Articolo metodologico

Utilizzando biosensori a base di enzimi misurare Tonic e Phasic glutammato in modelli murini di Alzheimer

DOI:

10.3791/55418

⸱

3 maggio 2017

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1Department of Psychology, West Virginia University, 2Department of Drug Discovery & Development, Auburn University, 3Department of Neuroscience, University of Kentucky Medical Center

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, descriviamo l'installazione, software di navigazione, e l'analisi dei dati per un metodo spazialmente e temporalmente precisa misurazione toniche e fasiche cambiamenti glutammato extracellulare in vivo utilizzando matrici di microelettrodi enzimatico (MEA).

Abstract

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interruzione Neurotrasmettitore è spesso una componente chiave di malattie del sistema nervoso centrale (SNC), giocando un ruolo nella patologia sottostante malattia di Alzheimer, il morbo di Parkinson, la depressione e l'ansia. Tradizionalmente, microdialisi è stata la tecnica più comune (lodato) per esaminare i cambiamenti neurotrasmettitore che si verificano in questi disturbi. Ma poiché microdialisi ha la capacità di misurare lenti cambiamenti 1-20 minuti durante ampie aree di tessuto, ha lo svantaggio di invasività, potenzialmente distruggere collegamenti intrinseci all'interno del cervello e una capacità di campionamento lento. Una tecnica relativamente recente, l'array microelettrodo (MEA), presenta numerosi vantaggi per misurare le variazioni dei neurotrasmettitori specifici all'interno delle regioni cerebrali discrete che si verificano, rendendo per un approccio spazialmente e temporalmente preciso. Inoltre, utilizzando MEA è minimamente invasiva, consentendo la misurazione di alterazioni neurotrasmettitori in vivo. Nel nostro laboratorio, abbiamo hāve stato specificamente interessati a cambiamenti del neurotrasmettitore, il glutammato, legati alla patologia il morbo di Alzheimer. Come tale, il metodo qui descritto è stato utilizzato per valutare potenziali interruzioni dell'ippocampo in glutammato in un modello di topo transgenico della malattia di Alzheimer. In breve, il metodo utilizzato prevede il rivestimento di un microelettrodo multisito con un enzima molto selettivo per il neurotrasmettitore di interesse e utilizzando siti autoreferenziali di sottrarre il rumore di fondo e interferenti. Dopo la placcatura e la calibrazione, il MEA può essere costruito con una micropipetta e abbassato nel regione del cervello di interesse utilizzando un dispositivo stereotassico. Qui, il metodo descritto comporta anestetizzante RTG (tauP301L) 4510 topi e utilizzando un dispositivo stereotassico di indirizzare con precisione sub-regioni (DG, CA1 e CA3) dell'ippocampo.

Introduzione

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Misurare alterazioni neurotrasmettitore nel cervello è uno strumento essenziale per neuroscienziati studiano le malattie del sistema nervoso centrale (SNC) che sono spesso caratterizzati da disregolazione neurotrasmettitore. Sebbene microdialisi in combinazione con la cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC / CE) è il metodo più diffuso per misurare le variazioni nei livelli di neurotrasmettitori extracellulari 1, 2, 3, 4, la risoluzione spaziale e temporale delle sonde da microdialisi può non essere ideale per neurotrasmettitori , come glutammato, che sono strettamente regolata nello spazio extracellulare 5, 6. A causa dei recenti progressi nel campo della genetica e di imaging, ci sono altri metodi che possono essere utilizzati per mappare glutammato in vivo. Utilizzando reporter glutammato fluorescenti geneticamente codificati (iGluSnFR) und immagini a due fotoni, i ricercatori sono in grado di visualizzare rilascio di glutammato da neuroni e astrociti in vitro ed in vivo 7, 8, 9. In particolare, questo permette di registrare da un campo visivo più ampio e non interrompe le connessioni intrinseche del cervello. Mentre queste nuove tecniche ottiche consentono la visualizzazione della cinetica glutammato e misurazione delle risposte evocate sensoriali e attività neuronale, non hanno la capacità di quantificare la quantità di glutammato nello spazio extracellulare in regioni cerebrali discrete.

