Method Article

Un metodo semplice per glucosinolati estrazione e l'analisi con alta pressione cromatografia liquida (HPLC)

DOI:

10.3791/55425

⸱

March 15th, 2017

 , 
1German Centre for Integrative Biodiversity Research (iDiv) Halle-Jena-Leipzig, 2Institute of Ecology, Friedrich Schiller University Jena

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, descriviamo in dettaglio un protocollo consolidato e robusto per l'estrazione di glucosinolati da materiali vegetali macinati. Dopo un trattamento con solfatasi in colonna degli estratti, i desulfoglucosinolati vengono eluiti e analizzati mediante cromatografia liquida ad alta pressione.

Abstract

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I glucosinolati sono una classe ben studiata e molto diversificata di composti vegetali naturali. Svolgono un ruolo importante nella resistenza delle piante, nella qualità dell'olio di colza, negli aromi alimentari e nella salute umana. L'attività biologica dei glucosinolati viene rilasciata in caso di danno tissutale, quando vengono miscelati con l'enzima mirosinasi. Ciò si traduce nella formazione di prodotti di degradazione pungenti e tossici, come isotiocianati e nitrili. Attualmente, sono stati identificati più di 130 glucosinolati strutturalmente diversi. La struttura chimica del glucosinolato è un importante determinante del prodotto che si forma, che a sua volta ne determina l'attività biologica. Quest'ultimo può variare da dannoso (ad esempio, progoitrina) a benefico (ad esempio, glucorafanina). Ogni specie vegetale contenente glucosinolati ha il suo profilo glucosinolato specifico. Per questo motivo, è importante identificare correttamente e quantificare in modo affidabile i diversi glucosinolati presenti nelle foglie brassicacee, nei semi e nelle radici o, per gli studi ecologici, nei loro parenti selvatici. Qui, presentiamo un metodo ben convalidato, mirato e robusto per analizzare i profili dei glucosinolati in un'ampia gamma di specie vegetali e organi vegetali. I glucosinolati intatti vengono estratti da materiali vegetali macinati con una miscela di metanolo e acqua ad alte temperature per disabilitare l'attività della mirosinasi. Successivamente, l'estratto risultante viene portato su una colonna a scambio ionico per la purificazione. Dopo il trattamento con solfatasi, i desolfoglucosinolati vengono eluiti con acqua e l'eluato viene liofilizzato. Il residuo viene assorbito in un volume esatto di acqua, che viene analizzato mediante cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) con un rivelatore a matrice di fotodiodi (PDA) o ultravioletto (UV). Il rilevamento e la quantificazione si ottengono effettuando confronti tra i tempi di ritenzione e gli spettri UV degli standard di riferimento commerciali. Le concentrazioni sono calcolate sulla base di una curva di riferimento della sinigrina e di fattori di risposta ben stabiliti. I vantaggi e gli svantaggi di questo metodo semplice, rispetto a metodi più veloci e tecnologicamente avanzati, sono discussi qui.

Introduction

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Si stima che le piante producono oltre 200.000 diversi tipi di composti chimici 1. Solo una minoranza di questi composti sembra giocare un ruolo nel metabolismo primario delle piante, che alimenta la crescita e la riproduzione; la maggioranza sono i cosiddetti metaboliti secondari. Nonostante il loro nome, metaboliti secondari sono spesso critici per la sopravvivenza delle piante e la riproduzione, in quanto servono per attirare gli impollinatori o per difendere la pianta contro gli agenti patogeni ed erbivori 1.

I glucosinolati sono una classe molto eterogeneo di metaboliti secondari che sono stati studiati per oltre 150 anni 2. Ad oggi, più di 130 strutturalmente differenti glucosinolati sono stati identificati 3. In linea di massima, glucosinolati possono essere suddivise in diverse classi basate sulla aminoacido da cui sono sintetizzati. glucosinolati indolo, per esempio, sono sintetizzati dal amminoacidotriptofano, che fenilalanina fornisce lo scheletro di base per la sintesi di glucosinolati aromatici 4. All'interno delle classi, vi è un elevato livello di diversità strutturale, che è causata da sequenziali passaggi catena allungamento nelle vie biosintetiche, come nella classe di glucosinolati alifatici, o da modifiche catena laterale (ad esempio, idrossilazione) 4, 5. Una specie di piante glucosinolati possono contenere fino a 37 diversi glucosinolati appartenenti a diverse classi strutturali 6. Anche se le specie vegetali hanno profili tipici glucosinolati, la variazione intraspecifica per i tipi di glucosinolati è frequente tra gli individui e le popolazioni 6, 7. Glucosinolati intatti vengono memorizzati nei vacuoli delle cellule vegetali e può essere trovato in qualsiasi organo o fuori terra ipogea 7, 8, 9. In caso di rottura delle cellule (ad esempio, da erbivori), glucosinolati vengono rilasciati e sono mescolati con la mirosinasi dell'enzima, scatenando un olio di senape bomba a 10. Grazie all'attività di mirosinasi, e in funzione della struttura del glucosinolato, le condizioni di reazione, e la presenza di enzimi modificanti, si formano composti pungenti, tossiche, nocive o diversi, quali nitrili e (iso) tiocianati 11. I prodotti di reazione hanno elevate attività biologiche; per esempio, servono come repellenti di insetti erbivori generalisti 12. L'ereditabilità e biosintetici percorsi di glucosinolati sono ben studiati, soprattutto a causa della loro importanza per erbivori e resistenza ai patogeni, il loro valore come componenti aromatici a mostarde e cavoli, e il loro negativo (progoitrina) e gli effetti positivi (glucorafanina) sulla salute umana 5, 13, 14.

