Peptidi virali-derivati accoppiati a anticorpo-coniugati (ACs) è un approccio guadagnando slancio a causa del potenziale di trasporto molecolare payload con accumulo di cellule aumentata del tumore. Utilizzando metodi comuni per valutare la coniugazione di peptide, AC e accumulo intracellulare di payload e targeting tumorale, questo protocollo consente ai ricercatori durante le fasi iniziali di sviluppo chiave.
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Articolo metodologico
Valutazione iniziale di anticorpo-coniugati modificate con peptidi virali-derivati per accumulo cellulare di aumentare e migliorare il Targeting tumorale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Anticorpo-coniugati (ACs) modificati con peptidi derivati da virus sono potenzialmente potente classe di agenti di consegna delle cellule tumorali per molecolare payloads utilizzati nel trattamento del cancro e di imaging dovuto accumulazione cellulare aumentata sopra SCA corrente. Durante primi AC in vitro sviluppo, tecniche di fluorescenza e metodiche radioimmunologiche sono sufficienti per determinare la localizzazione intracellulare, efficienza di accumulo e specificità delle cellule bersaglio. Attualmente, non ci è consenso su metodi standardizzati per preparare le celle per valutare la localizzazione e l'accumulo intracellulare di AC. La prova iniziale di ACs per volta con peptidi derivati da virus è fondamentale, soprattutto se sono stati costruiti diversi candidati. Determinare l'accumulo intracellulare di fluorescenza può essere influenzata da segnale di fondo da ACs alla superficie delle cellule e complicano l'interpretazione di accumulo. Per metodiche radioimmunologiche, cellule in genere trattate sono frazionate e misurata la radioattività in diversi compartimenti cellulari. Tuttavia, lisi cellulare variano da una cella a altra e spesso nucleari e citoplasmatici scomparti non sono adeguatamente isolate. Questo può produrre dati fuorvianti sulle proprietà di consegna del carico utile. L'iniezione endovenosa di radiomarcato virus-derivato del peptide-modificato ACs nel tumore topi seguiti da formazione immagine del radionuclide del cuscinetto è un potente metodo per la determinazione delle proprietà di recapito di targeting e capacità di carico del tumore alla fase in vivo della sviluppo. Tuttavia, si tratta di un progresso relativamente recente e alcuni gruppi hanno valutato virus-derivato di ACs di peptide-modificato in questo modo. Descriviamo il trattamento delle cellule trattate per valutare con maggiore precisione virus-derivato di accumulo di AC peptide-modificato quando si utilizza metodiche radioimmunologiche e microscopia confocale. In particolare, un metodo per trypsinizing cellule rimuovere la superficie cellulare associato ACs. Forniamo anche un metodo per migliorare il frazionamento cellulare. Infine, questo protocollo fornisce un metodo in vivo tramite tomografia a emissione di positroni (PET) per la valutazione iniziale del tumore come destinazione proprietà nei topi del tumore-cuscinetto. Usiamo il radioisotopo 64Cu (t1/2 = 12.7 ore) come un payload di esempio in questo protocollo.
Introduzione
Anticorpo-coniugati (ACs) sono prodotti biofarmaceutici che stanno maturando in una classe trasformativa di farmaci efficaci per individuare tumori e migliorare i trattamenti del cancro. Composto di un anticorpo monoclonale (mAb) coniugato al payload molecolare come radioisotopi, piccole molecole e tossine biologiche, ACs sono in grado di fornire questi carichi utili alle cellule tumorali con destinazione squisito antigene affinità e specificità. Quindi ACs hanno il potenziale di significativamente ridurre la tossicità aspecifica e aumentare l'attività di carico al luogo del tumore. Terapeuticamente, ACs trasporto citotossiche piccole molecole (comunemente indicate co....
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Protocollo
In vivo esperimenti sugli animali descritti sono stati effettuati secondo un protocollo approvato e sotto le linee guida etiche del comitato etico di Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke per esperimenti di animali.