Un metodo alternativo è la matrice microelettrodi enzimatico (MEA) che può selettivamente misurare i livelli di neurotrasmettitori extracellulari, quali glutammato, attraverso l'uso di un sistema di registrazione di auto-riferimento. La tecnica MEA è stato utilizzato per studiare le alterazioni di glutammato extracellulare seguenti cerebrali traumatichelesioni 10, 11, 12, invecchiamento 13, 14, stress 15, 16, epilessia 17, 18, morbo di Alzheimer 19, 20, e l'iniezione di un virale mimico 21 e rappresenta un miglioramento rispetto dei limiti spaziali e temporali inerenti microdialisi. Considerando microdialisi limita la capacità di misurare vicino alla sinapsi 22, 23, MEA hanno una risoluzione spaziale elevata che consente misure selettive di straripamento extracellulare glutammato vicino sinapsi 24, 25. In secondo luogo, la bassa risoluzione temporale di microdialisi (1 - 20 min) limita la capacità di indagare ladinamica veloce di rilascio di glutammato e la clearance si verificano nel millisecondo secondo intervallo 26. Perché le differenze nel rilascio o la clearance di glutammato non possono essere evidenti nelle misure di tonico, riposo livelli di glutammato, può essere necessario che il rilascio di glutammato e la clearance essere misurati direttamente. MEA tengono conto di tali misure a causa della loro elevata risoluzione temporale (2 Hz) e limiti di rilevabilità (<1 um). Terzo, MEA consentire l'analisi di variazioni subregionali neurotrasmettitori all'interno di una particolare regione del cervello, come l'ippocampo di ratto o topo. Ad esempio, utilizzando MEA possiamo separatamente bersaglio il giro dentato (DG), comu Ammonis 3 (CA3) e comu Ammonis 1 (CA1) dell'ippocampo, che sono collegati tramite un circuito trisynaptic 27, di esaminare le differenze subregionali glutammato extracellulare. A causa delle dimensioni di sonde microdialisi (1 - lunghezza 4 mm) e il danno causato per impiantazione 28 </ sup>, 29, le differenze subregionali sono difficili da affrontare. Inoltre, i sistemi ottici consentono solo la stimolazione tramite stimoli esterni, come ad esempio una stimolazione baffo o sfarfallio luce, che non consente la stimolazione subregionale 7. Un vantaggio finale di MEA rispetto ad altri metodi è la possibilità di studiare queste subregioni in vivo senza interrompere le loro connessioni estrinseche e intrinseche.

Qui, viene descritto come un sistema di registrazione (per esempio, FAST16mkIII) in combinazione con MEA, costituito da un microelettrodo multisito a base di ceramica, può essere differenzialmente rivestito sui siti di registrazione per consentire agli agenti interferenti essere rilevato e rimosso dal segnale analita. Dimostriamo anche queste matrici possono essere utilizzati per studi Amperometry-di regolazione in vivo glutammato all'interno della DG, CA3 e CA1 ippocampali subregioni di anestetizzato RTG (tauP301L) 4510 topi, un m comunemente usatoil modello Ouse della malattia di Alzheimer. Inoltre, forniamo conferma della sensibilità del sistema MEA alla dinamica veloci di rilascio di glutammato e di passaggio trattando i topi con riluzolo, un farmaco mostrato in vitro per diminuire il rilascio di glutammato e aumentare glutammato captazione 30, 31, 32, 33, e dimostrando queste rispettive variazioni in vivo nel modello murino tauP301L.

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Protocollo

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1. Rivestimento l'Array microelettrodo con enzimi o strato di matrice