A causa del grande interesse glucosinolati come composti, estrazione e metodi di rilevamento biologicamente attivi basati su fase inversa liquida ad alta pressione cromatografia (HPLC) equipaggiato con ultravioletti (UV) o di fotodiodi (PDA) rivelatori sono stati comunemente usati dal 1980 15 . In base a questo metodo, le Comunità Europea ha emanato un protocollo standard che è stato testato e convalidato in diversi laboratori per l'analisi dei glucosinolati nei semi oleosi (Brassica napus, colza, canola 16). Altri aggiunti a questo metodo (ad esempio, determinando fattori di risposta aggiuntive per glucosinolati che non sono presenti nella colza) 17. Nonostante la crescente disponibilità di cromatografia-spettrometria di massa piattaforme liquidi (LC-MS) e protocolli di high-throughput per l'analisi dei glucosinolati 18 , 19, il metodo HPLC-UV / PDA originale è ancora ampiamente utilizzato dagli scienziati. I motivi principali sono che questo metodo è semplice, conveniente e relativamente accessibile ai laboratori senza una vasta infrastruttura conoscenze chimico-analitica. Per servire questa comunità, noi qui dettaglio il protocollo per l'estrazione di glucosinolati da materiali vegetali e l'analisi delle loro desulfo forme con HPLC-PDA.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparazione di soluzioni necessarie per l'estrazione glucosinolati

  1. Preparare 500 ml di 70% di metanolo (MeOH) in acqua (ultrapure) in una bottiglia di vetro. Per 100 campioni e 5 standard, 420 ml di 70% MeOH è necessaria.
  2. Preparare 20 mM acetato di sodio (NaOAc) (pH = 5,5) aggiungendo 0,82 g di NaOAc o 1,36 g di NaOAc x 3 H 2 O in 500 mL di acqua; regolare il pH con acido cloridrico (HCl). Conservare il NaOAc in frigorifero. Per è necessario 100 campioni e 5 standard, 370 ml di 20 mm NaOAc (pH = 5,5) in acqua.
  3. Per preparare il materiale della colonna, mescolare 10 g di gel di destrano reticolato (tipo G-25) con 125 ml di acqua ultrapura. Conservare la miscela risultante in frigorifero (4 ° C).
  4. Preparazione della soluzione solfatasi
    1. Sciogliere 10.000 unità di aril solfatasi (tipo H-1 da Helix pomatia) in 30 ml di acqua ultrapura e aggiungere 30 ml di etanolo assoluto (EtOH). Mescolare bene la soluzione e trasferirlo ad una cen 250 mLtubo trifuge o più tubi più piccoli, a seconda della disponibilità.
    2. Centrifugare la miscela a 2.650 xg per 20 min a temperatura ambiente (RT). Trasferire il surnatante (s) in un becher; aggiungere 90 ml di EtOH e mescolare. Centrifugare la miscela in uno o più tubi centrifugare a 1.030 xg per 15 minuti a RT.
    3. Eliminare il surnatante. Sciogliere e combinare i pellets in un totale di 25 ml di acqua ultrapura. Vortex bene, dispensare in 1 ml tubi, e conservare in un congelatore a -20 ° C; si conserva per almeno un anno.
  5. Preparazione della soluzione di riferimento sinigrina
    1. Pesare in circa 9 mg di monoidrato sinigrina con 1-mcg precisione (ad esempio, 8,769 mg). Trasferire in un matraccio tarato da 10 ml e sciogliere il monoidrato sinigrina in 10,0 ml di acqua ultrapura.
    2. Calcolare la molarità della soluzione di riserva e preparare cinque riferimenti sinigrina tra 50-750 micron diluendo della soluzione di riserva. Per un esempio dettagliato, vedere Supplementare S1 file .
    3. Erogare i diversi riferimenti sinigrina in provette da 1,5 ml e congelarli a 20 ° C. Include una serie di cinque riferimenti sinigrina in ciascun lotto di estrazione. Utilizzare sempre i valori corretti per il molarità attualmente utilizzato sinigrina riferimenti per il calcolo delle concentrazioni.