1. anticorpo Peptide coniugazione
Nota: ChAcNLS possono essere sintetizzati in qualsiasi produttore commerciale peptide o la piattaforma di servizi di sintesi del peptide di università-affiliato. La sintesi di ChAcNLS può essere trovata in riferimento 34. Per le procedure 1 e 2 utilizzare il mAb 7 3, che è specifico per l'antigene di leucemia IL-3Rα
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Risultati
Per procedura 1, la costruzione di 3 7 modificato con ChAcNLS usando sulfo-SMCC come un reticolante è molto affidabile. In genere, quando caricati su un gel di 12% e analizzati da SDS-PAGE, questo risultati in un aumento graduale distinguibile MW proporzionale all'aumento sulfo-SMCC-a - 7 3 rapporti utilizzati e permette per le catene pesanti e leggere essere valutati singolarmente per ChAcNLS Coniugazione (Figura 3). 7G 3 ha reagito a 10, 20, 25 e 50-a-1 sulfo-SMCC-a - 7.......
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Discussione
Principali obiettivi di consegna sistemica di agenti anti-cancro sono di accumulo presso il sito del tumore e l'assorbimento all'interno delle cellule tumorali di aumentare e diminuire gli effetti collaterali indesiderati in tessuti sani. Consegna di AC mirati di payload molecolare alle cellule del tumore è un approccio molto promettente per trattare e rilevare i tumori. Tuttavia, la mancanza di efficacia causata dall'allettamento endosoma e giù degradazione lisosomiale flusso rimane una sfida importante. Mentre questo p.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dalla Cancer Research Society (Canada) e il CIMS. Gli autori ringraziano il Dr. Samia Ait-Mohand e Jean-Francois Beaudoin per assistenza. Dr. Angel Lopez (University of South Australia) per mAb A14.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sulfo-SMCC | Thermo Scientific | 22122 | Ci sono molti reticolanti maleimmidici omo- ed etero-bifunzionali tra cui scegliere. |
| Filtri centrifughi Amicon Ultra-0,5 mL EMD | Millipore | UFC505096 | Sono disponibili confezioni da 8, 24 e 96. Scegli in base alle tue esigenze. |
| Standard del caleidoscopio proteico Precision Plus | BioRad | 1610375EDU | Proteine ricombinanti multicolor da 10 a 250 kDa. |
| Tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenolo | Thermo Scientific | 25200056 | volumi da 100 o 500 mL tra cui scegliere. |
| Anticorpo secondario IgG (H+L) anti-topo di capra, Alexa Fluor 647 coniugato | Thermo Scientific | A-21235 | 1 - 10 μ g/mL raccomandato |
| NOTA-NHS | CheMatech | C100 | |
| Lamina A/C anticorpo (N-18) | Santa Cruz Biotechnology | sc-6215 | |
| Rab7 anticorpo | Santa Cruz Biotechnology | sc-376362 | |
| A14 mAb | BD Biosciences | 555902 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Scientific | NP0007 | |
| 2- Mercaptoetanolo | Sigma Aldrich | M3148-25ML | |
| TF-1a celle | ATCC | ATCC CRL-2003 | |
| RPMI 1640 medio | ATCC | ATCC 30-2001 | |
| tampone di lisi ed estrazione RIPA | Thermo Scientific | 89900 | |
| AMIDE software di imaging medico | disponibile su amide.sourceforge.net | Download completamente gratuito | |
| Microscopio confocale FluoView FV1000 | Olympus | ||
| Fluoview Software | Olympus | www.olympus-lifescience.com | |
| strisce ITLC | Biodex | 150-771 |
Riferimenti
- Verma, S., et al. Trastuzumab emtansine for HER2-positive advanced breast cancer. New England Journal of Medicine. 367 (19), 1783-1791 (2012).
- Younes, A., et al. Results of a pivotal....
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Ristampe e permessi