  1. Preparazione della soluzione matrice proteica
    1. Pesare 10 mg di albumina sierica bovina (BSA) e trasferire alla provetta da microcentrifuga da 1,5.
    2. Aggiungere 985 ml di acqua distillata alla provetta contenente BSA. Mescolare la soluzione dal manuale di agitazione (ri-pipettaggio utilizzando 1.000 microlitri pipetta ~ 3 volte, fino a quando la BSA è sciolto).
      NOTA: non utilizzare vortex per miscelare la soluzione in quanto ciò può introdurre aria nella soluzione. Inoltre, impostare la pipetta ad un volume <1.000 ml (ad esempio 700 ml) per evitare l'introduzione di bolle d'aria. La soluzione può essere posta in una microcentrifuga se necessario.
    3. Una volta che la soluzione BSA viene sciolto, aggiungere 5 ml di soluzione di glutaraldeide al 25%. Miscelare la soluzione capovolgendo la provetta chiusa 3 - 5 volte. La soluzione risultante è 1% BSA con 0,125% glutaraldeide.
    4. Mettere da parte la solu matrice proteicazione per 5 min. La soluzione apparirà di colore giallo chiaro.
  2. Preparazione della soluzione enzimatica desiderata (ad esempio, glutammato ossidasi)
    1. Preparare la soluzione glutammato ossidasi aggiungendo acqua DI filtrata al liofilizzato, enzima purificato (ad esempio, 50 microlitri DI dell'acqua aggiunta a 25 unità di glutammato ossidasi per produrre 0,5 U / mL).
      NOTA: Soluzione Aliquotare magazzino (es, 1 mL) e memorizzare le aliquote in contenitori di dimensioni appropriate (ad esempio, 500 microlitri tubi microcentrifuga) a -20 ° C. Aliquote possono essere conservate per un massimo di 6 mesi in queste condizioni.
    2. Aggiungere 4 ml di soluzione BSA / glutaraldeide al tubo in aliquote microcentrifuga contenenti glutammato ossidasi. Miscelare la soluzione da manuale agitazione (re-pipettaggio con una pipetta 10 microlitri. La pipetta deve essere impostato il volume <5 mL). La soluzione risultante è 1% BSA, 0,125% di glutaraldeide e 0,1 U / mL glutammato ossidasi.Utilizzare la soluzione per rivestire immediatamente.
      Nota: glutammato ossidasi soluzione di rivestimento può essere usata solo entro 15 min. Sebbene diversi MEA possono essere rivestite con una soluzione preparata, si raccomanda di non superare la finestra di tempo utilizzabile per glutammato ossidasi. Il numero di elettrodi che possono essere rivestita entro 15 min vari. Generalmente, da 4 a 6 elettrodi possono essere rivestiti alla volta.
  3. Rivestimento MEA
    1. Tipicamente, cappotto una coppia di sito di registrazione (s) su un MEA con l'enzima desiderato (glutammato ossidasi) ed una coppia di sito di registrazione (s) (sito 'sentinella' (s)) diverso è rivestita con la proteina-matrice inattiva.
    2. Utilizzare blunt-tip Hamilton microsiringhe (ad esempio 10 microlitri) di MEA rivestire con L-glutammato ossidasi o soluzione di matrice proteica inattiva (BSA + glutaraldeide). Le procedure utilizzate per rivestimenti proteina-matrice enzima o inattive sono uguali.
    3. Pulire le siringhe, prima e dopo l'uso (3 risciacqui conacqua deionizzata, 3 risciacqui con metanolo, 5 risciacqui con acqua DI).
      NOTA: Dedicato siringhe sono usati per applicare strati di enzima (glutammato ossidasi) o proteina-matrice. Non usare la stessa siringa per una soluzione diversa. Si raccomanda di eseguire rivestimenti proteina-matrice prima rivestimenti enzimatici.
    4. Elaborare glutammato ossidasi o matrice proteica utilizzando una siringa da 10 microlitri Hamilton. Premere delicatamente lo stantuffo per erogare una piccola goccia di soluzione sulla punta della siringa (visualizzato usando un microscopio da dissezione).
    5. Utilizzando il microscopio da dissezione di indirizzare i siti di registrazione MEA, applicare la soluzione ai siti di registrazione appropriati contattando brevemente i siti di registrazione con la soluzione gocciolina / tallone, che rappresenta uno strato. Tre strati sono sufficienti sia per la proteina-matrice e il cappotto enzima. spessi strati possono ridurre la sensibilità del MEA.
    6. Aumentare la gocciolina soluzione verso l'alto e fuori i siti registrazioni (cioè lo Syringe punta non deve raschiare sulla superficie MEA).
    7. Impostare un timer per 1 min. Questo è il requisito minimo tra applicazioni di rivestimento al sito di registrazione (s). Consentire MEA enzima rivestite per curare a 4 ° C per 5-7 giorni.
    8. Registrare il numero di mani applicate, il tempo impiegato per applicare i rivestimenti, il numero di elettrodi, e un nome e data in un quaderno di laboratorio.