2. Preparazione del programma di installazione di estrazione

  1. Preparare una cremagliera colonna per le colonne pipette Pasteur (per la preparazione di colonne, vedere il punto 3.1). Etichetta il rack o le colonne per tenere traccia dei numeri di esempio (vedi Figura 1).
  2. Preparare un blocco tenendo lo stesso numero di tubi microcentrifuga da 2 ml etichettati (vedi punto 3.3 e Figura 1)

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Figura 1: Rack per l'estrazione di glucosinolati. Vista frontale (a sinistra) e vista dall'alto (a destra) di un rack colonna di self-made e il blocco per l'estrazione di glucosinolati. Altezza: 100 mm, la distanza tra i fori spostato (per contenere le colonne pipetta Pasteur): 30 mm (asse x) x 15 mm (asse y). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

3. Preparazione delle colonne e microprovette

  1. Preparare una colonna per campione e cinque colonne supplementari per i cinque campioni di riferimento sinigrina.
    1. In ogni pipetta di vetro, posto un pezzo di lana di vetro circa 1 cm x 1 cm. Utilizzare un bastone di legno o vetro per spingere la lana di vetro fino al punto in cui la pipetta si restringe. La lana di vetro dovrebbe evitare che il materiale colonna di esecuzione, ma non usare troppo, in quanto rallenta l'eluizione delle colonne. Indossare guanti when lavorare con la lana di vetro.
  2. Posizionare le colonne sulla cremagliera della colonna (vedi Figura 1). Inserire la griglia di colonna in un vassoio laboratorio (vassoio dei rifiuti) per prendere gli eluenti utilizzati per i lavaggi delle colonne consecutive.
  3. Tagliare i primi 5 mm al largo della punta di una plastica punta della pipetta da 1 ml e pipettare 0,5 mL del materiale della colonna preparata (G-25 gel in acqua, vedere il punto 1.3) in ogni colonna. Agitare il flacone contenente il materiale della colonna ben prima pipettaggio. Eliminare colonne perdite (materiale G-25 esaurendo attraverso lo strato di lana di vetro) e sostituirli con quelli nuovi.
    1. Dopo aver pipettato il materiale della colonna nelle colonne, aggiungere 1 ml di acqua ultrapura per irrigare giù il materiale.
  4. Preparare un tubo di reazione da 2 ml per campione e cinque tubi per i cinque campioni di riferimento sinigrina; etichettarli. Utilizzare un ago dissezione per fare buchi nei tappi per dopo liofilizzazione e posizionare i tubi preparate nel blocco tubo nella esattamente lo stesso modello come ilcolonne (passo 2.2, vedere la Figura 1).

4. Estrazione di glucosinolati

  1. Pesare liofilizzati e materiale vegetale finemente macinato (solitamente 50,0-100,0 mg di peso secco, le concentrazioni finali glucosinolati nell'estratto dovrebbe essere nel range della curva di riferimento) con l'approssimazione di 0,1 mg in 2 mL, etichettati, rotondo provette di reazione -bottom. Aggiungere due piccole sfere di metallo (3 mm di diametro) come ritardanti bollente ad ogni provetta.
    NOTA: Il protocollo può essere applicato anche a materiali freschi flash congelato, che sono stati terreno sotto azoto liquido e mantenuti congelati fino estrazione. Aumentare la quantità di materiale pesato per l'estrazione e la percentuale di MeOH nel liquido di estrazione al 85% per compensare la diluizione con l'acqua nei materiali 19.
  2. Pipettare 1 ml di 70% MeOH in ciascuna provetta e vortex brevemente. Chiudere i tubi e chiuderli con tappi di sicurezza prima di loro il più rapidamente possibile in un caldo wBagno Ater (90-92 ° C) per un paio di minuti (~ 5 min), fino a quando il 70% MeOH incomincia a bollire. Attenzione: Indossare occhiali di sicurezza durante questa fase!
  3. Mettere le provette dei campioni in un bagno ad ultrasuoni per 15 minuti. Nel frattempo, prendere la solfatasi e cinque campioni di riferimento sinigrina fuori dal freezer per scongelare loro a RT.
  4. Dopo ultra-sonicazione, centrifugare le provette dei campioni a 2.700 xg in una centrifuga da banco per 10 minuti a temperatura ambiente; un pellet dovrebbe formare in ogni provetta. Aggiungere il surnatante alle colonne etichettate e pipetta i campioni di riferimento cinque su colonne separate.
    1. Mentre pipettando il surnatante, mantenere la punta ben oltre il pellet per evitare materiali vegetali pipettaggio. Si noti che quando si utilizzano campioni essiccati, il volume surnatante sarà inferiore a 1,0 mL.
  5. Aggiungere 1 ml di 70% MeOH ai rimanenti palline nei tubi campione e vortice i tubi prima di metterli in un bagno ad ultrasuoni per 15 minuti. Centrifugare le provette di nuovo, come al punto 4.4, e aggiungere la Supernaabi- alle rispettive colonne; a causa delle proprietà del materiale della colonna, il gruppo solfato carica negativa dei glucosinolati sarà specificamente trattenuti sulla colonna.
  6. Lavare le colonne con gli estratti in tre fasi sequenziali.
    1. Pipettare 2 x 1 ml di 70% MeOH su ciascuna colonna. Attendere che la colonna di funzionare a secco prima di aggiungere i prossimi 1 ml; Questa operazione rimuoverà più composti apolari dagli estratti (ad esempio, clorofilla).
    2. Lavare il MeOH con l'aggiunta di 1 ml di acqua ultrapura per ogni colonna.
    3. Pipettare 2 x 1 ml di 20 mm NaOAc tampone per ogni colonna di creare le condizioni ottimali per la reazione di solfatasi.
  7. Prendere la cremagliera con le colonne dal vassoio di rifiuti e asciugare i piedi del rack con un fazzoletto di carta. Inserire la griglia sopra il blocco con fiale e tubi etichettati. Assicurarsi che ogni punta colonna è nella, l'etichetta, il tubo corrispondente a 2 ml (vedi Figura 1).
  8. Aggiungere 20 ml di solfatasi solutia colonne. Assicurarsi che il solfatasi raggiunge la superficie del materiale colonna. Pipettare 50 ml di NaOAc tampone su ogni colonna per irrigare giù per la solfatasi. Coprire le colonne con un foglio di alluminio e lasciate riposare per una notte.
    NOTA: A causa delle attività della solfatasi, il gruppo solfato verrà rimosso, rilasciando le desulfoglucosinolates dalla colonna in modo che possano eluire con l'acqua. Per una descrizione dettagliata, vedere Crocoll et al. 19.
  9. Il giorno successivo, eluire gli desulfoglucosinolates pipettando 2 x 0,75 ml di acqua ultrapura su ogni colonna. Quando tutte le colonne sono funzionare a secco, alzare la cremagliera della colonna e rimuoverlo dai tubi di reazione.
    1. Tappare le provette (assicurarsi che non vi siano fori nei tappi) e congelarli in azoto liquido o in un congelatore -80 ° C per 30 min. Liofilizzare i campioni per 12-24 h (a seconda del numero di campioni e la capacità del blocco-drier) per rimuovere tutta l'acqua.
  10. Dopo liofilizzazione, ri-sciogliere il residuo in un volume esatto (di solito 1.0 mL) di acqua ultrapura. Trasferire i campioni e le cinque riferimenti sinigrina di fiale HPLC etichettati. Conservare i campioni in frigorifero (4 ° C) per un massimo di due settimane o un congelatore (-20 ° C) fino ad un anno prima analisi con HPLC.
  11. Lasciate che il vetro colonne asciugare sotto il cofano durante la notte e li smaltire una volta asciutto. Recuperare le sfere di metallo dai tubi di esempio utilizzati nella fase 4.5 per il riutilizzo e mettere i tubi nel bidone dei rifiuti.

