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Le specie reattive di ossigeno (ROS) regolano i processi cellulari essenziali, inclusi l'espressione genica, la migrazione, la differenziazione e la proliferazione. Tuttavia, livelli eccessivi di ROS inducono uno stato di stress ossidativo, accompagnato da danni ossidativi irreversibili al DNA, ai lipidi e alle proteine. Quindi, la quantificazione di ROS fornisce un proxy diretto per la condizione di salute cellulare. Poiché i mitocondri sono tra le principali fonti cellulari e gli obiettivi della ROS, l'analisi congiunta della funzione mitocondriale e della produzione ROS nelle stesse cellule è fondamentale per una migliore comprensione dell'interconnessione in condizioni fisiopatologiche. Pertanto, è stata sviluppata una strategia basata su microscopia ad alto contenuto per la quantificazione simultanea dei livelli ROS intracellulari, del potenziale della membrana mitocondriale (ΔΨ m ) e della morfologia mitocondriale. Si basa su microscopia automatizzata a fluorescenza a larga scala e analisi delle immagini di cellule adesive viventi, coltivate in piastre a più pozzetti e staineD con le cellule-permeabili fluorescenti reporter molecole CM-H 2 DCFDA (ROS) e TMRM (ΔΨ m e morfologia mitocondriale). In contrasto con la fluorimetria o la cytometria a flusso, questa strategia consente di quantificare i parametri subcellulari a livello della singola cellula con elevata risoluzione spaziale, sia prima che dopo la stimolazione sperimentale. Importante, la natura basata sull'immagine del metodo consente di estrarre parametri morfologici oltre alle intensità del segnale. Il set di funzioni combinato viene utilizzato per l'analisi dei dati multivariata esplorativa e statistica per rilevare le differenze tra sottopopolazioni, tipi di cellule e / o trattamenti. Qui viene fornita una descrizione dettagliata del dosaggio, insieme ad un esperimento di esempio che dimostra il suo potenziale per una discriminazione inequivocabile tra stati cellulari dopo la perturbazione chimica.