2. che placca con m-fenilendiammina per una migliore selettività

  1. Preparazione m-fenilendiammina dicloridrato soluzione (MPD)
    NOTA: Piatto strato esclusione, mPD, per evitare l'ossidazione della dopamina e altre grandi molecole interferenti (ad esempio, acido ascorbico), migliorando così la selettività del sensore di glutammato / H 2 O 2 sulle altre molecole potenzialmente interferenti.
    1. Misurare 50 ml di 0,05 M tampone fosfato salino (PBS) in un pallone tarato e trasferire 50 ml di 0,05M PBS ad una (150 mL) matraccio Erlenmeyer grande.
    2. Usando il tubo collegato ad un serbatoio di azoto (ad esempio, utilizzando il tubo collegato un eiettore pressione), collegare un puntale (es P200 punta) alla estremità aperta del tubo. Posizionare il tubo con la punta della pipetta allegato in soluzione PBS e coprire la soluzione liberamente con parafilm. Accendere azoto e delicatamente soluzione bolla per 20 min.
    3. Pesare 0,045 g di mPD.
      Attenzione: mPD è una sostanza potenzialmente cancerogena. Pesatura di mPD deve essere eseguito usando una scala contenuta all'interno di una cappa aspirante. Indossare guanti e maschera quando si utilizza mPD. Assicurarsi che il cappuccio è funzionale e che l'anta è tirato al livello di lavoro appropriato. Immediatamente superfici pulite che possono essere stati contaminati con mPD per evitare di macchiare permanente.
    4. Gorgogliando, trasferire tutto il mPD alla soluzione degassati PBS. Coprire l'apertura pallone con parafilm e la soluzione delicatamente turbolenza per sciogliere mPD in soluzione. Evitare aggressive la miscelazione o l'uso di un vortice in quanto così facendo può introdurre gas nella soluzione.
    5. Trasferire la soluzione in un bicchiere da 50 mL. Una barra di agitazione non è necessario.
  2. Galvanotecnica l'elettrodo
    1. Ottenere un elettrodo di riferimento. Utilizzare elettrodi di riferimento dedicati alla mPD placcatura soltanto. Utilizzare un elettrodo di riferimento diversa per le procedure di calibrazione.
    2. Posizionare il braccio di plastica del supporto di elettrodo di riferimento nel becher. Controlli le bolle d'aria nel vetro elettrodo di riferimento (non può essere in grado di vedere). flick delicatamente l'estremità distale dell'elettrodo di riferimento per rimuovere eventuali bolle d'aria sulla punta.
    3. Posizionare l'elettrodo di riferimento attraverso l'apertura nel braccio plastica e inferiore nel bicchiere contenente PBS. Assicurarsi che l'elettrodo di riferimento non tocchi il fondo del bicchiere.
    4. Collegare l'elettrodo di riferimento al headstage (es 2 pA / mV) e collegare (es connettore DIP) MEA essere piastra mPDd per headstage.
    5. Abbassare il MEA nella soluzione becher tale che solo la punta MEA viene immerso in soluzione. Non immergere le punte MEA in un liquido al di là del nero 'bolla' (l'isolante nero che si trova sopra la punta MEA). Ciò potrebbe danneggiare il MEA.
    6. Eseguire una taratura 'test' per verificare la funzionalità dei canali degli elettrodi e dalla linea della headstage.
      NOTA: Anche se le impostazioni hardware dovrebbero riflettere l'apparecchiatura in uso, i dettagli relativi alla analiti tipo / interferente e la concentrazione non devono essere inseriti per la calibrazione 'test'. Modalità di registrazione deve essere 'Amperometry' e 'V applicata' dovrebbe essere -0.7 V. Verificare registrazione tipico per tutti i canali.
    7. Annulla selezionando 'Cancella' quando la connettività di tutti i siti di registrazione è verificato. Non è necessario salvare i dati di calibrazione.
    8. Selezionare l'icona "Electroplating" sul desktop. La Galvanotecnica PerApparirà ol Menu. Verificare le impostazioni corrette vengono inseriti:
      ampiezza PP: 0.25
      Offset: -0.5
      Frequenza: 0.05
      Durata (min): 20
    9. Selezionare il pulsante 'pausa' per iniziare la placcatura. Il campo di tempo trascorso dovrebbe iniziare il conto alla rovescia.
    10. Al completamento (tutto il tempo trascorso), selezionare 'un'altra MEA' nel menu spuntato per iniziare mPD placcatura un MEA aggiuntivo. Sostituire il MEA placcato con un MEA da mPD placcato e ripetere la procedura di elettroplaccatura utilizzando lo strumento di elettroplaccatura.
      NOTA: Si consiglia di utilizzare la soluzione preparata mPD non più di 2 volte o entro un periodo di tempo 1 h. Preparare una soluzione fresca per preparare più di 2 MEA.
    11. Seleziona 'software uscita' per terminare galvanica. Risciacquare punte degli elettrodi mPD placcati con acqua deionizzata (per evitare residui di sale) e memorizzare (24 h) prima della calibrazione.
    12. Rimuovere l'elettrodo di riferimento dalla soluzione e sciacquare con acqua deionizzata prima di mettere nelle s appropriateSoluzione essa in riserva (ad esempio 3 M NaCl). Garantire l'elettrodo di riferimento viene immerso in soluzione. Lentamente inferiore elettrodo di riferimento in vetro nella soluzione per evitare di danneggiare il vetro.
    13. Smaltire la soluzione mPD in un contenitore per rifiuti pericolosi adeguatamente etichettati.