5. Le misurazioni HPLC di estratti campioni

  1. Separare glucosinolati su un C 18 colonna a fase inversa (4,6 x 150 mm, 3 micron, 300 Å) con un gradiente di acetonitrile-acqua (vedi Tabella 1) ed una portata di 0,75 mL / min e una temperatura della colonna di 40 ° C . Eseguire il rilevamento e la quantificazione a 229 nm.
  2. Misurare i riferimenti sinigrina sulla stessa colonna ma con un gradiente adattatometodo per ridurre l'uso di solventi (vedere Tabella 2). Inizia con l'iniezione di cinque riferimenti sinigrina, a cominciare con il riferimento con la concentrazione più bassa. Poi iniettare i campioni, compresa una iniezione di metanolo (blank) dopo ogni campione decimo per pulire la colonna e per evitare il riporto di picchi.
Tempo [min] Portata [mL / min] % A Acqua % B ACN
1 0.750 98 2
35 0.750 65 35
40 0.750 98 2
Colonna Temperatura 40 ° C.

Tabella 1: gradiente Acetonitrile-acqua per la separazione dei glucosinolati e analisi des su HPLC in fase inversa.

Tempo [min] Portata [mL / min] % A Acqua % B ACN
1 0.750 98 2
10 0.750 89.3 10.7
11 0.750 98 2
Colonna Temperatura 40 ° C.

Tabella 2: abbreviato gradiente di acetonitrile-acqua per la quantificazione dei cinque riferimenti sinigrina utilizzati per la quantificazione dei glucosinolati.

6. glucosinolati identificazione e quantificazione

  1. Identificazione
    1. Confrontare gli spettri UV e tempi di ritenzione dei picchi nei campioni con risultato in commerciocapaci, riferimenti glucosinolati puri. Vedere la Figura 2 per gli esempi di spettri UV delle varie classi di glucosinolati.
    2. Identificare i glucosinolati sconosciuti con gli standard di riferimento o LC-MS 18, 19, se possibile.
    3. Identificare i glucosinolati sconosciuti con la risonanza magnetica nucleare (NMR), se possibile.
    4. Confrontare gli spettri UV e tempi di ritenzione dei picchi con quelli nella Figura 2 e Tabella 3 riferimenti, basi di dati, o la letteratura.

