e PDMS ad una piastra di plastica. Rimuovere il nastro adesivo dal PDMS e posizionare il lato modello rivolto verso l'alto. Evitare il contatto con la superficie del modello durante il trasferimento.
14. Posizionare la piastra di plastica nella macchina plasma. Applicare un trattamento al plasma di ossigeno per il PDMS e il vetrino coprioggetto per rendere le superfici idrofile con i seguenti parametri di funzionamento: esposizione, 75 s; stabilizzazione gas, 20 cc / min; pressione, 200; e potenza, 100 W.
15. posizionare accuratamente il PDMS sul vetro di copertura, che collega entrambe le superfici idrofile (le superfici affrontate durante il trattamento al plasma). Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria tra il PDMS e il vetro di copertura.
16. Incubare il chip PDMS in un forno a 75 ° C per almeno 2 ore.
    NOTA: microfluidica carenti possono causare perdite di liquido sul microscopio durante l'esperimento. Pertanto, è importante controllare il legame tra il PDMS e il vetro di copertura sollevando leggermente il PDMS dai bordi con pinzette. Delicatamente sollevando le PDMS non dovrebbero separarla dal vetro di copertura, che indica un legame di successo.

3. Preparazione per l'esperimento

1. preparazione del tubo.
   1. Immergere i tubi di ingresso e uscita in soluzione di etanolo al 70% separatamente 1 giorno prima preparazione di chip PDMS.
   2. Riempire una siringa da 5 ml con acqua in autoclave per lavare i tubi. Lavare ciascun tubo collegando il tubo sulla siringa e il lavaggio del tubo con acqua.
   3. Ripetere la fase di lavaggio, almeno 3 volte per pulire residui etanolo.
2. Esaminare i canali PDMS sotto un microscopio ottico con un obiettivo 10X per assicurarsi che la struttura è coerente e intatto. Stabilizzare il chip PDMS sulla piattaforma microscopio utilizzando nastro adesivo.
   NOTA: Fare chip multipli in una sola volta in fase 2 per garantire che non ci sono chip di backup, soprattutto se rendendo il dispositivo per la prima volta.
3. Riempire una siringa da 5 ml con acqua in autoclave. Fissare la siringa ad una pompa a siringa e inserire i tubi di ingresso e uscita corrispondenti. Impostare la velocità di lavaggio a 750 microlitri / h per risciacquare il chip per circa 10 min. Le bolle d'aria sui canali ramodevono essere lavati via durante questo periodo; se vi sono bolle rimanenti, regolare manualmente la velocità per eliminare le bolle.
4. Lievito preparazione del campione.
   1. Trasferire 1 ml di campione preparato lievito (OD ₆₀₀ 0,6-0,8) in due provette da 1,5 ml microcentrifuga e centrifugare per 5 min a 3000 x g.
   2. Rimuovere la maggioranza del surnatante da ogni provetta e combinare il resto per formare un campione da 0,5 mL.
5. Sospendere la pompa a siringa e rimuovere i tubi di ingresso dal chip PDMS.
6. invertire manualmente la pompa a siringa per aspirare una piccola bolla d'aria (1 a 2 cm di lunghezza) in ogni provetta di ingresso. Passare a succhiare nel campione di lievito; la bolla d'aria mostrerà il confine campione e indicare la quantità di campione è stato elaborato.
   NOTA: Evitare di succhiare il campione nella siringa.
7. Inserire il tubo di ingresso posteriore nel chip PDMS e riavviare la pompa per caricare le cellule ad una velocità di 750 ml / h.
8. Lasciare la siringa pompa per 10 min lan ed esamina la progressione carico cella sotto il microscopio; un carico di successo sarà cellule intrappolare inferiore più del 60% di sospendere pilastro.
9. Passare alla soluzione di alimentazione e regolare la velocità a 400 microlitri / h per la coltura delle cellule.
10. posizioni di osservazione Select per il microscopio.
    NOTA: Per le misure di durata della vita, le immagini sono state scattate una volta ogni 15 minuti da un microscopio ottico con un obiettivo 40x. Per l'analisi reporter fluorescente, immagini sono state prese una volta ogni 15 minuti con un microscopio a fluorescenza con un obiettivo olio 60X.

Risultati

Dopo gli esperimenti, le durate di vita di cellule e molti fenotipi cellulari e molecolari possono essere estratti dalle immagini time-lapse registrate. Poiché ci sono un certo numero di diverse caratteristiche che possono essere estratti da ciascuna cella, il primo passo dell'analisi è di annotare le cellule ed eventi, tra le posizioni ei confini delle celle e la tempistica dei vari eventi che vengono monitorati, quali come gli eventi in erba. Queste annotazioni che renderà più facile p...

Discussione

Il dispositivo PDMS deve essere preparata. Altrimenti, le bolle d'aria causate inserendo tubi nel dispositivo saranno difficili da rimuovere. Fase 3.4 è importante per migliorare l'efficienza di carico delle cellule concentrando le cellule. Per aumentare la velocità dell'esperimento, da 4 a 6 moduli sullo stesso chip PDMS collegati a pompe indipendentemente operativi sono tipicamente utilizzati per eseguire 4 a 6 diversi esperimenti (ceppi diversi o composizioni media) simultaneamente.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
3'' < Wafer di silicio 111>	Addison Engineering
SU-8 Serie 2000 e 3000	MicroChem
Sylgard® 184	ellsworth	2065622	Include la base di elastomero siliconico Sylgard® e l'agente indurente piastre
Petri	VWR	391-1502
Harris Uni-core™ punch (D.I. 0,75 mm)	Sigma-Aldrich
24 mm x 40 mm Vetro di copertura SLIP-RITE®	Thermo Fisher Scientific	102440
3M Scotch	Tape ULINE	S-10223
VWR® Lamette da barba	VWR	55411-050
etanolo puro, Koptec	VWR	64-17-5
Whoosh-Duster™	VWR	16650-027
Siringa BD da 5 ml (Luer-Lock™ Suggerimento)	Becton, Dickinson and Company	309646
Tubi a parete standard in PTFE (100 piedi, dimensioni AWG: 22, ID nominale: 0,028)	Azienda di fornitura di componenti	SWTT-22
Assortimento di aghi Azienda	di fornitura di componenti	NEKIT-1
Essiccatore	HACH	2238300
Forno da laboratorio	Fisher Scientific	13246516GAQ
Microscopio Nikon TE2000 con obiettivo 40X e 60X	Nikon
Zeiss Axio Observer Z1 con obiettivo 40X e 60X	siringa Zeiss
	Longerpump	TS-1B