3. Calibrare il MEA per glutammato rilevamento e selettività (Figura 1) 21

  1. Preparazione delle soluzioni necessarie per la calibrazione.
    NOTA: Fare riferimento alla Tabella 1.
  2. Eseguire la taratura sotto costante agitazione (batteria magnetica agitatore azionato) a 37 ° C. Accendere la piastra elettrica o bagnomaria circolante e ottenere una piccola ancoretta. Mescolare lentamente ma abbastanza veloce che quando è fatto un'aggiunta (sotto), il nuovo altopiano è raggiunta rapidamente.
  3. Collegare il headstage (2 pA / mV) al sistema di controllo di registrazione e inserire la punta MEA in 40 mL di agitazione 0,05 M PBS (usate un becher da 50 mL).
  4. Collegare il relettrodo Riferimenti. Flick fine di garantire l'assenza di bolle d'aria.
  5. Aprire il programma di registrazione e fare clic su "Calibration". Assicurarsi che le impostazioni siano corrette (controllare che i siti sentinella sono selezionati in quanto ciò potrebbe cambiare con differenti elettrodi), scegliere il numero di MEA e premere "Start".
  6. Lasciare 5 - 10 minuti per equilibrio; iniziare una volta che la linea di base è stabilizzata (<0,004 nA / min cambiamento).
  7. Selezionare "Baseline" e aggiungere 500 ml di 20 mM di acido ascorbico (interferente; finale [250 pM]) e selezionare "interferente" (AA è pensato come interferente livello cerebrale) dopo che la corrente ha raggiunto un nuovo, plateau stabile, se qualunque. Lasciare 0,5-1 min tra le aggiunte. Se il MEA è correttamente elettrolitico, occorre osservare quasi nessun cambiamento.
  8. Aggiungere 40 ml di 20 mM L-glutammato (finale [20 micron]) e una volta che la corrente ha raggiunto un nuovo, plateau costante, segno 1 ° Oltre "Analita". Ripetere tre volte per un totale di 3 glutamate aggiunte.
  9. Aggiungere 40 ml DA. Non selezionare "Analita"; selezionare "Test Substance" - DA può essere solo un interferente nelle aree contenenti DA.
  10. Aggiungere 40 microlitri perossido. Non selezionare "Analita"; selezionare "Test Sostanza".
  11. Fare clic sul pulsante "Stop" una volta che la calibrazione è terminata.
  12. Per determinare la funzionalità del MEA, fare clic sulla scheda calcolo e registrare i seguenti parametri in un quaderno di laboratorio.
    1. Per la progettazione MEA (3,000 micron 2) utilizzato in queste calibrazioni, utilizzare un MEA con pendenza ≥ 0,004 nA / mM ma falde inferiori possono essere utilizzati per alcuni esperimenti. Se v'è meno di 10% di differenza di pendenza tra i siti degli enzimi rivestiti e non rivestiti, quindi utilizzare queste MEA per il rilascio evocato solo o pulire / scartare il MEA.
    2. Utilizzare un limite di rilevabilità (LOD) ≤ 1,5 micron. Se il LOD è superiore a 1,5 micron, quindi utilizzare queste MEA per releas evocatiee assorbimento solo. Non utilizzare questi elettrodi per registrare i livelli di tonico.
    3. Utilizzare una selettività per l'analita desiderato (cioè, glutammato) sul interferente di> 20 unità arbitrarie. Se la selettività è minore di 20, quindi pulire / scartare il MEA.
    4. Utilizzare una linearità (R 2) della curva di taratura di ≥ 0,90. Se la linearità è inferiore a 0,90, quindi pulire o scartare MEA.
  13. Salvare il file con il # del MEA, la data e le iniziali della persona di calibratura.

4. Montare la micropipetta

NOTA: micropipette (vetro capillare) dovrebbe avere una punta con un diametro interno di 10 - 15 um.

  1. Posizionare la micropipetta in posizione centrale tra tutti i siti di registrazione quattro platino e montare 50-100 micron al di sopra del MEA usando cera collante e plastilina.
  2. Per caricare la micropipetta, utilizzare una siringa da 1 ml riempita con glutammato o soluzione KCl, un 0,22 micron siringa sterile filteR, e un lungo di 97 mm, 28-gauge riempitivo pipetta, reinterro del micropipetta. Cioè, inserire l'ago nella parte superiore della micropipetta e riempire nella parte inferiore della micropipetta (dal lato d'MEA), assicurandosi che non ci siano bolle.
  3. Fissare la micropipetta al sistema espulsione pressione a 2 - 20 psi per circa 1 s.