figure-protocol-1
Figura 2. spettri UV delle classi glucosinolati più comuni. spettri di assorbimento UV (200-350 nm) di sei desulfoglucosinolates (GSL), basata su soluzioni fatte di composti di riferimento disponibili in commercio estratti come descritto qui, che rappresentano le classi strutturali più comuni. Il nome comune, sNome STRUTTURALI (tra parentesi), e la classe strutturale sono dati. (A) sinigrina (2-propenil GSL), alchenile; (B) glucoerucin (4-methylthiobutyl GSL), thioalkenyl; (C) glucorafanina (4-methylsulfinlybutyl GSL), sulfinilico; (D) glucobrassicin (indol-3-ilmetil GSL) indolo; (E) gluconasturtiina (2-phenylethyl GSL), aromatico; (F) sinalbina (4-idrossibenzile GSL), aromatico. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

  1. quantificazione
    1. Integrare l'area sotto le cime delle cinque riferimenti sinigrina e dei campioni.
    2. Calcolare una curva di calibrazione dei cinque riferimenti sinigrina misurati in base alla zona integrata. Utilizzare l'equazione della retta di regressione (vedi Equazione 1) per calcolare la quantità interpolata di glucosinolati (vedi equazione 2).
    3. Per calcolare la concentrazione dei vari glucosinolati, moltiplicare la quantità interpolato (x) per il fattore di risposta (M) per il rilevamento a 229 nm da CE (1990) 16, Buchner (1987) 15, o Brown et al. (1993) 17; i fattori di risposta consenso dei desulphoglucosinolates più comunemente rilevati sono riportati nella tabella 3.
      NOTA: I fattori di risposta possono variare tra i sistemi-questa può essere la ragione che ci sono valori diversi dati da diversi riferimenti (vedi Bibliografia 15-17). Tuttavia, i valori sono principalmente abbastanza vicino e in una gamma simile con classi strutturali. Dopo la convenzione, impostare il fattore di risposta di glucosinolati non identificati a 1, anche se per glucosinolati indolici sconosciuti con uno spettro UV simile a quella di glucobrassicin e altri glucosinolati indolici (figura 2), sarebbe consigliabile usare 0,25 come fattore di risposta per ottenereuna stima realistica della concentrazione (tabella 3).
    4. Per calcolare la quantità finale di glucosinolati (x t) nel campione, prendere il fattore di diluizione (D) e la massa di campione (w) utilizzato per l'analisi in considerazione (vedi Equazione 3).
      figure-protocol-2 (1)
      figure-protocol-3 (2)
      figure-protocol-4 (3)
      y = area del picco
      m = pendenza della curva di regressione a 5 punti di riferimento
      c = l'intercetta della retta di regressione con l'asse y
      x = quantità di glucosinolati nell'estratto
      x t = concentrazione di glucosinolati nel campione impianto
      D = fattore di diluizione
      M = fattore di risposta per la rivelazione a 229 nm da Buchner (1987) o Brown et al. (1993)
      w = massa del campione utilizzato per l'estrazione

Results

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Questo metodo consente la rilevazione e la separazione di desulfoglucosinolates trovano comunemente in tutte le classi strutturali (Figura 3). Il dannosa 2-hydroxyglucosinolate progoitrina arriva relativamente presto nel cromatogramma ed è chiaramente separato dal glucorafanina glucosinolati benefica, l'unica methylsulfinylglucosinolate in questo esempio. Sinigrina, gluconapin e glucobrassicanapin formano una serie eluotropica di glucosinolati alchenilici con lunghezza crescente catena laterale (C3, C4, C5 e, rispettivamente). Una serie logica simile è visibile per i due glucosinolati methylthioalkenyl, glucoiberverin (C3) e glucoerucin (C4). I picchi del tre glucosinolati indolici, glucobrassicin e suoi derivati ​​4-idrossi-1 e methoxyglucobrassicin (neoglucobrassicin), sono chiaramente separati. Va notato che i picchi di neoglucobrassicin e glucoerucin, nonché gluconasturtiina, l'unica gluco aromaticasinolate in questo esempio, sono particolarmente elevati in questo estratto Brassica dovuto all'aggiunta di estratti di radice alla miscela 9.

figure-results-1
Figura 3: Cromatogramma di un estratto di glucosinolati. Dettaglio (1-32 min) di un cromatogramma HPLC risultante dall'analisi di campioni combinati radice e sparare da Brassica nigra, B. rapa, e B. oleracea. Le etichette di punta indicano il tempo di ritenzione e le abbreviazioni per desulfoglucosinolates identificati (GSL). PRO = progoitrina (2-OH-3-butenil GSL); Raph = glucorafanina (4-methylsulfinlybutyl GSL); SIN = sinigrina (2-propenil GSL), GNA = gluconapin (3-butenil GSL); 4OH = 4 hydroxyglucobrassicin; IBV = glucoiberverin (3-methylthiopropyl GSL); GBN = glucobrassicanapin (4-pentenil GSL); ERU = glucoerucin (4-methylthiobutyl GSL); GBC = glucobrassicin (indolo-3-ylmethyl GSL); NAS = gluconasturtiina (2-phenylethyl GSL); NEO = neoglucobrassicin (1-MeOH-glucobrassicin). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Più lunghe catene di glucosinolati metilsulfinil, che si trovano comunemente nella pianta modello Arabidopsis, mostrano anche una serie eluotropica, come si è visto in un estratto di radice di Rorippa austriaca. Glucohesperalin (C6), glucosiberin (C7), glucohirsutin (C8), e glucoarabin (C9) appaiono a intervalli regolari sul cromatogramma (Figura 4). Insieme con gli spettri UV dei picchi, tale serie logica eluotropica può essere utilizzato per classificare, e provvisoriamente identificare, glucosinolati sconosciuti.