5. Piastra la miniatura elettrodo di riferimento per In Vivo Usa

  1. Preparare la soluzione di placcatura (50 g NaCl / 90 mL 1 M HCl in un bagno 100 mL beaker (placcatura)) e tagliare l'elettrodo bagno (~ 10 cm di lunghezza di platino (Pt) filo (~ 0.02" diametro)).
  2. Tagliare un 10 - lungo pezzo di Teflon filo d'argento rivestito (0,008" nudo) 15 cm e utilizzare una lama di rasoio per raschiare ~ 1 cm di rivestimento in teflon da ciascuna estremità della estremità del filo d'argento.
  3. Saldare un perno oro su un'estremità e posizionare un'estremità del filo d'argento esposti nel bagno di placcatura.
  4. Utilizzando un adattatore di corrente continua (usare solo un adattatore di corrente continua con una potenza di 9 ~ -. 15 VDC max),serrare il (+) filo "rosso" al filo d'argento preparata (elettrodo di riferimento) sul lato del connettore oro. Bloccare il "nero" (-) al Pt vasca catodo.
  5. Collegare l'adattatore DC. Cercare il processo di placcatura corretta - bolle dovrebbero apparire all'elettrodo vasca; elettrodo di riferimento trasforma un / colore grigio argento.
    ATTENZIONE: Non accendere i conduttori [Nero (-) vs Red (+)] - placcatura bagno sarà rovinata se questo si verifica e dovrà essere fatta placcatura soluzione fresca. Una soluzione cattivo diventerà di colore giallo: NON USARE!
    NOTA: La placcatura reazione prende 2-5 min generalmente: Ag 0 + Cl - → AgCl + e -
  6. Testare l'elettrodo di riferimento.
    1. Impostare un multimetro per il 100 - impostazione 200 mV DC.
    2. Collocare un punto di riferimento (cioè, un elettrodo precedentemente testato notoriamente lavorazione) elettrodo di riferimento a 3 M NaCl e prova contro l'elettrodo di riferimento appena placcato.
      NOTA: Se noiing un nuovo elettrodo di riferimento, immergerlo in 3 M NaCl prima dell'uso (12 h raccomandato).
    3. Posizionare il (+) del "rosso" sul perno oro dell'elettrodo di riferimento da testare. Posizionare il "nero" (-) conduttore su elettrodo di riferimento. Un campo di visualizzazione accettabile è ± 10 mV. 0 mV è ideale attraverso gli elettrodi di riferimento 2.

Chirurgia 6. Animal generale MEA Recordings

  1. Preparazione per la chirurgia
    1. Mettere gli strumenti di chirurgia nel disinfettante la sera prima.
    2. Rimuovere gli strumenti dal disinfettante e risciacquare accuratamente e posizionare gli strumenti in un tampone chirurgico sterile. Ottenere una piastra elettrica.
    3. Calibrare due elettrodi e collegare la micropipetta come descritto nelle procedure 3 e 4.
    4. Rendere l'elettrodo di riferimento come descritto nella Sezione 5.
    5. Fare 200 micron glutammato e 70 mm KCl. Fare riferimento alla Tabella 1.
    6. Ottenere l'animale e registrare il suo peso su fogli di chirurgia.
    7. Preparare l'anestesia e accendere il tappetino riscaldamento.
  2. Eseguire un intervento chirurgico MEA
    1. Utilizzando isoflurano (flusso 4% di ossigeno), anestetizzare l'animale in una camera di induzione finché la frequenza respiratoria è notevolmente diminuita e l'animale non risponde ai piedi o tail pinch. frequenza respiratoria Record e la temperatura corporea ogni 15 min.
    2. Posto l'animale nel dispositivo stereotassico utilizzando le barre di auricolari per stabilizzare la testa. Assicurarsi che l'animale è sicuro e la testa non si muove. Abbassare il flusso isoflurano al 1,5-3% di ossigeno. Assicurarsi che il pad di riscaldamento sia correttamente posizionato sotto l'animale e impostato a 37 ° C per fornire calore supplementare. Il mancato conferimento calore supplementare può provocare una profonda ipotermia e morte prematura dell'animale.
    3. Applicare una pomata oculare utilizzando un applicatore di cotone sterile e registrare la frequenza respiratoria etemperatura corporea. Utilizzando un trimmer alimentato a batteria, radere la parte superiore della testa. Utilizzare i piccoli forbici chirurgiche per rimuovere il pelo vicino alle orecchie.
    4. A questo punto, indossare i guanti chirurgici sterili. Applicare iodio e poi alcool (tre volte) al cuoio capelluto.
    5. Usando un bisturi, fare un'incisione verso il basso al centro del cuoio capelluto e diffondere la pelle con fascette toro cane. Prendere una punta di cotone sterile per assorbire il sangue. Usare il perossido di idrogeno per facilitare la comparsa di bregma e lambda.
    6. Verificare che la testa sia posizionata correttamente misurando il D / V e coordinate M / L di bregma e lambda. Coordinate cambiamenti dovrebbe essere zero se la testa è su un piano. Regolare le barre testa e orecchio come necessario per garantire un piano piatto.
    7. Trova bregma, e azzerare le coordinate. Utilizzando le coordinate desiderate, spostare a sinistra ea destra e fare un segno con un pennarello indelebile. Utilizzando un cauterizer / marcatore, fanno una grande piazza circa il marchio con spazio a sufficienza per raggiungere ilregione desiderata.
    8. Utilizzando uno strumento rotativo sterile, praticare intorno al marchio quadrato. Assorbire il sangue utilizzando un applicatore di cotone sterile. Accuratamente disinfettare la punta del trapano prima di ogni utilizzo.
    9. Fissare il MEA al headstage e recupero informazioni la pipetta con la prima soluzione desiderata. Sia sicuro lasciare uno spazio nella pipetta senza soluzione in modo che la soluzione sia espulso può essere esaminato. Collegare il tubo alla micropipetta di vetro.
    10. Accendere il serbatoio di azoto e l'eiettore pressione (psi = 5, tempo = 0,6 s). Test (premere il pulsante rosso manuale) per garantire la pipetta non sia intasato prima di cominciare.
    11. Calibrare il micropipetta. Inizia a 0 sul reticolo e mettere un pezzo di nastro adesivo blu sulla headstage per indicare il punto di inizio. Accendere il lettore digitale e resettare a zero. Scendete di 1 mm (DV) e contare il numero di zecche la soluzione è spostato sul reticolo. 10 zecche dovrebbero uguale a 1 mm (1 mm = 250 nL), quindi 1 tick = 25 nL.
    12. Posizionare l'elettrodo di riferimento in unposizione remota dal MEA tale che è ancora in contatto del liquido con il cervello per completare il circuito.
    13. Trovare bregma con la MEA allegato e azzerare il lettore digitale. Spostare il MEA alle coordinate desiderate. Abbassare lentamente il MEA fino a quando la punta tocca il cervello. Zero coordinata DV e abbassare lentamente il MEA nel cervello.
    14. Sul programma di registrazione, fare clic sul elettrodo calibrato desiderato e quindi fare clic su "Esegui Experiment". Il sistema sarà quindi iniziare a registrare livelli tonico per l'analita di interesse mentre l'animale è anestetizzato.
    15. Zoom ad un asse che aiuterà nell'osservazione di base e consentire l'elettrodo di base per 20 - 45 min.
    16. Dopo la linea di base è stabile, impostare l'espulsore pressione .6 s e 5 psi e premere il pulsante rosso sull'espulsore pressione per espellere. Registrare il tempo e la pressione, il volume / zecche spostato sul foglio iniezione (Figura 2). Apportare le note che sono necessari (vale a dire,picchi più grandi, effetti di diluizione, pipetta intasato, rumoroso basale / o-scope).
    17. Per le iniezioni glutammato, aspettare 3-5 minuti tra le iniezioni. Per KCl iniezioni aspettare 1-2 minuti tra le iniezioni. Iniettare utilizzando la stessa pressione e tempo di almeno 3 volte. Cambia il tempo e ripetere. Cercate di non cambiare la pressione a meno che la micropipetta è intasato.
    18. Se la micropipetta è intasato, aumentare la pressione fino a 30 psi.
    19. Registrare dalle regioni cerebrali desiderati, ripetendo su entrambi i lati del cervello utilizzando soluzioni diverse. Registrazione di una linea di base in ogni nuova regione per 20 min.
    20. Prendere il MEA con micropipetta annesso, sciacquare con acqua deionizzata e immergere in PBS durante la notte fino a quando tutto il sangue è andato.
    21. Eutanasia l'animale e salvare il cervello in un tubo pre-etichettati e conservare in freezer C -80 ° o conservare un lato per il fissaggio. Per l'eutanasia dell'animale, sovradosaggio con isoflurano (inalazione). Eseguire la decapitazione usando forbici chirurgiche e sezionare le regioni desiderati.