figure-results-2
Figura 4: Cromatogramma (telaio 9-30 min) Dei desulfoglucosinolates in un estratto di radice austriaca Rorippa. Le etichette di punta indicano il tempo di ritenzione e le abbreviazioni per desulfoglucosinolates identificati (GSL). HES = glucohesperin (6-methylsulfinylhexyl GSL); SBE = glucosiberin (7-methylsulfinylheptyl GSL); GBC = glucobrassicin (indolo-3-ylmethyl GSL); HIR = glucohirsutin (8-methylsulfinlyoctyl GSL); ARA = glucoarabin (9-methylsulfinylnonylglucosinolate); NEO = neoglucobrassicin (1-MeOH-glucobrassicin). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Nome comune Struttura della catena laterale Rt (min) * 229 nm riferimento#
aliphatic glucosinolati
Glucocapparin metile 3.5 1 Marrone
sinigrina 2-propenile 5.5 1 Brown, CE
Gluconapin 3-butenile 9.5 1.11 CE
Glucobrassicanapin 4-pentenil 13.5 1.15 CE
Glucoiberverin 3-methylthiopropyl 10.9 0.8 Marrone
Glucoerucin 4-methylthiobutyl 14.0 0.9 Marrone
Glucoiberin 3-methylsulfinylpropyl 3.7 1.2 Marrone
glucorafanina 4-methylsulfinylbutyl 4.9 0.9 Marrone
Glucoalyssin 5-methylsulfinylpentyl 7.6 0.9 Marrone
Glucohesperin 6-methylsulfinylhexyl 10.5 1 Marrone
Glucosiberin 7-methylsulfinylheptyl 13.5 1 Marrone
Glucohirsutin 8-methylsulfinyloctyl 16.8 1.1 Marrone
Glucoarabin 9-methylsulfinylnonyl 20.5 1
Glucocheirolin 3-methylsulfonylpropyl 4.2 0.9 Marrone
progoitrina 2 (R) -OH-3-butenile 4.5 1.09 Buchner, CE
Gluconapoleiferin 2-OH-5-pentenile 8.3 1 CE
glucosinolati indolo
4-hydroxyglucobrassicin 4-hydroxyindol-3-ilmetil 11.2 0,28 Buchner, CE
glucobrassicin indol-3-ilmetil 15.3 0,29 Buchner, CE
4-Methoxyglucobrassicin 4-methoxyindol-3-ilmetil 18.2 0.25 Buchner, CE
Neoglucobrassicin 1-methoxyindol-3-ilmetil 22.5 0.2 Buchner, CE
glucosinolati aromatiche
sinalbina 4-idrossibenzil 8.1 0.5 Buchner
Glucosibarin 2 (R) -OH-2-feniletil 12.1 vedi il prossimo
Glucobarbarin 2 (S) -OH-2-feniletil 12,7 0.95 Buchner
Glucotropaeolin benzilico 13.8 0.95 Buchner, CE
gluconasturtiina 2-feniletile 18,0 0.95 Buchner, CE
sconosciuto - alifatici / aromatici come spettro UV 1 CE
sconosciuto - indolo come spettro 0.25 CE
* Tempo di ritenzione approssimativo (Rt) arrotondato a 0,1 min (± 0,3 min seconda colonna, eluente qualità). I tempi di ritenzione sono determinati su piattaforme ThermoFisher / Dionex ultimo HPLC equipaggiati con una colonna C 18 (150 x 4.6 mm 3 micrometro dimensioni delle particelle) più C 18 Tabella 1.
# Riferimenti per i fattori di risposta: Buchner, R. in glucosinolati a colza (a cura di JP Wathelet) 50-58 (Martinus Nijhoff Publishers, 1987); Brown, PD, Tokuhisa, JG, Reichelt, M. & Gershenzon, J. Variazione di accumulo di glucosinolati tra i diversi organi e fasi di sviluppo di Arabidopsis thaliana. Fitochimica. 62 (3), 471-481, doi: 10.1016 / S0031-9422 (02) 00.549-6, (2003); CE. Semi - Determinazione dei glucosinolati liquida ad alte prestazioni cromatografia. Gazzetta ufficiale delle Comunità europee. L 170/28. Allegato VIII 03.07.27-34 (1990).

Tabella 3: Fattori di risposta del più comunemente desulfo-glucosinolati in estratti di piante e dei loro tempi di ritenzione approssimativi sulla C 18 colonne. Eluenti, gradient, temperatura della colonna, e portata come in Tabella 1.