7. MEA Pulizia rivestiti dopo l'uso

  1. Fare MEA non pulite, anche se non utilizzato. Se v'è lanugine o polvere sulla superficie, pulita con metanolo e lasciare asciugare per 24 ore prima della verniciatura.
  2. Accendere il bagnomaria (80 ° C) e immergere la punta del MEA per 30 min. pulire accuratamente la punta dell'elettrodo con un cotone punta dell'applicatore per rimuovere eventuali residui che può essere lasciato sulla punta dell'elettrodo. Non ottenere il "porzione di isolamento" nera della MEA bagnato.
  3. Utilizzando tre diversi sonicatori, immergere la punta del MEA in (1) Citrisolv, un solvente e commerciale compensazione agente (2) isopropile, e (3) acqua deionizzata per 5 min. pulire accuratamente la punta dell'elettrodo con cotone punta dell'applicatore per rimuovere eventuali residui che può essere lasciato sulla punta dell'elettrodo.
  4. Esaminare le punte sotto un microscopio da dissezione per assicurare gli strati sono stati rimossi con successo.

8. Analisi

  1. Per analizzare i dati,prima esportare l'esperimento desiderata facendo doppio clic l'esperimento finito e selezionando "esportazione di dati" dal menu a discesa dei file.
  2. Salva questo dati nella posizione file desiderato e aprire il programma di analisi. Fai clic su "aperto" nel programma di analisi e scegliere il file salvato di recente.
  3. Dare il programma qualche istante per caricare il file e quindi controllare esperimento nella scheda marcatori di eventi. Sotto uscita, selezionare le caselle per i parametri desiderati. Ad esempio, basale, ampiezza, area del picco (area sotto la curva), T aumento, e T 80.
  4. Fare clic su Aggiorna e quindi analizzare per esportare i dati in un foglio di calcolo (l'operazione potrebbe richiedere alcuni minuti). Il programma darà un prompt per salvare il file nella posizione desiderata. Una volta salvato, il file può essere modificato in un foglio di calcolo.