Discussion

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I più grandi vantaggi di questo metodo consolidata e ampiamente utilizzato sono che è robusto, piuttosto semplice, e relativamente a basso costo per campione. La maggior parte delle attrezzature necessarie per l'estrazione e l'analisi dovrebbero essere disponibili in un laboratorio standard o può essere auto-costruito, con l'eccezione della HPLC-PDA. Un altro vantaggio è che desulfoglucosinolates disciolti in acqua sono chimicamente abbastanza stabili conservato fresco e in (HPLC) flaconi ermetici, quindi gli estratti possono essere facilmente spediti per l'analisi HPLC altrove. In contrasto con le piattaforme LC-MS, che richiedono una formazione specializzata e una vasta esperienza hands-on per la gestione del software e l'analisi dei dati, HPLC-UV / PDA può essere eseguito facilmente dopo un breve periodo di formazione. Questo non solo riduce i costi del procedimento, ma anche rende questo metodo più accessibile ad una vasta gamma di scienziati, compresi gli studenti.

In generale, quando le procedure sopra descritte sono seguite carefully, dovessero verificarsi alcuni problemi. In generale, i picchi glucosinolati sono molto ben separati nel cromatogramma. Se questo non è il caso, il programma gradiente potrebbe essere adattato diminuendo il tasso di aumento di acetonitrile in eluente. In alternativa, la costruzione di una nuova pre-colonna (200-500 iniezioni) o colonna (1.500 -2.000 iniezioni) potrebbe risolvere il problema. Di tanto in tanto, cromatogrammi di campioni singoli in un lotto possono mostrare molto piccolo o senza picchi. Questo è di solito a causa di errori di pipettamento quando si aggiunge il solfatasi (ad esempio, una colonna è stato ignorato o la solfatasi non è stato adeguatamente lavato giù nella colonna). In alternativa, la concentrazione glucosinolati nei materiali sperimentali può essere stata inferiore al previsto e troppo poco materiale è stato utilizzato per l'estrazione. In quest'ultimo caso, il volume di iniezione può essere aumentata a 100 microlitri, o potrebbe essere concentrata un'aliquota esatta (es, 800 microlitri) dell'estratto. Quest'ultimo potrebbe essere ottenuto liofilizzarezione l'estratto, sciogliendo il residuo in un volume più piccolo (ad esempio, 100 ml) di acqua, e reiniettando utilizzando la stessa curva di riferimento. Nei calcoli per la concentrazione originale dell'estratto, i numeri devono essere moltiplicati per il fattore di diluizione. Se questo non risolve il problema, i materiali devono essere estratti usando ancora più materiale di partenza. Se è superiore a 100 mg, il volume dei solventi di estrazione e le dimensioni dei tubi devono essere regolate in proporzione per mantenere l'efficienza di estrazione.

Un ulteriore vantaggio è che questo metodo è stato ben convalidato. Questo perché è stato descritto come un metodo standard per la quantificazione di glucosinolati in colza, per la quale sono state confermate le procedure e precisione in diversi laboratori 16. Inoltre, il background genetico, biosintesi e funzioni biologiche di glucosinolati sono soggetti a intensi sforzi di ricerca, in modEL thaliana specie di piante di Arabidopsis tra gli altri 4, 6, 12. Di conseguenza, molti fattori di risposta per l'esatta quantificazione dei desulfoglucosinolates in relazione alla sinigrina sono ben definiti e disponibili al pubblico 15,17. Anche se protocolli LS-MS-based sono più high-throughput, più sensibile, e sono in grado di (indicativamente) identificare glucosinolati per cui non sono disponibili standard 18, 19, 20, la mancanza di fattori di risposta universali per LC-MS limita la la quantificazione esatta delle concentrazioni di glucosinolati 18. Inoltre, questi metodi di solito non includono una fase di liofilizzazione, e la quantità di acqua nel materiale vegetale fresco è dispersi nei calcoli, rendendo esatta quantificazione difficile. Infine, perché il nostro metodo di estrazione comporta una base di colonnapurificazione e fase di concentrazione, può essere applicato anche a campioni "sporchi" con basse concentrazioni di glucosinolati, come terreni 21.

Rispetto ai metodi LC-MS-based che di solito estraggono appena materiali congelati, utilizzano piastre a 96 pozzetti per l'estrazione, e non includono un passo solfatasi 18, 19, il nostro metodo è relativamente lungo e intenso lavoro. Con i rack delle colonne descritte in questo documento, una sola persona può estrarre circa 100-150 campioni in un solo giorno. Eluizione (giorno successivo), liofilizzazione (durante la notte), e ri-dissoluzione può avvenire entro i due giorni successivi. Con un iniettore automatico HPLC, un tempo di esecuzione e di equilibrio di 40-45 min per iniezione, e non eventi imprevisti, ci sarebbero voluti 3-4 giorni di tempo per acquisire i dati per questo set di esempio. Quando il software HPLC consente la quantificazione automatica basata sulla curva sinigrina, un controllo manuale dei cromatogrammi e peassegnazioni ak per 100 campioni possono richiedere solo un altro 1 o 2 ore prima che i dati possono essere utilizzati per le analisi statistiche.