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Risultati

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Anche se questa tecnologia può essere utilizzata per misurare alterazioni glutamatergici segnalazione in molti tipi di modelli animali, come ad esempio lesioni traumatiche del cervello, l'invecchiamento, lo stress e l'epilessia, qui si dimostra come la tecnologia MEA può essere utilizzato per esaminare le alterazioni glutamatergici a modello di topo transgenico di taupatia umano 19, 20. La RTG (tauP301L) 4510 del mouse esprime la...

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Discussione

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La tecnica MEA consente la misurazione della rapida cinetica di rilascio di neurotrasmettitore e l'assorbimento in vitro e in vivo. Quindi, la tecnologia produce una vasta gamma di uscita dati compresi livelli di neurotrasmettitore tonico, rilascio di neurotrasmettitore evocato, e la clearance neurotrasmettitore. Tuttavia, perché l'uso di MEA è una procedura relativamente complessa, ci sono numerosi fattori che possono avere bisogno di essere ottimizzato per l'uso con successo. Ad esempio, ...

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Dichiarazioni

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GG è l'unico proprietario di Quanteon, LLC che rende il sistema di registrazione-16 VELOCE utilizzato per le misurazioni del glutammato in questo studio. JEQ è un consulente pagato per Quanteon.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of scienze mediche generali (MNR; U54GM104942), NIA (MNR; R15AG045812), Associazione Alzheimer (MNR; NIRG-12-242.187), WVU facoltà di ricerca Senato Grant (MNR), e WVU PSCOR di Grant (MNR).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
FAST-16mkIII-8 canaliQuanteon16mkIII
CenMetW4 o 8-TRK
Albumina sierica bovina (BSA)Sigma-AldrichA-305910 g (scade dopo 1 mese)
GlutaraldeideSigma-AldrichG-6257100 mL (scade dopo 6 mesi)
Glutammato ossidasiUS Biological o Sigma AldrichG4001-01 o 10064650 UI (scade dopo 6 mesi)
Hamilton SiringheHamilton#803832 siringhe
MetanoloBDHUN12304 L
m-Fenilendiammina dicloridrato (mPD)ACROS Organics133056025025 g
Elettrodi di riferimento (RE-5B)BASMF-20793 elettrodi
Alimentato a batteria Magnetico piastra di agitazioneCole-parmerEW-04804-01Può acquistare da diversi fornitori
GlutammatoSigma-AldrichG-1626100 g
Acido ascorbicoTCI50-81-7500 g
Dopamina cloridratoAlfa Aesar62-31-75 g
Acido percloricoVWRUN2920500 mL
Cloruro di postassioVWR7447-40-71 kg
Cloruro di sodioVWR7647-40-71 kg
Cloruro di calcioMP153502100 g
Idrossido di sodioBDH1310732500 g
Pipette di espulsione a pressione in vetroCera
Kerrlab625Può acquistare da un fornitore diverso
MicrosyringeWorld Precision InstrumentsMF28G-5
Argilla da modellareWalMartPuò acquistare da diversi fornitori
Picospritzer IIIParker
Filo d'argentoAM systems#786500
Acido cloridricoBDH76470102.5 L
Filo di platinoAM Systems778000
Pistola per saldaturaLowes o Home DepotPuò acquistare da un fornitore diverso
MultimetroWalMartPuò acquistare da un fornitore diverso
PhysioSuiteKent ScientificPuò acquistare da un fornitore diverso
SomnoSuiteKent ScientificPuò acquistare da un fornitore diverso
DispositivostereotassicoStoeltingPuò acquistare da un fornitore diverso
Digital Lab StandardStoeltingPuò acquistare da un fornitore diverso
Microscopio Meiji EMZMeijiEMZ-5
TrapanoDremelMicro
MetricideMetrex102800
BisturiVWRPuò acquistare da un fornitore diverso
Forbici chirurgicheVWRPuò acquistare da un fornitore diverso
Tamponi di cotone steriliPuritan25806Può acquistare da un fornitore diverso
Unguento per gli occhi Unguentoveterinario Puralube Otteneredal veterinario
Tamponi di iodioVWRS48050Può acquistare da un fornitore diverso
Tamponi alcoliciFarmacia localePuò acquistare da un fornitore diverso
Telo chirurgico sterileDynarex4410Può acquistare da un fornitore diverso
Soluzione salina sterileTeknovaS5815Può fare la propria soltuion utilizzando i filtri
Perossido di idrogeno (3%)FarmaciaPuò acquistare da un fornitore diverso
Pad riscaldanteWalMartPuò acquistare da diversi fornitore
Array di microelettrodi appiccicosa CenMet locale

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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