Nonostante la crescente disponibilità di standard di glucosinolati, solo una piccola frazione degli oltre 130 candidati attualmente può essere acquistato in commercio. Tuttavia, con alcuni riferimenti per ciascuna delle classi biosintetici; l'accesso alle banche dati di letteratura che specificano i composti precedentemente trovato nelle specie vegetali (ad esempio, Fahey et al 22.); conoscenza di base dei principi cromatografici, come la logica della serie eluotropica (ad esempio, per i numeri di Cs crescente sulla catena laterale di composti alifatici, le figure 3 e 4); e la convalida di singoli campioni in LC-MS 19 o glucosinolati isolato su NMR 23, si può facilmente superare questo limite. La maggior parte dei protocolli per glucosinolati analisi utilizzare curve di riferimento interni(Cioè, una certa concentrazione per l'estrazione di sinigrina o sinalbina del solvente di estrazione 16, 17, 19). Principalmente, le curve di riferimento interni sono più appropriate per correggere gli errori individuali di elaborazione del campione e quindi teoricamente produrre una maggiore precisione. Nonostante questo vantaggio, preferiamo usare una curva di riferimento esterno a cinque punti, come abbiamo spesso analizziamo diverse specie selvatiche, alcune delle quali contengono alti livelli di sinigrina (ad esempio, Brassica nigra 24) o sinalbina (ad esempio, Sinapis alba 25), il due riferimenti glucosinolati per i quali i fattori di risposta sono disponibili. Inoltre, aggiungendo standard interni per ogni campione aumenta il costo delle analisi, come standard di riferimento glucosinolati pregiati sono di solito abbastanza costosi.

In conclusione, nonostante i passi in termini di tempo, questo protocollofornisce un metodo semplice e accessibile per estrarre e quantificare glucosinolati in campioni vegetali. Tuttavia, è importante considerare che i livelli glucosinolate stessi sono solo un'indicazione del potenziale attività biologica, visto come la necessità di reagire con mirosinasi e variazione dei prodotti di reazione possono derivare da una singola glucosinolati 11. test di convalida devono essere effettuate per confermare la rilevanza biologica.

Disclosures

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

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NMvD ringrazia il Dr. Michael Reichelt (Max-Planck-Institute for chemical Ecology, Jena, Germania) per aver fornito i primi campioni di riferimento quando ha iniziato a utilizzare questo metodo 16 anni fa. Ciska Raaijmakers (NIOO-KNAW, Wageningen, Paesi Bassi), Sebastian Krosse (B-Ware, Nijmegen, Paesi Bassi) e Christian Ristok (iDiv, Lipsia) sono riconosciuti per aver migliorato il protocollo nel corso degli anni. Mirka Macel e Martine Huberty (Università di Tubinga, Germania) sono state autorizzate a utilizzare il cromatogramma Rorippa. Gli autori ringraziano il Centro tedesco per la ricerca sulla biodiversità integrativa (iDiv) Halle-Jena-Leipzig, finanziato dalla Fondazione tedesca per la ricerca (FZT 118).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Metanolo HiPerSolv CHROMANORM® gradiente per HPLC VWR20864.320
Acetato di sodio (NaOAc)Sigma-AldrichW302406-1KG-K
HClVWR1.09057.1000
SephadexSigma-AldrichA25120-10G
(−)-Sinigrina idrato
dal rafano 		Sigma-AldrichS1647-500MG
Aril SulfatasiSigma-AldrichS9626-10KU
EtanoloVWR20816.298
Pipetta PasteurCarl Roth4518.1
Lana di vetroCarl Roth7377.1
Bastoncino di vetro/legnoVWRHERE1080766
provette di reazione da 2 mLVWR211-2120
Ago da dissezioneCarl RothKX93.1
Piastre da laboratorio RotilaboCarl Roth0772.1Vassoio per rifiuti
Clip di sigillatura RotilaboCarl RothN217.1
Liofilizzatore Freezone 12 LLabconco7960030
Acetonitril grado super gradienteVWR83639.320
BagnomariaVWR462-5112
Bagno ad ultrasuoniFisher ScientificFB 15061
PH ElettrodoThermo Fisher Scientific STARA2115
Centrifuga Heraeus Multifuge X1Thermo Fisher Scientific75004210
Pre-colonnaThermo Fisher Scientific69697Colonna C18 (4,6 x 10 mm, 5 &; micro; m, 300 Å) 
Colonna Acclaim 300Thermo Fisher Scientific60266C18 colonna (4,6 x 150 mm, 3 &; micro; m, 300 Å) 
HPLC Ultimate 3000Thermo Fisher Scientificcon forno a colonna e rivelatore UV o PDA
Pallone 1.000 mLVWR215-1595
Composti di riferimento glucosinolatiPhytoplanvarihttp://www.phytoplan.de/

References

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